《Oncol杂志》。2012; 2012: 680796.
全长丰富的c-DNA文库-清除细胞肾癌
国立台湾大学医学院生物化学与分子生物学研究所，台湾台北100号仁爱路一段1号
学术编辑：Matthew E.Hyndman
2011年9月6日收到；2011年11月22日接受。
版权©2012 S.-W.Tang和J.-Y.Lin版权所有。 这是一篇根据知识共享署名许可证发布的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制原始作品，前提是正确引用了原始作品。
摘要
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌中最常见的亚型，具有高转移潜能和对传统治疗的强烈抵抗力，导致患者五年生存率低。针对晚期肾癌的血管内皮生长因子（VEGF）通路的几种治疗方法已经开发出来，但仍需发现治疗肾癌的新靶点。全基因组基因表达分析已被广泛用于确定癌症进展的未知分子机制。最近，我们应用寡核苷酸方法构建了ccRCC和邻近正常肾脏的全长cDNA文库，并通过高通量测序分析了基因表达谱。本文就MYC通路和烟酰胺N-甲基转移酶治疗肾癌的潜力进行了综述。
1.简介
肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）占全球所有人类恶性肿瘤的3%，发病率不断上升，占肾癌的85%，每年导致近78000人死亡[1–5]. 最常见的亚型，透明细胞RCC（ccRCC），起源于近端小管上皮，大多是散在、单侧和单灶的[6]. RCC细胞对化疗、激素治疗和放射治疗等传统疗法的反应较差[7–10]. 这些特性导致RCC患者预后不良，五年生存率低。
手术仍是治疗肾细胞癌的主要方法[11]. 已经证明低氧诱导因子的激活-α（高频-α)开启VEGF和PDGF等基因，这些基因负责ccRCC的进展，为晚期ccRCC提供潜在靶点[12].
基因表达分析似乎是研究癌症发病机制和进展的重要工具。与肿瘤增殖、生长、血管生成和细胞粘附丧失相关的标记物已被评估为潜在的预后因素。许多报告使用高通量技术研究了正常组织和肿瘤组织之间的差异基因表达谱，包括cDNA微阵列、cDNA减影和基因表达的系列分析[13–15]. 许多研究应用这些方法来分析ccRCC的全基因组变化，提供特定的基因表达特征、潜在的生物标记物和预后因素[16–21]，而Lenburg等人通过先前发表的微阵列方法指出了不同的基因表达结果[22]. 最近，组织了两个国际项目，癌症基因组图谱（TCGA）和国际癌症基因组联盟（ICGC），为整合和比较独立研究小组确定的癌症基因组异常提供平台[23–25].
应用东京大学医学科学研究所铃木博士和铃野博士开发的寡核苷酸方法构建全长富集cDNA文库，用于分析基因转录起始位点[26,27]. Yamada等人利用寡核苷酸法探索肝母细胞瘤和相应正常肝脏的基因表达谱，并确定肝母细胞癌预后较差的指标[28]. 为了研究ccRCC中的差异表达基因，构建了ccRCC和正常肾组织的全长富集cDNA文库并进行了序列测定。我们鉴定了383个差异表达基因，并进一步证实了20个ccRCC相关基因的差异表达，这些基因在ccRCC中尚未被报道为失调。通过使用383个差异表达基因的功能网络分析，确定MYC通路在肿瘤疾病中被激活[29]. 通过使用MYC siRNA，进一步证明了MYC在ccRCC细胞中的重要性。
此外，烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）被鉴定为201个上调基因中的第九个，在ccRCC组织的全长cDNA富集文库中增加了65.2倍。我们发现，NNMT通过PI3K/AKT/SP1途径促进MMP-2表达，诱导细胞侵袭，表明NNMT是一种新的ccRCC侵袭相关基因。我们的结果阐明了NNMT在ccRCC中的新功能，并表明NNMT可以被视为ccRCC的潜在治疗靶点。
2.肾细胞癌和正常肾脏的基因表达谱
为了从ccRCC的两个组织（Ⅱ级/Ⅰ期；Ⅱ级/Ⅱ期）和相邻的正常肾脏构建全长富集cDNA文库，采用了铃木和铃木的寡聚方法。我们分别成功测序了19425和12400个ccRCC和正常肾脏cDNA文库的克隆。使用BLAST程序将测序结果爆破到NCBI的UniGene数据库中。得分大于200的blast结果表示为一个基因，在ccRCC和正常肾组织的全长富集cDNA文库中分别鉴定出4356和3055个基因。进一步比较ccRCC和正常肾脏的基因表达模式，以确定差异表达的基因。根据ccRCC中克隆数高于或低于正常肾脏克隆数三倍的基因被定义为ccRCC相关基因，共鉴定出201个上调和182个下调基因[30].
3.ccRCC-相关基因的细胞功能分类
根据NCBI中的基因本体（GO）术语，将ccRCC中差异表达的基因按其细胞功能分类[30]. 我们观察到许多代谢相关基因在ccRCC中差异表达，如NNMT、赖氨酰氧化酶、转谷氨酰胺酶2、血红素加氧酶1、精氨琥珀酸合成酶、乙醇脱氢酶6和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1，表明ccRCC细胞可能会失去其作为肾细胞的正常功能，代谢相关基因可能在癌症进展中起作用。此外，还发现了几个信号转导相关基因的差异表达，包括分泌型卷曲相关蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白3、G蛋白信号调节因子1和卷曲相关蛋白质，暗示与致癌过程相关的信号通路的激活。参与细胞增殖的基因也被发现是失调的。例如，转化生长因子（β诱导）、CD74抗原、α-2-糖蛋白1、抑制素、细胞周期蛋白D1和细胞分裂周期42都有差异表达。该结果可能支持ccRCC细胞的高增殖能力。有趣的是，我们还观察到作为细胞骨架组装、蛋白酶或蛋白酶抑制剂的基因的表达改变，如凝胶蛋白、MMP-2、组织蛋白酶S、激肽原1、α-1抗蛋白酶成员5和金属蛋白酶组织抑制剂3，提供了ccRCC细胞强大的侵袭活性。
4.新的ccRCC相关基因在ccRCC中的差异表达
通过Q-PCR分析进一步研究了ccRCC组织对中ccRCC相关基因的差异表达，这些基因在ccRCC中未被报道为失调基因(). 有趣的是，Wnt信号通路调节剂分泌型卷曲相关蛋白2和4的表达分别显著上调34.9倍和4.3倍。此外，发现解毒相关基因谷胱甘肽S-转移酶A3在ccRCC中显著下调，表明ccRCC组织中的氧化应激升高。富含半胱氨酸的分泌型蛋白酸（SPARC）的过度表达已在各种癌症中得到证实。以前的报告显示SPARC参与肿瘤的发展[31,32]在这项研究中，我们还观察到了SPARC在ccRCC中的表达上调，这表明SPARC在ccRCC中起着重要作用().
表1
| Unigene编号 | 基因符号 | 基因名称 | 位置 | 平均折叠变化 | 百分比（%） |
|---|
| 第481022页 | SFRP2系统 | 分泌卷曲相关蛋白2 | 第4季度31.3 | 34.9 | 50 |
| 高511883 | ZNF114型 | 锌指蛋白114 | 19季度13.33 | 9.2 | 32 |
| 沪164021 | CXCL6系列 | 趋化因子（C-X-C基序）配体6（粒细胞趋化蛋白2） | 第4季度21 | 5 | 39 |
| Hs.597524 | CDC42型 | 细胞分裂周期42（GTP结合蛋白，25kDa） | 第16.1页 | 6 | 48 |
| 高436367 | LAMA3型 | 层粘连蛋白，α3 | 18问题11.2 | 5.7 | 43 |
| 高128453 | FRZB公司 | 卷曲相关蛋白 | 2夸脱 | 6.2 | 61 |
| Hs.181301（上） | CTSS系统 | 组织蛋白酶 | 第1季度21 | 8.3 | 89 |
| 高416007 | SFRP4型 | 分泌卷曲相关蛋白4 | 第7页14.1 | 4.3 | 50 |
| 编号111779 | SPARC公司 | 分泌蛋白质，酸性，富含半胱氨酸（骨连结蛋白） | 第5季度31.3–第32季度 | 4.3 | 75 |
| Hs.77269 | GNAI2公司 | 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白），α抑制活性多肽2 | 第321页 | 3.4 | 50 |
| 高480653 | ANXA5公司 | 膜联蛋白A5 | 28至32季度第4季度 | 3.1 | 36 |
| 高168718 | 原子力显微镜 | 阿法明 | 11年第4季度至13年第4季度 | −1020.2 | 98 |
| Hs.102484号 | GSTA3号机组 | 谷胱甘肽S-转移酶A3 | 第62.1页 | −72.8 | 70 |
| 高.110675 | APOE公司 | 载脂蛋白E | 19问题13.2 | −6.4 | 61 |
| 高527971 | NES公司 | 内斯汀 | 第1季度23.1 | −6.3 | 48 |
| 学时9029 | KRT23公司 | 角蛋白23（组蛋白脱乙酰酶诱导） | 17季度21.2 | −5.5 | 50 |
| 高54415 | CSN3号机组 | 酪蛋白κ | 第4季度21.1 | −3.7 | 34 |
| 沪632294 | ZNF38型 | 锌指蛋白38 | 7季度22.1 | −2.3 | 41 |
| Hs.38996号 | CHCHD2公司 | 含2的螺旋-螺旋-螺旋结构域 | 第7页第1.2页 | −2.0 | 36 |
| 高458358 | TSPYL1型 | TSPY类1 | 第6季度22至第23季度 | −2.3 | 50 |
5.激活ccRCC中的MYC通路
为了确定ccRCC中解除调控的细胞路径，使用Ingenuity Pathway analysis对383个ccRCC相关基因进行了功能网络分析，该分析已用于确定几种肿瘤发生相关的重要路径[33,34]. ccRCC相关基因的列表被上传到Ingenuity系统，并用作产生生物网络的焦点基因。这个P（P）计算值以表示网络中的焦点基因随机一起发现的统计显著性。Ingenuity Pathway分析结果显示，17个网络具有统计显著性，包含10多个ccRCC相关基因。根据Ingenuity Pathways知识库，对每个网络的顶级生物功能进行了分配。得分最高的五个生物网络被发现在功能上与癌症进展有关，如细胞周期、细胞生长或细胞运动().
表2
ccRCC中383个差异表达基因的前5个功能网络。
| 1 |
ANXA1、ANXA2、ARL6IP1、BRD2、，CTSB、DBI、FBL、，HNRPU、LAMP2、LDHA、，LGMN、MAZ、，MIF、MYC、NAP1L1、NDRG1、NPM1（包括EG:4869）、PABPC1、，PCBP2，PGK1，PRDX1，PRMT1、，PTBP1、RBMS1、RPL7、RPL22、RPL26、RPL35、RPS3A、RPS4X、，序列3、SPP1、SUCLA2、TAGLN2、TMSB4X
| 55 | 35 | 蛋白质合成、细胞组装和组织、癌症 |
|---|
| 2 |
14-3-3,ALDOC、CCNB1、CCNE1、CD74、，COL1A2，CTSS、CXCR4、DYRK1A、，E3环，FBXO18， H3F3A（包括EG:3020）,组蛋白h3，
Hsp70、Hsp90、HSP90AB1、MAP3K2、，MGMT、，MLL、，NME1，NOS3、PGAM1、，PRMT5、，PTGES3（包括EG:10728），
RNA聚合酶II，
SAP18，集合，SKP1A，SMARCE1（包括EG:6605），SNRPD2、，ST13，TCEB2、VHL、，VIM、YWHAE
| 40 | 29 | 癌症、细胞周期、细胞损害 |
|
| 三 |
AGT公司,阿克特，
ANXA7，ATF6，BCL2、，CA2、，校准1，
钙调蛋白，
CANX公司，
Ck2，
CSF1R、DUSP1、EGFR、，EGR1、，ENPEP、GRB10、HSPD1、，KNG1（包括EG:3827），LGALS1、LGALS3、，长期贷款，
马普，
遇见，
MHC I级，P38 MAPK，
PIGR、PMP22、，
拉斯，
RTN4、，SNX4、SQSTM1、，SRI、，STAT1、，WT1、XBP1
| 37 | 28 | 细胞发育、细胞生长和增殖、结缔组织发育和功能 |
|
| 4 |
Ap1、，
ARF1、，ARFIP2、，ATF4、CCND1、CCND3、，
Creb、Cyclin D、，
DDX5、EID1，
纤维蛋白，
ID2、，IGF2，
Igfbp，IGFBP2，
IGFBP3，KLK5（包括EG:25818），
嗯，
MMP2、MMP7、，MMP24、PCK1、PCK2、，PCNA、，
派克，
PLG、，
Rb公司,RFC1，SERPINA1、SPARC、，SRA1（包括EG:10011）、TIMP3、，
维格夫，
VEGFA、，悉尼威立雅运输公司
| 33 | 26 | 癌症、细胞运动、生殖系统疾病 |
|
| 5 |
角度4，ASS1、，BNIP3L、ELA2、EREG，ESM1、，10层，GPX4、，HADHA、，哈德布，HGF、HIF1A、HNF4A、HSPA5、，IFITM3，IGF2，IGFBP3、LIPA、MET、MMP2、NOS3，NR2F1， PHC2、，
PKM2、，普劳尔，POGZ，RNF4，SLC16A4，SLC2A1、SP1、TERT、，TFPI2，TRPS1、，
维格夫，
VEGFA（血管内皮生长因子）
| 20 | 19 | 癌症、肿瘤形态、心血管系统发育和功能 |
有趣的是，得分最高的顶级功能网络由35个差异表达基因组成，并围绕癌基因MYC和一组MYC靶基因进行组装。MYC在多种人类肿瘤和癌相关基因表达调控中的关键作用已被证明[35]. 以前曾报道过ccRCC中MYC的上调或扩增[36–39]. 最近的报告显示HIF-2α促进MYC的转录活性，而HIF-1抑制MYC转录活性[40,41]. 我们利用Ingenuity Pathways知识库进一步确定了ccRCC中383个差异表达基因中的MYC转录靶点。标记为表达（E）、转录（T）或蛋白-DNA相互作用（PD）的与MYC相关的差异表达基因被视为MYC靶基因。如所示，37个差异表达基因被发现是MYC靶基因，表明MYC通路成员可能在ccRCC组织中被激活，表明MYC通路被激活，在ccRCC的癌变中起着重要作用。
ccRCC中的MYC和37个MYC靶基因。节点代表基因，其形状表示其功能类别。节点的颜色显示了ccRCC和正常肾组织之间差异表达基因的折叠变化（红色，上调基因；绿色，下调基因）。边缘标签和形状表示两个节点之间的生物关系。
此外，通过Q-PCR分析检测了44对ccRCC组织中MYC的上调表达。MYC在ccRCC组织中的平均表达水平显著高于正常肾组织。免疫组织化学染色分析结果还表明，25例慢性肾细胞癌组织中有24例（96%）MYC染色呈阳性，其中15例为3+染色，7例为2+染色，2例为1+染色，但非肿瘤性肾小管染色呈阴性。我们还检测了来源于ccRCC患者的786O、769P、A498、ACHN和Caki-1细胞中MYC的表达水平，结果表明，与5个正常组织相比，所有这些ccRCC细胞系都显示出明显的MYC上调。这些结果表明，MYC在ccRCC组织和细胞系中的表达显著增加[30].
为了研究MYC通路特征的表达是否因MYC激活而增强，MYC靶基因BCL2、CCND1、PCNA、PGK1和VEGFA的表达水平，这些基因已被报道与癌症进展具有功能相关[42,43]通过Q-PCR分析在44例ccRCC组织中进一步研究。如所示证明了这些MYC途径成员的显著上调。通过Pearson相关分析，我们观察到BCL2、CCND1、PCNA、PGK1和VEGFA的表达水平与慢性肾细胞癌肿瘤组织中MYC的水平相关(). 这些结果表明，MYC通路信号被激活，并与ccRCC组织中MYC上调相关。
表3
MYC靶基因在ccRCC及邻近正常组织中的表达水平。
| 基因名称 | 正常肾脏与ccRCC†(P（P）价值‡) | ccRCC组织MYC表达水平的相关系数(P（P）值）§
|
|---|
| 十亿立方厘米2 | −6.58±0.12与−3.84±0.17（<0.001） | 0.45 (0.002)* |
| CCND1号机组 | −4.45±0.14与−2.62±0.18（<0.001） | 0.31 (0.038)* |
| PCNA公司 | −5.78±0.14与−4.76±0.13（<0.001） | 0.33 (0.038)* |
| PGK1系列 | −3.40±0.18与−2.70±0.14（<0.001） | 0.42 (0.004)* |
| VEGFA（血管内皮生长因子） | −3.93±0.30与−1.23±0.21（<0.001） | 0.36 (0.016)* |
6.通过MYC siRNA抑制MYC靶基因的表达
我们已经证明了在ccRCC组织中MYC和MYC靶基因的表达水平之间的相关性(). 因此，我们研究了在ccRCC细胞中MYC表达的下调是否抑制了MYC靶基因的表达。Q-PCR分析结果显示，MYC特异性siRNA处理显著降低了769P细胞中MYC靶基因BCL2、CCND1、PGK1、PCNA和VEGFA的表达水平[30]. 已经证明MYC能够结合特定的DNA序列（E-box基序，CACGTG）作为转录因子发挥作用[31]. 因此，研究了MYC是否可以直接招募到这些MYC靶基因的启动子区域。BCL2、CCND1和PCNA启动子上的潜在E-box位点通过爆破序列CACGTG和BCL2，CCND1，和PCNA的潜在启动子区域来确定，并且使用Beacon Designer 4程序生成引物对来特异扩增包含潜在E-box位点的启动子区域。以前的研究已经描述了用于扩增PGK1和VEGFA启动子中E-box位点的引物。使用这些引物进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析，以扩增BCL2、CCND1、PCNA、PGK1和VEGFA启动子中潜在的MYC结合区域。观察到内源性MYC与BCL2、CCND1、PCNA、PGK1和VEGFA的启动子区结合[30]. 这些结果表明，MYC表达能够通过与ccRCC细胞中MYC靶基因的启动子结合来提高其表达水平。
先前的研究表明，MYC在细胞转化中发挥作用[29]. 为了探讨MYC的表达是否对ccRCC细胞的恶性能力是必需的，采用RNAi技术研究了在ccRCC细胞系、769P和Caki-1细胞中敲除MYC表达的影响。如所示MYC特异性siRNA以剂量依赖性方式显著抑制了769P和Caki-1细胞中MYC的表达水平。MTT检测结果显示，敲低MYC表达可显著降低769P和Caki-1细胞的增殖速率，且呈剂量依赖性(). 此外，如软琼脂试验所示，用20 nM MYC-特异性siRNA处理769P细胞和Caki-1细胞后，分别显著抑制了95%和91%的凤尾鱼非依赖性生长能力[30]. 这些结果表明，RNAi介导的MYC敲除强烈抑制ccRCC细胞的增殖和锚定非依赖性生长。
NNMT siRNA对ccRCC细胞MMP-2表达的影响。（a） MMP-2和NNMT在ccRCC细胞系中的表达水平。Q-PCR检测MMP-2和NNMT在ccRCC细胞系、796P、786O、Caki-2和Caki-1中的表达。GAPDH被用作内部控制。（b） 786O和Caki-1细胞转染40μ采用Q-PCR（上部）、明胶酶谱分析和western blot分析（下部）检测NNMT和MMP-2的表达水平。Q-PCR数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示**P（P）与对照细胞相比<0.001。肌动蛋白被用作加载控制。
研究表明，MYC促进癌细胞的细胞周期进展，从而增强各种恶性肿瘤中不受控制的细胞增殖[43]. 因此，我们进一步研究MYC表达下调是否具有阻止ccRCC细胞周期进展的能力。用PI染色和流式细胞仪分析经MYC-siRNA处理后769P细胞的细胞周期分布。结果表明，与对照细胞相比，MYC-siRNA转染细胞的G0/G1期细胞群显著增加。此外，在用MYC-特异性siRNA处理的769P细胞中，DNA合成过程（S期）中的细胞数量显著减少[30]. 这些结果表明，MYC表达的减少破坏了769P细胞的G1/S期转变。
7.NNMT在ccRCC组织中的过度表达
在通过对ccRCC全长cDNA文库的分析确定的这些差异表达基因中，NNMT是最上调的基因之一，其过表达量为65.2倍。先前的研究表明NNMT在ccRCC组织中过度表达，并有可能成为ccRCC的生物标记物[44,45]. 为了研究NNMT是否在ccRCC组织对中过度表达，采用Q-PCR分析检测这些组织对中NNMT的mRNA水平。结果显示，在33例慢性肾细胞癌肿瘤中，有27例的NNMT表达高度上调（T/N>3.0），与邻近正常肾组织相比，平均上调52.8倍(). Western blot分析结果还显示，ccRCC组织中NNMT蛋白水平显著增加(). 这些结果表明NNMT在ccRCC中过度表达，也有报道称NNMT在结直肠癌、甲状腺乳头状瘤癌和胃癌中过度表达[46–48].
NNMT在ccRCC组织中的过度表达。（a） Q-PCR分析测定33对ccRCC组织NNMT mRNA表达水平。表达水平用-ΔCt表示NNMT-TPT1型值。每个点代表一个组织样本，水平条显示平均值。P（P）值是使用学生的成对样本确定的t吨测试。（b） Western blot分析以确定10对ccRCC组织中NNMT蛋白的表达水平。N和T分别代表正常和肿瘤部位的裂解物。肌动蛋白被用作负载对照。
8.确定NNMT在ccRCC中的潜在作用
有趣的是，Wu等人最近证明，在膀胱癌中，NNMT与癌细胞迁移之间存在相关性[49]. 我们使用Q-PCR分析进一步研究了HEK293/NNMT细胞中与细胞侵袭性相关的基因的表达水平，发现NNMT过度表达会增强MMP-2的表达。如所示与HEK293/载体细胞相比，HEK293/NNMT细胞MMP-2的表达增加了4倍。明胶酶谱和western blot分析结果显示，HEK293/NNMT细胞中MMP-2蛋白水平显著升高(). 此外，通过处理NNMT基因特异的siRNA，NNMT的表达被显著抑制，并伴随着HEK293/NNMT细胞中MMP-2表达的降低().
NNMT过度表达对MMP-2表达的影响。（a） 通过Q-PCR测定HEK293/载体（对照）和HEK293/4NMT细胞中MMP-2 mRNA的表达水平，并将其归一化为GAPDH。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示**P（P）与对照细胞相比<0.001。（b） 明胶酶谱分析用于检测条件培养基中MMP-2的活性，western blot分析用于检测有或无NNMT表达的HEK293细胞裂解液中的MMP-2和NNMT。（c） HEK293/载体和HEK293/4NMT细胞转染40μ用Q-PCR（上部）明胶酶谱和Western blot分析（下部）测定NNMT和MMP-2的表达水平。Q-PCR数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示**P（P）与对照细胞相比<0.001。肌动蛋白被用作负荷控制。
进一步研究沉默的NNMT表达对ccRCC细胞系中MMP-2表达的影响。表明786O和Caki-1细胞（侵袭性ccRCC细胞系）的NNMT和MMP-2表达高于769P和Caki-2细胞（原代ccRCC肿瘤细胞系）。siRNA处理结果表明，NNMT表达的下调导致786O和Caki-1细胞MMP-2表达的抑制(). 这些结果表明，NNMT的表达与MMP-2的表达有关。
此外，我们还检测了NNMT和MMP-2在ccRCC组织中的表达是否相关，结果表明，基于使用皮尔逊相关法(第页= 0.47). 免疫组织化学分析结果还表明，76%的ccRCC组织中NNMT过度表达，而58%的ccRCC组织中MMP-2表达上调。通过分析皮尔逊在ccRCC组织中观察到NNMT和MMP-2的表达与chi-square检验显著相关()中显示了具有代表性的案例这些结果表明NNMT和MMP-2在ccRCC组织中的表达是相关的。
肾细胞癌组织中NNMT和MMP-2表达水平的相关性。（a） 用−ΔCt值点缀33例ccRCC组织中NNMT和MMP-2的表达水平，并用皮尔逊相关法(第页= 0.47,P（P）< 0.01). （b） 采用免疫组织化学方法检测ccRCC组织切片中的NNMT和MMP-2。显示了NNMT和MMP-2免疫染色阳性（病例1）或阴性（病例2）的代表性病例。箭头表示NNMT和MMP-2的细胞质免疫染色。照片是在放大100倍的条件下拍摄的。
9.PI3K/AKT/SP1通路参与NNMT介导的MMP-2表达
为了确定哪种信号通路可能参与NNMT诱导的MMP-2表达，信号通路抑制剂HEK293/NNMT细胞被信号通路抑制剂LY294002（PI3K）、PD98059（ERK1/2）、SB203580（p38）和SP600125（JNK）处理，然后进行荧光素酶报告子检测全长MMP-2启动子的转录活性。结果表明，LY294002（而非SB203580、PD98059和SP600125）显著抑制HEK293/NNMT细胞MMP-2启动子活性(). 此外，经LY294002和AKT抑制剂IV治疗后，HEK293/NNMT、786O和Caki-1细胞中MMP-2的表达水平显著降低()表明PI3K/AKT通路对NNMT介导的MMP-2表达的重要性。
信号通路参与NNMT介导的MMP-2表达。（a） 采用多种信号通路抑制剂治疗转染全长MMP-2启动子质粒和对照报告质粒的HEK293/NNMT细胞。采用荧光素酶报告法测定MMP-2启动子活性。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示**P（P）与未经处理的HEK293/NNMT细胞相比，<0.001。（b） 用LY294002或AKT抑制剂IV处理HEK293/NNMT、786O和Caki-1细胞18 h，Q-PCR检测MMP-2的表达。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示*P（P）< 0.05; **P（P）与未经处理的细胞相比，<0.001。
为了研究MMP-2启动子对NNMT介导的MMP-2表达反应的关键区域，将含有MMP-2基因上游区域（WT）和一系列连续5′缺失（D1至D7结构）的1716kb基因组片段克隆到pGL3荧光素酶报告载体中[50]. 将pGL3-MMP-2启动子质粒和pGL3对照报告质粒转染到细胞中，并使用荧光素酶报告基因测定法检测启动子活性。如所示HEK293/NNMT细胞中全长MMP-2启动子的转录活性比对照细胞中的转录活性增加了2倍。此外，与HEK293/NNMT细胞中全长MMP-2启动子的转录活性相比，D6和D7突变体的转录活性下降了约4倍，而D1-D5突变体的则没有下降。这表明MMP-2启动子中的SP1结合元件是NNMT介导的MMP-2表达所必需的。通过使用带有突变SP1结合元件（bp−94至−64）的MMP-2启动子构建物，进一步检查SP1结合元素的重要性。荧光素酶报告子分析结果显示，SP1结合元件的突变导致HEK293/NNMT细胞MMP-2启动子活性降低4倍(). 这些结果表明，MMP-2启动子的SP1结合区在NNMT介导的MMP-2表达中起着关键作用。为了研究SP1在NNMT介导的MMP-2表达中是否起作用，我们使用了SP1基因特异的siRNA。如中所示，通过在HEK293/NNMT，786O中处理SP1 siRNA，MMP-2的表达显著降低。和Caki-1细胞。此外，已经证明可以阻止SP1与基因启动子结合的米特拉霉素[51]，用于抑制SP1转录活性。结果表明，米特拉霉素处理明显抑制了HEK293/NNMT、786O和Caki-1细胞中MMP-2的表达(). 这表明SP1是NNMT激活的MMP-2表达的重要因素。
SP1结合元件在MMP-2转录活性中的作用。（a） MMP-2启动子（D1–D7）全长或各种缺失突变体的报告结构图如左边实线是在pGL3荧光素酶报告载体中荧光素素酶基因上游克隆的区域。采用荧光素酶报告法分析细胞提取物的荧光素素酶活性。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示**P（P）与转染全长MMP-2启动子的HEK293/NNMT细胞相比，<0.001。（b） 通过荧光素酶报告子分析检测两个假定的SP1结合位点的位点特异性突变对MMP-2启动子活性的影响。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示**P（P）与转染野生型D3构建物的HEK293/NNMT细胞相比，<0.001。
SP1在NNMT诱导MMP-2表达中的重要性。（a） SP1 siRNA对MMP-2和SP1表达的影响。细胞转染40μ用SP1 siRNA或对照siRNA的mol/L，Q-PCR检测NNMT和MMP-2的表达水平。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示*P（P）< 0.05; **P（P）与对照细胞相比<0.001。（b） SP1抑制剂米特拉霉素对MMP-2表达的影响。用12.5或25nmol/L的米特拉霉素处理细胞18h，用Q-PCR检测MMP-2的表达水平。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示*P（P）< 0.05; **P（P）与对照细胞相比<0.001。
此外，通过CHIP分析研究PI3K/AKT通路在SP1结合MMP-2启动子中的作用。结果表明，与HEK293/载体细胞相比，HEK293/NNMT细胞中SP1与MMP-2启动子SP1结合元件的相关性增加了2.9倍(). 用LY294002或AKT抑制剂IV治疗可显著降低HEK293/NNMT细胞中SP1和MMP-2启动子的相关性(). 这些结果强烈暗示PI3K/AKT/SP1通路参与了NNMT表达诱导的MMP-2启动子激活。
PI3K/AKT通路在SP1与MMP-2启动子结合中的作用。HEK293/NNMT细胞接受或不接受5μLY294002或1的摩尔/升μ用CHIP法测定AKT抑制剂IV作用18小时后，SP1与MMP-2启动子SP1结合元件的相关性。兔IgG作为阴性对照，4%输入作为阳性对照。
10.MMP-2参与NNMT介导的细胞侵袭
通过基质凝胶侵袭实验研究NNMT介导的MMP-2表达是否引起细胞侵袭。作为结果表明，HEK293/NNMT细胞的侵袭活性高于HEK292/载体细胞。为了研究MMP-2在NNMT介导的细胞侵袭中的作用，应用MMP-2中和抗体或MMP-2抑制剂（OA-Hy）阻断MMP-2的活性。基质凝胶侵袭实验结果表明，抑制MMP-2活性可显著抑制HEK293/NNMT细胞的侵袭活性(). 此外，还研究了NNMT siRNA对ccRCC细胞株侵袭性的影响。结果表明，NNMT siRNA处理可使786O和Caki-1细胞的侵袭活性降低约70%(). 此外，通过MMP-2活性蛋白的治疗，NNMT siRNA抑制的侵袭性得以恢复(). 这些结果表明，MMP-2活性是NNMT过度表达细胞侵袭性所必需的。
NNMT通过MMP-2增强细胞侵袭性。（a） 采用Matrigel侵袭试验分析侵袭活性。将HEK293/载体和HEK293/4NMT细胞接种到基质涂层室中，并在37°C下培养24 h。（b）检测MMP-2中和抗体或MMP-2抑制剂OA-Hy对HEK293/NNMT细胞侵袭活性的影响。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示*P（P）< 0.05; **P（P）与未经处理的HEK293/NNMT细胞相比，<0.001。（c） 786O和Caki-1细胞转染40μmol/L的NNMT siRNA孵育24小时，然后在基质凝胶包被的室中与或不与20ng的MMP-2蛋白一起孵育24小时。所提供的数据是重复三次的平均值。S.D.用误差线表示**P（P）与对照细胞相比<0.001。
11.NNMT shRNA对NOD-SCID小鼠ccRCC细胞肿瘤生长和转移的影响
通过NOD-SCID小鼠实验研究了NNMT表达降低是否抑制ccRCC细胞的肿瘤生长和转移。用含NNMT或荧光素酶shRNA的慢病毒感染786O细胞后，用嘌呤霉素筛选产生稳定表达NNMT或萤光素酶shRNA的细胞。western blot分析表明，NNMT shRNA显著抑制786O中约90%的NNMT和70%的MMP-2表达(). 786O/NNMT shRNA的侵袭活性降低至786O/对照shRNA的25%(). 通过皮下注射到NOD-SCID小鼠的后肢，786O/NNMT shRNA细胞比NOD-SCID小鼠中的786O/荧光素酶shRNA细胞产生更少的肿瘤质量(). 通过静脉注射NOD-SCID小鼠尾侧静脉，进一步研究了有或无NNMT敲除的786O细胞的肺转移活性。如所示与对照shRNA相比，NNMT shRNA显著抑制786O细胞的肺转移90%。这些结果表明，沉默的NNMT表达抑制ccRCC细胞的肿瘤生长和肺转移。
NNMT shRNA对NOD-SCID小鼠ccRCC细胞生长和肺转移的影响。采用Western blot分析（a）和基质凝胶侵袭试验（b）检测786O/NNMT shRNA和786O/对照shRNA细胞的NNMT和MMP-2表达及侵袭活性。肌动蛋白被用作负荷控制。（c） 4×106将786O/NNMT shRNA或786O/荧光素酶shRNA细胞皮下注射到NOD-SCID小鼠后肢(n个= 6). 每三天测量一次肿瘤体积。数据表示为三次重复的平均值。S.D.用误差线表示**P（P）与对照细胞相比<0.001。（d） 1×106200个单元格中的μ将L无血清DMEM培养基静脉注射到NOD-SCID小鼠的尾侧静脉(n个= 6). 注射6周后，处死小鼠，计数肺转移结节。数据表示为平均值±SD*P（P）与对照细胞相比<0.05。
12.结论
基因表达谱是研究多因素疾病和识别潜在生物标志物作为肿瘤化疗靶基因的重要方法之一。我们应用全长富集cDNA方法构建了第一个ccRCC和正常肾组织的全长富集cNA文库。本方法的优点是：（1）与微阵列相比，可以更精确地获得上调或下调基因的数量；（2）通过全长富集cDNA文库的测序，可以识别点突变、插入或删除以及SNP位点等突变。
确认
本研究由台湾国家科学委员会NSC-94-2752-D-002-010-PAE资助。
工具书类
1Pantuck AJ、Zisman A、Belldegrun AS。肾细胞癌自然史的变化。泌尿外科学杂志.2001;166(5):1611–1623.[公共医学][谷歌学者] 2Russo P.肾细胞癌：表现、分期和外科治疗。肿瘤学研讨会.2000;27(2):160–176.[公共医学][谷歌学者] 三。巴甫洛维奇CP，施密特LS。寻找肾细胞癌的遗传原因。《自然》杂志评论癌症.2004;4(5):381–393.[公共医学][谷歌学者] 4Bui MH、Zisman A、Pantuck AJ、Han KR、Wieder J、Belldegrun AS。肾细胞癌的预后因素和分子标记物。抗癌治疗专家综述.2001;1(4):565–575.[公共医学][谷歌学者] 5.Méjean A，Oudard S，Thiounn N。肾细胞癌的预后因素。泌尿外科学杂志.2003;169(3):821–827.[公共医学][谷歌学者] 6Cohen HT，McGovern FJ。肾细胞癌。《新英格兰医学杂志》.2005;353(23):2477–2490.[公共医学][谷歌学者] 7Amato RJ。肾细胞癌的化疗。肿瘤研讨会.2000;27(2):177–186.[公共医学][谷歌学者] 8Lane BR、Rini BI、Novick AC、Campbell SC。肾癌靶向分子治疗。泌尿科.2007;69(1):3–10.[公共医学][谷歌学者] 9.范·斯普伦森DJ、de Weijer KJM、Mulders PFA、de Mulder PHM。肾透明细胞转移癌的新治疗策略。抗癌药物.2005;16(7):709–717.[公共医学][谷歌学者] 10Ishimura T、Sakai I、Hara I、Eto H、Miyake H。肾细胞癌显微静脉浸润是根治术后复发的预测因素。国际泌尿科杂志.2004;11(5):264–268.[公共医学][谷歌学者] 11Crispen PL，Boorjian SA，Lohse CM，Leibovich BC，Kwon ED.预测局部肾细胞癌肾切除术后疾病进展：预后模型和分子生物标记物的应用。癌症.2008;113(3):450–460. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Klatte T、Seligson DB、Riggs SB等，缺氧诱导因子1α肾透明细胞癌。临床癌症研究.2007;13(24):7388–7393.[公共医学][谷歌学者] 13Hirota E，Yan L，Tsunoda T，等。肾透明细胞癌的全基因组基因表达谱：肾细胞癌治疗的分子靶点识别。国际肿瘤学杂志.2006;29(4):799–827.[公共医学][谷歌学者] 14Amatschek S、Koenig U、Auer H等。使用cDNA减影和微阵列确定肿瘤特异性基因的组织表达谱。癌症研究.2004;64(3):844–856.[公共医学][谷歌学者] 15Caldwell MC、Hough C、Fürer S、Linehan WM、Morin PJ、Gorospe M。肾癌细胞基因表达的系列分析揭示了VHL依赖性对TNF的敏感性α细胞毒性。癌基因.2002;21(6):929–936.[公共医学][谷歌学者] 16Sanjmyatav J、Steiner T、Wunderlich H、Diegmann J、Gajda M、Junker K。明确细胞肾细胞癌转移潜能的特异性基因表达特征。泌尿外科学杂志.2011;186(1):289–294.[公共医学][谷歌学者] 17.Yao M，Huang Y，Shioi K，等。预测透明细胞肾癌临床预后的三基因表达特征模型。国际癌症杂志.2008;123(5):1126–1132.[公共医学][谷歌学者] 18Dall’Oglio MF、Coelho RF、Leite KRM、Sousa-Canavez JM、Oliveira PSL、Srougi M.肾癌透明细胞型的基因表达谱。国际巴西泌尿学杂志.2010;36(4):410–418.[公共医学][谷歌学者] 19.Brannon AR、Reddy A、Seiler M等。通过一致性聚类对肾透明细胞癌进行分子分层，揭示了不同的亚型和生存模式。基因与癌症.2010;1(2):152–163. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Maruschke M，Reuter D，Koczan D，Hakenberg OW，Thiesen H-J。利用基因集富集分析进行生物统计管理的透明细胞肾细胞癌基因表达分析。英国国际泌尿学杂志.2011;108（2） ：E29–E35。[公共医学][谷歌学者] 21Takahashi M、Teh BT、Kanayama HO。通过基因表达谱分析阐明肾细胞癌的分子特征。医学调查杂志.2006;53(1-2):9–19.[公共医学][谷歌学者] 22Lenburg ME、Liou LS、Gerry NP、Frampton GM、Cohen HT、Christman MF。通过微阵列数据的参数分析确定的肾细胞癌基因表达的先前未知变化。BMC癌症.2003;第31条第3款 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23癌症基因组图谱研究网络。全面的基因组特征定义了人类胶质母细胞瘤基因和核心途径。自然.2008;455(7216):1061–1068. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Zhang J、Baran J、Cros A等。国际癌症基因组联盟数据门户——癌症基因组数据的一站式服务。数据库.2011;2011文章ID bar026。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Suzuki Y，Sugano S.使用寡核苷酸方法构建全长富集和5'末端富集的cDNA文库。分子生物学方法.2003;221:73–91.[公共医学][谷歌学者] 27Suzuki Y、Yoshitomo-Nakagawa K、Maruyama K、Suyama A、Sugano S。全长富集和5'末端富集cDNA文库的构建和表征。基因.1997;200(1-2):149–156.[公共医学][谷歌学者] 28.Yamada S，Ohira M，Horie H，等。肝母细胞瘤和相应正常肝脏之间的表达谱分析和差异筛查：PLK1癌基因高表达作为肝母细胞癌预后不良指标的鉴定。癌基因.2004;23(35):5901–5911.[公共医学][谷歌学者] 29Nesbit CE、Tersak JM、Prochownik EV。MYC致癌基因和人类肿瘤疾病。癌基因.1999;18(19):3004–3016.[公共医学][谷歌学者] 30唐世伟，张文华，苏永春，等。MYC通路在透明细胞肾细胞癌中被激活，对透明细胞肾癌细胞的增殖至关重要。癌症信件.2009;273(1):35–43.[公共医学][谷歌学者] 31Watkins G、Douglas-Jones A、Bryce R、Mansel RE、Jiang WG。人类乳腺癌组织中SPARC（骨连接蛋白）水平升高及其与临床结果的关系。前列腺素、白三烯和必需脂肪酸.2005;72(4):267–272.[公共医学][谷歌学者] 32Shi Q，Bao S，Song L，等。靶向SPARC表达可降低与FAK和ILK激酶活性降低相关的胶质瘤细胞存活和侵袭。癌基因.2007;26(28):4084–4094.[公共医学][谷歌学者] 33Bredel M，Bredel C，Juric D等。功能网络分析揭示了人类胶质瘤中扩展的胶质瘤通路图和三种新的MYC相互作用基因。癌症研究.2005;65(19):8679–8689.[公共医学][谷歌学者] 34Lee JS，Heo J，Libbrecht L，et al.来源于肝祖细胞的人类肝细胞癌的一种新的预后亚型。自然医学.2006;12(4):410–416.[公共医学][谷歌学者] 35Patel JH、Loboda AP、Show MK、Show LC、McMahon SB。基因组靶点分析揭示了MYC的复杂功能。《自然》杂志评论癌症.2004;4(7):562–568.[公共医学][谷歌学者] 36.Drabkin HA，Bradley C，Hart I，Bleskan J，Li FP，Patterson D.与t（3；8）（p14.2；q24.13）染色体易位相关的遗传性肾细胞癌中C-myc的易位。美国国家科学院院刊.1985;82(20):6980–6984. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37范勇，刘忠，方X，等。正常和恶性肾组织端粒酶逆转录酶mRNA全长表达和端粒酶活性的差异。临床癌症研究.2005;11(12):4331–4337.[公共医学][谷歌学者] 38Kozma L，Kiss I，Nagy A，Szakáll S，Ember I.肾透明细胞腺癌中c-myc和K-ras扩增的研究。癌症信件.1997;111(1-2):127–131.[公共医学][谷歌学者] 39Vita M，Henriksson M.Myc癌蛋白作为人类癌症的治疗靶点。癌症生物学研讨会.2006;16(4):318–330.[公共医学][谷歌学者] 40Gordan JD、Bertout JA、Hu CJ、Diehl JA和Simon MC。HIF-2α通过增强c-myc转录活性促进缺氧细胞增殖。癌细胞.2007;11(4):335–347. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Zhang H，Gao P，Fukuda R，等。HIF-1通过抑制C-MYC活性，抑制VHL缺陷肾细胞癌的线粒体生物发生和细胞呼吸。癌细胞.2007;11(5):407–420.[公共医学][谷歌学者] 42Arvanitis C，Felsher DW公司。条件转基因模型定义了MYC如何启动和维持肿瘤发生。癌症生物学研讨会.2006;16(4):313–317.[公共医学][谷歌学者] 43de Nigris F、Sica V、Herrmann J等，《c-Myc癌蛋白：细胞周期相关事件和癌症和心血管疾病的新治疗挑战》。细胞周期.2003;2(4):325–328.[公共医学][谷歌学者] 44Yao M，Tabuchi H，Nagashima Y，等。肾癌的基因表达分析：脂肪分化相关蛋白作为透明细胞肾癌的潜在诊断和预后生物标志物。病理学杂志.2005;205(3):377–387.[公共医学][谷歌学者] 45.Sartini D，Muzzonigro G，Milanese G，Pierella F，Rossi V，Emanuelli M。烟酰胺N-甲基转移酶作为肾透明细胞癌新肿瘤标记物的鉴定。泌尿外科学杂志.2006;176(5):2248–2254.[公共医学][谷歌学者] 46Roessler M，Rollinger W，Palme S，等。烟酰胺N-甲基转移酶作为结直肠癌新血清肿瘤标记物的鉴定。临床癌症研究.2005;11(18):6550–6557.[公共医学][谷歌学者] 47徐杰，莫阿泰德·F，考德威尔JS，等。人乳头状甲状腺癌细胞烟酰胺N-甲基转移酶的表达增强。临床内分泌与代谢杂志.2003;88(10):4990–4996.[公共医学][谷歌学者] 48Lim BH、Cho BI、Kim YN、Kim JW、Park ST、Lee CW。胃癌组织中烟酰胺N-甲基转移酶的过度表达及其潜在的翻译后修饰。实验与分子医学.2006;38(5):455–465.[公共医学][谷歌学者] 49Wu Y，Siadaty MS，Berens ME，Hampton GM，Theodorescu D.人类膀胱癌细胞迁移和肿瘤侵袭的重叠基因表达谱确定金属硫蛋白1E和烟酰胺N-甲基转移酶是细胞迁移的新调节因子。癌基因.2008;27(52):6679–6689. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 50唐世伟，杨天聪，林文华，等。烟酰胺N-甲基转移酶通过激活肾透明细胞癌细胞中基质金属蛋白酶-2的表达诱导细胞侵袭。致癌作用.2011;32(2):138–145.[公共医学][谷歌学者] 51Lee TJ，Jung EM，Lee JT，等。密特拉霉素A通过下调XIAP基因启动子通过Sp1位点使癌细胞对TRAIL介导的凋亡敏感。分子癌症治疗学.2006;5(11):2737–2746.[公共医学][谷歌学者] 
