慢性淋巴细胞白血病患者CCL3（MIP-1α）血浆水平与疾病进展风险

摘要

介绍

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是成人最常见的白血病，是一种具有高度可变临床病程的淋巴细胞增殖性疾病。CLL的特征是成熟的、抗原刺激的CD5的克隆扩增⁺/CD23型⁺血液、次级淋巴组织和骨髓中的B淋巴细胞。¹Rai等人开发的临床分期系统²和Binet等人^三仍然是慢性淋巴细胞白血病风险评估的标准方法，但它们不允许预测早期疾病患者（大多数患者）疾病进展的风险。大量研究调查了预后标志物，这有助于预测疾病早期的个体风险。免疫球蛋白可变基因片段的突变状态是CLL中最被接受和广泛使用的预后标记(免疫球蛋白V_小时),^4,5CD38的表达⁴以及70-kD的ζ相关蛋白（ZAP-70），^6,7以及细胞遗传学风险群体。⁸

在各种B细胞恶性肿瘤中，如弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL），B细胞抗原受体（BCR）信号越来越被认为是促进克隆扩张的关键因素⁹和CLL。¹两种慢性淋巴细胞白血病风险因素（IgV_小时突变状态和ZAP-70）与BCR有功能联系。的突变状态免疫球蛋白V_小时BCR片段区分“突变”和“非突变”CLL，疾病进展的风险分别为低或高，每个约占患者的50%。BCR中的体细胞突变量与预后之间的关联表明抗原刺激在疾病进展中起作用。^1,10ZAP-70主要在“未突变”CLL病例中表达，¹¹ZAP-70表达与BCR信号增强有关。¹²BCR衍生信号在CLL的发病机制和预后中发挥关键作用的进一步证据来自于这样一个概念，即CLL患者表达BCR序列确定的BCR限制集。这些BCR的免疫球蛋白（Ig）重链可变（V）基因序列在患者亚群中相同或定型，^13,14表明这些BCR结合与CLL发病相关的类似抗原。此外，来自预后不良的未突变CLL患者的细胞免疫球蛋白V_小时这些基因显示表明BCR下游激活的基因表达谱。¹¹

CLL细胞在组织中增殖，而不是在外周血中；在这些组织室（骨髓、淋巴组织）中，CLL细胞与附属细胞相互作用，统称为CLL“微环境”¹⁵CLL细胞在这些组织中的生长约占克隆的0.1%至1%，如CLL患者体内的重水掺入所示。¹⁶CLL增殖区被称为增殖中心或假滤泡，这是CLL组织病理学的标志性发现，也称为本病的增殖室。在这些区域，CLL细胞与多个辅助细胞（如T细胞）结合¹⁷和CD68⁺nurselike细胞（NLC），^18,19并显示BCR激活标志，²⁰提示CLL增殖是由BCR和T细胞驱动的。

研究CLL中CCL3和CCL4血浆水平的理论基础是我们最近的研究，其中我们分析了微环境对体外CLL基因表达的影响。²¹我们发现CLL细胞响应BCR刺激以及在与NLCs共培养中上调并分泌CCL3和CCL4，²¹类似淋巴组织微环境的模型系统。^15,18CCL3和CCL4的BCR和NLC依赖性诱导对使用脾酪氨酸激酶抑制剂抑制BCR信号敏感。^21,22

CCL3和CCL4，以前称为巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）和MIP-1β，是CC亚家族的趋化因子，可在许多造血细胞中诱导，尤其是参与适应性免疫反应的细胞（巨噬细胞、树突状细胞、B和T淋巴细胞）。CCL3通过趋化因子受体CCR1和CCR5发出信号，而CCL4仅通过CCR5发送信号。CCL3和CCL4是单核细胞和淋巴细胞的化学引诱剂。²³先前的体外和体内研究强调CCL3是正常和肿瘤B细胞对BCR信号的反应中上调的关键反应基因，^21,24,25被Bcl-6抑制。²⁶

我们小组和其他研究人员的先前研究表明，活化的CLL细胞过度表达CCL3和CCL4^21,27,28CLL患者的CCL3和CCL4血浆水平升高。^21,29因此，我们假设CCL3和CCL4血浆水平可能作为BCR依赖性CLL细胞在体内激活的替代标记物。为了探讨这一假设，我们检测了CLL患者的血浆样本中CCL3和CCL4的浓度，并研究了CCL3、CCL4水平与既定预后因素和临床结果的关系。

方法

结果

CCL3与从诊断到初始治疗时间的关系

在研究的351名患者中，147名患者需要根据国家癌症研究所工作组的标准进行治疗。³⁰整个人群的TTFT为72个月（95%置信区间为60-101）。如所示表5各亚组TTFT中位数差异显著。CCL3水平高的CLL患者的TTFT中位数明显短于CCL3含量低的患者（>250个月，P（P）< .0001). 在已确定预后不良标记物的患者中，TTFT中位数也显著缩短。未突变IgV患者的TTFT_小时CD38为45个月，34个月⁺患者，ZAP-70治疗43个月⁺患者，高β患者47个月₂-微球蛋白水平。图1A显示了描述CCL3（左面板）或CCL4（右面板）水平高或低患者TTFT的Kaplan-Meier曲线。图2显示了所研究的既定预后标志物的Kaplan-Meier曲线。

表5

不同预后亚组的首次治疗时间

特性	类别	总计	接受治疗的患者	TTFT中值，mo（95%CI）	5年无需治疗（95%CI）	P（P）
所有患者		351	147	72（60-101）	0.56 (0.50-0.62)
免疫球蛋白V小时	突变的	142	40	154 (100-> 250)	0.73 (0.64-0.82)	< .0001
	未突变	129	79	45 (33-58)	0.37 (0.29-0.49)
CD38型	否定	252	89	101（70->250）	0.60 (0.53-0.68)	< .0001
	积极的	84	55	34 (21-66)	0.37 (0.27-0.51)
ZAP-70型	否定	153	51	122 (79-> 250)	0.65 (0.57-0.75)	< .0001
	积极的	133	78	43 (32-58)	0.38 (0.29-0.49)
β2-微球蛋白	<4毫克/升	262	92	101 (69-> 250)	0.59 (0.52-0.67)	.0003
	≥4 mg/L	87	55	47 (36-72)	0.46 (0.36-0.60)
CCL3型	低	177	35	> 250 (181-> 250)	0.75 (0.67-0.84)	< .0001
	高	174	112	40 (32-59)	0.40 (0.33-0.49)
CCL4级	低	180	49	181 (101-> 250)	0.66（0.58-0.76）	.0002
	高	171	98	58 (40-72)	0.47 (0.40-0.57)

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图1

CCL3、CCL4与从诊断到初始治疗的时间的关系。（A） Kaplan-Meier曲线显示了根据诊断后的时间，无治疗生存的概率。CLL患者分为低或高CCL3（左曲）或CCL4（右曲）血浆水平的患者组。这些类别基于CCL3和CCL4的临界水平，与我们人群中CCL3与CCL4浓度的中位数相对应(表2); 在每条曲线的旁边显示相应的截止级别。（B） 根据CCL3和CCL4水平显示4个CLL亚组中未治疗患者比例的Kaplan-Meier曲线。与CCL3水平较低（<10 pg/mL）和CCL4水平较高或较低的患者相比，CCL3含量较高（≥10 pg/mL）、CCL4含量较低或较高的患者无治疗生存率较低。

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图2

已确定的预后标志物与从诊断到初始治疗的时间之间的关系。五个Kaplan-Meier图表明，根据是否存在既定的预后标记物（突变状态、CD38、ZAP-70、β₂-微球蛋白和细胞遗传学）。

为了更好地了解CCL3和CCL4对TTFT的不同影响，我们将患者分为4组(图1B） ：CCL3^高的/CCL4级^高的，CCL3^高的/CCL4级^低的，CCL3^低的/CCL4级^高的和CCL3^低的/CCL4级^低的CCL3高水平和CCL4高水平或低水平患者的TTFT中位数明显短于CCL3低水平和CCL高或低水平的患者（分别大于250和181个月）（分别为40和35个月），图1B） ●●●●。总的来说，这些数据表明CCL3（而非CCL4）对TTFT有强大的影响。

CCL3和CCL4血浆水平和CCL3系列样品的分布

我们的351名患者队列中CCL3血浆浓度的分布如图所示图3A.共有177份样本（50.4%）的CCL3水平低于10 pg/mL的中位数。对7名不同患者在多个时间点采集的系列血浆样本中的CLL3水平的测量表明，随着时间的推移，7名患者中有一名患者超过了中位数10-pg/mL阈值(图3B） ●●●●。CCL4的结果类似（补充图2）。

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图3

CLL中CCL3血浆水平：分布和序列样本，以及CCL3免疫组织化学。（A） 351例慢性淋巴细胞白血病患者血浆CCL3水平的分布。（B） 在CLL患者的系列样本中检测到CCL3的连续血浆水平。这些线连接单个患者的符号，表示任何一名患者随时间变化的CCL3浓度（y轴）（x轴）。（C） 典型病例CLL淋巴结切片中CCL3的常规（左）和免疫荧光（右）免疫检测（原始放大倍数×400）。使用奥林巴斯BX50显微镜和ColorView数码相机拍摄图像，并使用cellSens成像软件（全部为奥林巴斯）进行处理。CCL3型⁺细胞（左侧为棕色染色）倾向于在增殖中心区域积聚（左侧）。CD79a（红色）和CCL3（绿色）免疫荧光双重染色显示CD79a的共定位⁺和CCL3⁺CLL单元格，如箭头所示。（插图）在另一个病例中CCL3和CD79a的共表达。更多免疫组化数据见补充图2。

讨论

BCR信号越来越被认为是B细胞恶性肿瘤（包括CLL）的中心病理机制^1,10和DLBCL。⁹干扰BCR信号传导的新靶向药物，如脾酪氨酸激酶和Bruton酪氨酸激酶抑制剂，正在进入临床阶段，并在CLL和其他B细胞恶性肿瘤患者的首次临床试验中显示出良好的结果。^32,33由于这些新出现的治疗方案，确定哪些患者可能受益于这些新方法和/或成为疾病早期治疗的候选者非常重要。

在这里，我们将CCL3描述为一种新的、可靠的CLL预后标记物，可以通过酶联免疫吸附试验在血浆样本中轻松可靠地进行测量。与本病的其他预后标志物相比，这些技术方面有利于CCL3。CLL中一些已确定的预后标志物的测量是劳动密集型和成本密集型的（突变状态、细胞遗传学），而其他（ZAP-70）难以标准化用于常规评估。根据我们队列中CCL3水平的中位数，低CCL3和高CCL3的患者可以在10 pg/mL的临界点进行区分，这说明了低风险患者与高风险患者的区别。与CCL3相比，CCL4的预测性相对较差，并且在不一致的病例中没有添加额外的预后信息。CCL3由CLL细胞（和正常B细胞）分泌，以响应BCR信号，主要发生在淋巴组织中。因此，CCL3血浆水平可能反映了BCR衍生的CLL克隆激活状态。从不同组织隔室（血液、骨髓、淋巴组织）分离的CLL细胞的比较基因表达谱支持这一点，这表明CCL3和CCL4是淋巴组织CLL细胞中上调的淋巴组织“特征”基因，如基因表达谱所示。²⁰在大多数最初CCL3和CCL4水平较低的患者中，CCL3与CCL4的水平稳定(图3B类；补充图1）表明，随着时间的推移，低风险患者的CCL3和CCL4水平相对稳定。然而，需要对大量与临床和其他预后因素相关的连续样本进行详细分析，以更好地了解CCL3和CCL4水平与疾病活动性之间的关系。

先前的体外和体内研究结果强调，CCL3是正常和肿瘤B细胞对BCR信号的响应中上调的关键反应基因。^21,24,25 SCYA3号机组CCL3的基因编码是激活的B细胞特征的一部分³⁴在DLBCL中，并作为DLBCL患者生存率低的预测因子。³⁵Lossos等人³⁵建议的测量SCYA3号机组，以及低分子氧化合物,2006年,FN1型,CCND公司、和BCL2级DLBCL危险分层的基因表达。从功能角度来看，有趣的是，低BCL6号机组和高SCYA3号机组在该模型中，表达是不良预后的指标，³⁵考虑到这一点BCL6号机组绑定到中的顺元素CCL3型启动子，在这里它起关键阻遏作用CCL3型表达式。²⁶

CCL3在淋巴瘤中的确切功能尚不清楚。基于B细胞衍生CCL3在正常免疫应答中的假定功能，我们假设CLL细胞增加CCL3分泌可能导致辅助细胞向组织微环境中的恶性B细胞迁移和归巢。²¹众所周知，增殖室中的CLL细胞散布着T细胞^17,36单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，称为NLC。¹⁵可以想象，CLL细胞衍生的CCL3可能会吸引这些辅助细胞，从而创造一个有利的微环境，使CLL细胞能够与T细胞和NLC相互作用，接收生存和增殖信号。这得到了体外试验的支持²⁴和体内^37,38研究表明，CCL3和CCL4在淋巴组织中具有特殊功能。这些研究表明，淋巴组织中的B细胞激活导致CCL3和CCL4分泌，导致CCR5的募集⁺调节性T细胞与B细胞和抗原呈递细胞的同源相互作用。^37,38

总之，我们的研究结果以及DLBCL中的基因表达数据表明，CCL3在选定的B细胞瘤中起着稳健的预后标记物的作用，其中BCR信号和CCL3表达增加是一个共同的主题。我们的研究证明了测定CCL3血浆水平预测慢性淋巴细胞白血病的可行性和有效性。检测的简单性、预后信息的重要性、与BCR信号的关系以及与该通路相关的新疗法表明，CCL3将成为CLL和其他潜在B细胞恶性肿瘤的一个非常有用的预后标记物。

补充材料

致谢

脚注

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