继发性急性髓细胞白血病的克隆构筑

摘要

骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic Syndromes）是一组以造血功能低下为特征的异质性疾病，是成人获得性骨髓衰竭的最常见原因。¹大约三分之一的骨髓增生异常综合征患者发生继发性急性髓细胞白血病（AML）。²骨髓增生异常综合征和继发性AML之间的临床区别目前主要取决于细胞形态学分析，因为骨髓增生异常综合症患者的骨髓增生异常造血和成髓细胞计数小于20%，而成髓细胞数为20%或更多的患者的AML。尽管这两种疾病的细胞遗传学和分子损伤谱之间存在相当大的重叠，但患者、保险公司和资助机构仍不确定骨髓增生异常综合征是否真的是癌症。^三

在上皮组织（例如结肠和口咽）中广泛研究了细胞异型增生向癌症发展的遗传事件，^4–6但对骨髓增生异常综合征向继发性AML的遗传进展知之甚少。候选基因重测序已经确定了几个在骨髓增生异常综合征向继发性AML演变过程中具有复发突变的基因（例如。，FLT3、NPM1、RUNX1、TP53、，和美国国家科学院),^7–15但我们对该病突变总数和克隆分布的了解有限。我们使用全基因组测序来发现从7名继发性AML患者的骨髓样本中的体细胞突变，并确定在先前的骨髓增生异常综合征阶段获得的配对样本中是否存在这些突变。我们利用这些信息来确定骨髓增生异常综合征诊断和继发性AML进展时克隆细胞和遗传结构的比例。

方法

方法在补充附录，可在NEJM.org获取本文全文。简而言之，骨髓活检标本取自七名受试者，所有受试者均以包含授权全基因组测序的特定语言的形式提供了书面知情同意书。通过细胞分选富集成髓细胞。在Illumina HiSeq 2000和Genome Analyzer IIx上对骨髓样本（用于继发性AML）和正常皮肤样本的配对DNA文库进行测序。如前所述，对对齐读取进行分析以检测假定的体细胞突变。¹⁶使用固相捕获，然后对皮肤、骨髓增生异常综合征和继发性AML样本进行深度测序，验证体细胞突变预测。此前曾报道过一名受试者（UPN266395）的突变。¹⁷如前所述，对DNA拷贝数和基因表达进行了基于阵列的分析。¹⁸序列和微阵列数据已保存在国家生物技术信息中心的基因型和表型（dbGaP）数据库中（登录号：phs000159.v3.p2）。

结果

骨髓增生综合征和继发性AML的克隆性

骨髓增生异常综合征的临床病理诊断需要在骨髓中发现少于20%的成髓细胞（形态学上定义的恶性细胞）。然而，来自单核苷酸多态性（SNP）阵列和单基因重测序研究的数据表明，骨髓增生异常综合征中的克隆细胞群可能大于20%。^18,25,26在本研究中，我们使用捕获测序数据来准确测量骨髓增生异常综合征样本中克隆细胞的患病率。我们计算了所有经验证的体细胞SNV的突变等位基因频率（根据染色体拷贝数进行调整），并进行了无监督聚类分析，以确定突变簇。²⁷每个骨髓增生异常综合征和第二-AML基因组都包含一个细胞的创始克隆，定义为突变簇（包含182到660个体细胞SNV），该簇在骨髓增生异常综合症和第二AML期（第1簇在图1A、和补充附录中的图5). 我们估计最大肿瘤克隆性是建立克隆的平均突变等位基因频率的两倍（因为所有突变在拷贝数校正后每二倍体基因组出现一次）。在所有病例中，骨髓增生异常综合征样本中的大多数未分化骨髓细胞（高达92.7%）是克隆的，与二期AML样本中的细胞无法区分，即使成髓细胞计数小于5%(图1B). 尽管这些结果证实了先前的观察结果，即成髓细胞计数可以低估骨髓增生异常综合征中克隆群体的大小，^18,25,26他们还表明，当对整个基因组进行突变检测时，克隆性造血涉及大部分骨髓，即使在早期骨髓增生异常综合征中也是常见的规律。

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图1

骨髓增生异常综合征（MDS）和继发性急性髓细胞白血病（sAML）基因的寡克隆性

在A组中，受试者UPN461282中所有经验证突变的等位基因频率显示在MDS阶段和进展为sAML后。根据染色体拷贝数调整突变等位基因频率。个体突变的无监督聚类确定了五个不同的突变簇。B组显示MDS和sAML的总骨髓克隆性（包含创始突变的细胞比例）相似（P=0.57），尽管成髓细胞计数在0到69%之间。在C组中，支持拷贝数改变区域中保留的（A）等位基因的读取频率如MDS和sAML所示。含有两簇克隆拷贝数变化的细胞在MDS和sAML（黄色和橙色数据点）之间数量增加，而含有远端5（q）缺失的子克隆在从MDS到sAML的过程中丢失（蓝色数据点）。创始克隆包含del（17）、del（20q）和簇1单核苷酸变体（SNV）（面板A和C中的黄色数据点），而子克隆也包含del、单体17和簇2 SNV（面板A与C中的橙色数据点）。虚线表示不在缺失片段中的杂合SNPs的预期A等位基因频率。面板D显示MDS和sAML是寡克隆的，MDS中平均有2.4个克隆，sAML中平均有3.1个克隆（P=0.047）。缩写del（17）表示端粒17号染色体缺失，del（20q）表示del（20）（q11.21q13.13），del。

为了评估拷贝数改变的克隆性，我们根据SNP阵列和全基因组测序数据，设计了捕获探针，跨越皮肤样本中存在的杂合SNP，并在骨髓样本中删除或保留这些杂合SNPs(补充附录中的表4). 我们测定了骨髓增生异常综合征和继发性AML样本中保留的皮肤样本中包含等位基因的读取计数比例。皮肤样本中保留等位基因的患病率约为50%，正如杂合子SNPs所预期的那样。骨髓增生异常综合征和继发性AML样本中这些等位基因的流行率从50%开始偏离，并且与缺失细胞的百分比成比例(补充附录中的表5). 关于拷贝数改变的数据聚类在很大程度上概括了这些受试者的SNV聚类(图1C、和补充附录中的图7). 然而，这两种方法都鉴定出了独特的克隆（即，由其包含的突变簇定义的独特细胞群体），表明这些类型的数据提供了克隆进化的补充观点。我们的方法没有捕捉到DNA甲基化的变化，这种变化存在于骨髓增生异常综合征基因组中，²⁸这表明可能存在我们尚未检测到的其他克隆复杂性层。

所有7个样本在第二-AML期均为寡克隆，在骨髓增生异常综合征期仅2例为单克隆(图1D). 在第一个受试者（UPN461282）中，我们确定了五个不同的突变簇，它们共同定义了该肿瘤的克隆遗传进展(图1A). 骨髓增生异常综合征样本中存在两个克隆。克隆2中包含簇1和簇2突变的单个细胞向前移动，通过获取簇3、簇4和簇5突变生成了三个新克隆，这些克隆仅存在于第二个AML样本中。总的来说，数据表明该肿瘤的进化是从具有簇1突变的细胞到包含簇1到簇5突变的细胞依次进行的，每个新克隆都携带了所有先前存在的致病性和非致病性突变(图2A). 其他六个肿瘤也符合克隆进化的线性模型(补充附录中的图5)尽管在某些情况下，单细胞水平的分析可能会揭示出更复杂的模式。

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图2

骨髓增生异常综合征（MDS）到继发性急性髓细胞白血病（sAML）的克隆进展

面板A显示了一个模型，总结了受试者UPN461282从MDS阶段到sAML阶段的克隆进化。克隆1中的细胞包含簇1突变。克隆1（黄色）的特征是323个体细胞单核苷酸变体（SNV），其存在于约74%的骨髓细胞中。克隆2中的细胞（橙色）起源于克隆1中的单个细胞（因为所有簇1突变都是杂合的，并且几乎存在于所有sAML细胞中），因此包含所有簇1和簇2突变。该克隆在sAML样本中占主导地位，在该样本中，随后的三个亚克隆通过SNV的连续采集进化而来。出现的最后一个克隆（包含sAML中14%的骨髓细胞）可能包含SNV簇1至5或仅包含簇1、2、3和5，但分析方法无法区分这些可能性。B组显示了所有七名受试者从MDS到sAML突变簇大小的动态变化。每个簇至少包含一个第1层突变。在建立克隆和子克隆中检测到重复突变的基因。UPN表示唯一的患者编号。

第二代AML基因组包含304到872个体细胞SNV(补充附录中的表2). 这些突变很可能与疾病的发病机制无关。与这一概念相一致的是，每个基因组层的体细胞SNV数量往往与层大小成比例（正如偶然发生的那样），这表明绝大多数突变是随机背景突变(补充附录中的图3A). 我们观察到，每一个继发性AML样本中的大多数突变都存在于配对骨髓增生异常综合征样本中，并且存在一个子集的继发性ATML特异性突变。正如预期的那样，四名快速进展为继发性AML（<6个月）的受试者的继发-AML特异性突变比例低于进展较慢的三名受试者（>20个月）。在进展迅速的受试者中，平均6.7%的突变是继发性AML特异性的，而在进展缓慢的受试者中，37.8%的继发性AML特异性突变是特异性的（P<0.05）(补充附录中的图3B). 7名受试者骨髓增生异常综合征创始克隆中的转换和颠倒突变谱相似(补充附录中的图4). 最常见的替代是C·G→T·a转变，如其他癌症基因组中所见。^29,30两名受试者（诊断为骨髓增生异常综合征后，在发展为继发性AML之前，使用地西他滨治疗4至11个月）的继发性-AML特异性C→二次AML样本中的G颠换，而两名未使用去甲氧基他滨治疗的受试者没有出现类似的增加(补充附录中的图4). 我们无法确定这些颠倒的序列特异性上下文。

尽管在每个阶段驱动克隆生长的突变尚不清楚，但七个骨髓增生异常综合征样本中的创始克隆（包含182到660个突变）仍然存在于所有七个二级AML样本中，并且至少包含一个1级突变。在二级AML特异性簇的生成过程中，发现的克隆获得了至少一个新的第1层突变，并预测了翻译结果(补充附录中的图5). 在发现的克隆和子克隆中都检测到重复突变的基因(图2B).

讨论

通过下一代测序，我们发现骨髓增生异常综合征和继发性AML样本中的肿瘤骨髓细胞比例无法区分，这表明骨髓增生异常综合症与继发性急性髓性白血病一样具有克隆性，即使成髓细胞计数为零。虽然克隆性不足以定义恶性转化，但它是大多数人类癌症的主要表现，我们的研究结果表明骨髓增生异常综合征和继发性AML都是高度克隆性血液肿瘤。³¹通过对同一受试者在发展为继发性AML前后样本中突变细胞比例的分析，我们可以比较克隆结构和突变基因，以了解这些疾病的遗传学。突变簇的稳健检测是可能的，因为每个基因组有数百个突变是通过全基因组测序确定的，而等位基因负担是通过在两个时间点进行深度重测序来量化的。如果我们只分析了二级AML样本或仅分析了第1层（即外源性）变异体，则无法阐明这种复杂性。在所有七名受试者的样本中，第二代AML基因组是寡克隆的。先前存在的骨髓增生异常综合征创始克隆在继发性AML中始终持续存在，尽管在某些情况下，它被子克隆所竞争。随着每一组新突变的获得，所有先前存在的突变都会继续进行，从而产生在进化过程中包含越来越多突变的亚克隆。根据我们的实验设计，我们不能排除骨髓增生异常综合征样本中存在第二代AML样本中不存在的额外亚克隆的可能性，一个基因组（UPN298273）表明这可能发生。

白血病生物学的一个独特方面是造血细胞在外周血和骨髓之间自由混合和再循环。随着时间的推移，持续生长的克隆必须保持自我更新的能力。新克隆中的突变必须赋予它们生长优势，才能成功与祖先克隆竞争。结果是，这些二级AML样本不是单克隆的，而是由几个具有独特突变集的基因组拼接而成；这种镶嵌是通过获得一系列突变和克隆多样性形成的。同样，最近使用全基因组测序对新发AML样本进行的分析表明，化疗后复发与克隆进化和获得新突变有关。³²对单个癌细胞的分析可能揭示出额外的遗传复杂性。最近对B细胞急性淋巴细胞白血病的研究表明，该病中细胞遗传学异常的系列获得通常通过分支层次发生，很少遵循简单的线性路径。^33,34将这项工作扩展到包括全基因组测序发现的全部突变，将是未来癌症遗传学研究的一个主要目标。

我们的研究有几个临床意义。首先，骨髓增生异常综合征和继发性AML之间的区别目前依赖于骨髓成髓细胞的手动计数，这一标准存在观察者间的偏见，但仍会推动对骨髓成髓细胞计数差异较小的患者的治疗做出重大决定。最终，识别骨髓增生异常综合征患者骨髓样本中的致病性突变模式及其克隆性，将提高诊断的确定性并改进预后算法。值得注意的是，我们研究中的两名受试者在1个月内从骨髓增生异常综合征进展为继发性AML。这一进展的基础是，尽管克隆数量没有变化（每例两个），而且点突变仅略有增加（在这些病例中，进展为继发性AML期间，<2%），但一名受试者的成髓细胞计数从7%增加到66%，另一名受验者的成粒细胞计数从13%增加到43%当通过下一代测序对相同的标本进行分析时。第二，我们发现，在所有病例中，显性二级AML克隆均来自骨髓增生异常综合征创始克隆，这表明针对这些早期突变的治疗可能是消除疾病传播细胞和提高对传统化疗反应率的最有效策略继发性AML。^35,36最后，骨髓增生异常综合征患者的疾病进展可能不仅受复发突变的驱动，而复发突变最近已被证明具有预后价值，³⁷但也由克隆人（即创始vs.女儿）产生。将骨髓增生异常综合征样本的预测重要突变的基因分型与克隆结构分析相结合，可能会产生更多信息丰富的生物标志物，并更好地了解骨髓增生异常综合症的发病机制。

补充材料

致谢

脚注

参考文献