介绍
Brachyury公司(T型)在早期小鼠胚胎的原始条纹、尾芽和脊索中表达[1]，[2]它在早期发育中起着关键作用：缺乏功能性Brachyury蛋白的小鼠胚胎不能正常原肠化，不能形成分化的脊索，缺乏第七体节之后的结构，并且左右模式有缺陷[3]，[4]，[5]。的表达式模式爪蟾
[6]和斑马鱼[7]，[8]
Brachyury公司同源基因与小鼠相似，这些基因在早期发育中起着相似的作用[8]，[9]，[10]，[11]，表明Brachyury公司功能在进化过程中一直保持不变。
为了理解Brachyury是如何发挥其作用的，我们搜索了该转录因子的基因组靶点。在以前的工作中使用爪蟾我们使用差异筛选方法分离目标基因，如电子FGF
[12]，的成员比克斯家庭[13]，[14]和重量11
[15]，而在斑马鱼胚胎中的染色质免疫沉淀微阵列（ChIP芯片）方法使我们能够识别200多个无尾a（Ntla）的潜在靶标，无尾a是Brachury的直系同源物[16]在本文中，我们应用ChIP芯片方法来鉴定Brachury在小鼠胚胎干细胞分化过程中的靶点。ES细胞向类胚体（EB）分化时提供了丰富的物质来源，我们预测，在这些细胞中识别Brachyury靶点将有助于了解ES细胞的分化，并有助于在早期胚胎中识别此类靶点。这项工作还可能表明Brachyury的生物学功能在脊椎动物中的保存程度，并提供Brachyuri结合基序在靶顺调控区内如何分布的信息。
我们的结果表明，Brachyury分化ES细胞的靶点富含序列特异性DNA结合蛋白和信号转导途径的成分，这些蛋白和成分指导早期胚胎原始条纹和尾芽中的细胞命运。有趣的是，大多数结合峰并没有为典型的T盒结合位点富集5′-TCACACCT-3′
[17]，[18]但确实包含重复的AC图案。在信号转导途径的组成部分中有WNT和FGF途径的调节因子。这些包括轴2(Axil公司/传导)，它编码Wnt信号的负调节器，以及Wnt3a型和Fgf8型值得注意的是，在纯合子中所有三个基因的表达都下调Brachyury公司突变胚胎，我们通过ChIP-qPCR显示，这些也是BRACHYURY分化人类ES细胞的基因组靶点。这些结果与斑马鱼强调Wnt和Fgf信号转导途径成分作为Brachyury靶点的重要性的工作一致[16].在证明轴2在早期小鼠胚胎中受Brachyury和TCF/Lef蛋白调节[19]，[20]，[21]，[22]，我们的结果强调了早期胚胎基因表达调控中信号通路之间的复杂相互作用。
结果
ES细胞培养
初步实验表明，我们的ES细胞培养体系产生了大小均匀的类胚体，类似于生长在疏水表面上的EB[23]，以及Brachyury公司通常在分化第4天达到峰值(). 免疫组织化学分析表明，我们胚胎体中约15%的细胞表达Brachyury（数据未显示）。
的时间表达模式Brachyury公司在早期ES细胞分化过程中。该图显示了胚状体纺纱机培养物的定量RT-PCR图谱。Brachyury公司表达式是相对于β肌动蛋白图像显示第0天小鼠胚胎成纤维细胞喂食器上的未分化R1细胞，第2天的早期幼胚集落，以及第3天、第4天（交联时）和第5天的类胚体。
ChIP-ChIP和生物信息分析
Brachyury的结合位点通过ChIP-ChIP实验确定，最近的基因通过注释小鼠基因组的NBI35.1版本确定（参见材料和方法). 过滤后，我们的分析给出了代表396个基因的520个富集探针的列表(表S1). 对一组被称为结合或未结合基因的基因组定量PCR证实了我们的ChIP-ChIP方法识别出了真正的结合事件(图S1).
Brachyury公司在E7.5至E8.5的原始条纹和造血祖细胞中表达最高水平。后来的表达仅限于尾芽和脊索（E12.5），然后是大脑和尾巴的部分[2]在我们的类胚体实验中确定的表达模式已知的Brachyury靶点中，大多数（63%）在小鼠发育的7.5至17.5 dpc期间被激活(). 在这250个基因中，许多仅限于原始条纹或其中胚层衍生物，30%（75个转录本）仅在中胚层表达(). 除了轴2，Wnt3a型和Fgf8型，以下将讨论，据报道与Brachyury公司包括消息1，其表达在Brachyury公司突变体[24]，梅斯1
[25]
饰件28
[26]和Zic2公司
[27]在原肠胚形成时在原始条纹中表达，福克斯2，出现在节点和脊索中[28]、和亚当19(meltrinβ)，存在于尾芽间质中[29]。这些和其他转录本（见下文）也与Brachyury公司（或稍后激活Brachyury公司)在类胚体中，以及梅斯1女士和福克斯2表达式如所示.
Brachyury目标分析。（A） 饼图显示了Brachyury靶基因在小鼠胚胎中开始表达的发育时间（占总数的百分比；n=396）。大多数基因（63%）在E7.5之间开始表达，当Brachyury公司在原始条纹、脊索和尾芽以及E17.5中表达，仅在树干间质中表达。在显示这种时间表达模式的靶标中，30%仅限于中胚层衍生物，如右侧条形图所示。其他则以外胚层、中胚层和内胚层的各种组合表达。（B） 通过RT-PCR获得Brachyury转录因子靶在旋转培养ES细胞分化期间的时间表达。顶行中的三个面板取自一批电池，其中Brachyury公司表达在培养第4天达到高峰；其余的是从一批中取出的Brachyury公司表达在第3天达到峰值。所有显示了三次测量的平均值，并归一化为β肌动蛋白.福克斯2和福克斯1在顶行峰值Brachyury公司第4天；下面板中的基因峰值晚于Brachyury公司.
我们确定的靶点包括WNT、MAPK、JNK、TGF-β、Hedgehog、FGF和G蛋白偶联信号转导途径的成分(表S2). 对目标的分析产生了一组与功能一致的基因本体（GO）术语Brachyury公司原肠胚形成期间[30].
特别是，细胞成分分析强调了与形态发生、细胞粘附和细胞极性有关的基因产物。目标，如Gdf5型，长x1b和深x 5参与形态发生(图S2A：GO:0048598；P<10−6),加布里（Gabra1），Gfra3公司和Cbln3号机组参与将质膜锚定到细胞骨架蛋白(图S2B：GO:0030054；P=1×10−3)还有一些编码参与细胞粘附的蛋白质，如糖基转移酶B4加仑2和厘米4/国家8最后的观察结果与数据一致，数据显示糖基转移酶，尤其是半乳转移酶在T/T突变小鼠中表达错误[31]这种胚胎中细胞外基质减少[32]细胞的细胞质突起较少，尤其是体节和间质[32]重要的是，Cml4或其爪蟾直系亲属卡梅略(Xcml公司)，抑制原肠胚形成爪蟾
[33].
有趣的是，另一组靶点与生殖细胞有关(表S3)，包括Asap1公司(数据定义1)，编码与转移性前列腺癌相关的ADP-核糖基化因子GTPase激活蛋白[34]还有Wilms的肿瘤基因工作任务1
[35].
转录因子靶点
在确定为Brachyury潜在靶基因的396个基因中，53个（13.4%）是转录因子(表S4)事实上，基因本体论分析表明序列特异性DNA结合蛋白显著富集(图S2CGO:0043565，p<10−5). 表达了几个转录因子家族，包括Ets、配对盒、同源盒、翼螺旋/叉头、bZip和锌指家族。在我们的ES细胞培养条件下，许多这些转录因子的表达在Brachyury公司(福克斯2，福克斯1)或者就在事后(BapX1型，电子束2，爱尔兰，Hoxa13州，梅斯1，消息1，Nkx2.6个和鼻塞) (). 正如我们在下文中所讨论的，我们的数据为破译ES细胞和胚胎中胚层形成背后的转录因子遗传调控网络提供了基础。
T盒蛋白结合基序
先前的研究表明Brachury与该序列相互作用5′-TCACACCT-3′
[16]，[36]，[37]，[38]令我们惊讶的是，嵌套MICA和RSAT均未发现该基序在我们实验中选择的DNA序列中显著富集。相反，这两个包都确定了简单序列重复序列（AC）的富集n个(图S3A). 然而，尽管它没有被富集，但我们确实观察到一些调控区域包含一个类似于T盒位点的序列（其中1到3个核苷酸与共识不同），接近AC重复序列。这些基因包括轴2，Ctnb1/β-catenin，Erg公司，Etv1、Fgf8，铁，福克斯2，福克斯1，Fyb公司，识别码4，梅斯1，和霍克萨3其中T盒样位点可能位于重复序列的5′或3′处。
为了评估这些观察结果的重要性，我们首先进行了电泳迁移率变化分析(图S3B). 正如预期的那样，小鼠Brachyury的T结构域与TCACACCT的经典序列结合，结合可以与未标记的寡核苷酸竞争，复合物可以被Brachyuri抗体“超移位”。（AC）n个重复基序也与Brachyury形成复合物，但尽管该复合物也可能是“超移位”的，但未标记的寡核苷酸竞争性很差。最后，当这两个基序都存在于放射性标记的寡核苷酸中时，使用过量的冷寡核苷酸（其中只有T盒位点发生突变）的竞争很差，而使用（AC）的竞争也很差n个该区域发生突变。这些观察结果表明（AC）n个该序列仅与Brachyury弱相互作用，如果可能的话，其作用可能仅限于稳定与相邻甚至远处T盒位点的结合。
如果属实，这种作用可能仅限于啮齿动物。我们的数据集包含111个峰，相关的AC重复序列长度超过8个核苷酸(表S5). 与大鼠、人类、斑马鱼和爪蟾基因组显示，这些富含AC的区域中有38个是小鼠独有的，而68个也存在于大鼠体内。16个AC重复序列存在于人类基因组中，其中11个也存在于大鼠基因组中。然而，斑马鱼或爪蟾(表S5).
轴2和Wnt3a型作为Brachyury的目标
在已确定的Brachyury靶点中，有许多基因编码Wnt信号通路的阳性和阴性调节因子(). 启动子区的富集峰Dkk1公司，Ctnnb1型/β-连环蛋白，驱动器3、和γ-连环蛋白/Jup公司显示Brachyury绑定()并揭示了AC重复序列（绿色条）和不完美T结合位点（蓝色条）的存在。在这些Wnt相关基因中，Wnt3a型和轴2在我们的ChIP-ChIP分析中，它们的转录起始位点周围都显示出强烈的Brachyury结合峰(，)，它们的时间表达模式都类似于Brachyury公司在我们的胚胎体系统中(，). 对于Wnt3a型，一个变异体Brachyury位点位于第一内含子中AC重复序列附近，一个典型的TCACACCT-Brachyurry位点位于转录起始位点的上游(). 在轴2，一个典型的Brachyury位点位于变异位点和AC重复序列附近().
Wnt途径的组成部分是Brachyury的靶点。（A） Wnt信号通路。箭头表示积极互动，条形表示消极互动。本研究中确定的目标概述如下大胆的（B–E）周围基因组区域的Brachyury结合Dkk1公司（B） ；Ctnb1号机组/β-连环蛋白（C） ；驱动器3（D） ；和γ-连环蛋白/jup公司/斑球蛋白（E） 。每个靶标都显示出针对染色体位置的倍数富集。蓝色条表示T盒状站点TSACANNT（N=任何基础，S=G/C），绿色条表示（AC）n个。横条上方的星形代表反向链上的序列。图是三份芯片结果的平均值，与2006年2月的mm8组装一致。
分析Wnt3a型Wnt通路的正调控因子。（A） 位置分析Wnt3a型.数字（和，)显示了相对于染色体位置的折叠富集。曲线图是三份芯片结果的平均值，与2006年2月的mm8组装一致。蓝色条表示T盒状站点TSACANNT（N=任何基础，S=G/C）；绿色条表示（AC）n个; 红色表示TCACACCT的共识。横条上方的星星代表反向链上的序列。（B） 定量RT-PCR表达谱Wnt3a型在ES细胞分化过程中，相对于β肌动蛋白.（C，D）的表达式Wnt3a型原位杂交研究；在每个图像中，顶部图像显示背面视图，底部图像显示侧面视图。（C） 表型野生型（+/+或+/T型)E8.5–8.75的胚胎和（D）突变株(T型/T型)杂交后代的胚胎Brachyury公司杂合突变小鼠。Wnt3a型用NBT/BCIP（紫色）检测表达，在双重染色后，插图显示侧面Brachyury公司用INT/BCIP检测（橙棕色）。注意在野生型胚胎中Wnt3a型在尾芽和轴旁中胚层中表达。在突变胚胎中Wnt3a型染色缺失或大大减少（n=3）。比例尺显示250µm。
分析轴2Wnt通路的负调控因子。（A） 位置分析轴2。有关详细信息，请参阅图例至（B）定量RT-PCR表达谱轴2在ES细胞分化过程中，相对于β肌动蛋白.（C，D）的表达式轴2原位杂交研究；在每个图像中，顶部图像显示背面视图，底部图像显示侧面视图。（C） 表型野生型（+/+或+/T型)E8.5–8.75的胚胎和（D）突变体(T型/T型)胚胎，均来自Brachyury公司杂合突变小鼠。轴2用NBT/BCIP（紫色）检测表达，在双重染色后，插图显示侧面Brachyury公司用INT/BCIP检测（橙棕色）。注意在野生型胚胎中轴2表达于神经褶皱的尾芽、近轴中胚层和侧缘。在突变胚胎中表达轴2大大减少（n=9）。比例尺为250µm。
询问Brachyury是否需要表达Wnt3a型和轴2，我们将杂合子小鼠杂交为Brachyury公司突变[39]并评估两个基因的表达。在E7.5的野生型胚胎中Brachyury公司，Wnt3a型和轴2明显重叠(图S4). W的表达式nt3a型在里面腕表正如先前报道的那样，这个阶段的纯合子突变胚胎类似于杂合子和野生型个体[40]，但通过E8.5，当Wnt3a型表达仅限于原始条纹，其表达在Brachyury公司突变胚胎().
喜欢Wnt3a型，轴2表示为Brachyury公司7.5dpc的突变胚胎，但这种表达比Wnt3a型，有时会减少甚至缺失（未显示数据）。通过E8.5，当轴2在野生型胚胎的头皮、尾芽和原始条纹中表达，在Brachyury公司突变胚胎很弱或缺失(). 总之，这些数据表明Brachyury是正确表达Wnt3a型和轴2，对WNT信号通路的关键成分进行编码（参见讨论).
Fgf8型作为Brachyury的目标
还检测到一个强的Brachyury结合峰，位于Fgf8型()，有一个变种Brachyury遗址(5′-TCACA公司通用航空公司T-3′; 下划线的碱基与一致意见不同）定位的63个核苷酸来自（AC）19重复。The temporal expression profile ofFgf8型类似于Brachyury公司胚状体分化期间()，该基因与Brachyury公司在E7.5和E8.0–E8.25的胚胎原始条纹中(图S5;). 的表达式Fgf8型在突变体中Brachyury公司E8.0时的胚胎数量大大减少()表明Brachyury是该基因表达所必需的Wnt3a型和轴2.
Fgf8型成为Brachyury的目标。（A） 位置分析Fgf8型有关方法的详细信息，请参见图例（B）定量RT-PCR表达谱Fgf8型在ES细胞分化过程中，相对于β肌动蛋白.（C）表达Fgf8型通过原位杂交研究。图像显示表型野生型（+/+或+/T型)胚胎（顶对）和一个突变体T型/T型（下一对）胚胎来自Brachyury公司杂合突变小鼠。野生型胚胎方向为左前右后；从后面看突变体。Fgf8型用NBT/BCIP（紫色）和Brachyury公司带INT/BCIP（橙棕色）。在野生型胚胎中Fgf8型表达于原始条纹和近轴中胚层；这种表达在突变体中缺失或大大减少。比例尺显示200µm。
AXIN2、JUP、FGF8和WNT3A为人类BRACHYURY的保守靶点
因为我们在老鼠身上发现的一些Brachury靶点以前没有在青蛙或斑马鱼身上发现[16]，我们决定调查这些在其他物种中是否保守，试图进一步验证我们的结果。为此，我们决定在人类基因组中寻找BRACHYURY结合。
我们最近优化了培养条件，使人类胚胎干细胞分化为中胚层样细胞[41]这些细胞群高水平表达BRACHYURY，重要的是，它们还上调了其他中胚层标记物，包括我们在小鼠体内发现的许多BRACHYURY靶点，即，DKK1（丹麦克朗），HOXA13型，标识4，JUP公司，韩元8，美1，MSGN1号机组，SNAI2公司、和WNT3A型.
因此，我们利用了这个新开发的在体外分化系统询问BRACHYURY是否结合一些关键小鼠靶点的同源人类调节区域：AXIN2型，FGF8公司，JUP公司和WNT3A型和老鼠一样，这些区域包含不完美的T结合基序（数据未显示）。我们对hESC衍生中胚层细胞进行的ChIP-qPCR实验确实检测到这些序列的强烈富集，从而表明BRACHYURY结合到人类相同的基因组区域().
人类基因组中BRACHYURY结合的保护。（A） 使用特异性抗BRACHYURY IgG和非特异性对照IgG对来自分化hECS的样本进行ChIP-qPCR。图中显示了Brachyury靶区调控区的富集情况(AXIN2型，FGF8公司，JUP公司，WNT3A型)和阴性对照区(NCAPD2号机组).结果相对于输入染色质的表达除以非特异性对照抗体的富集。（B） 人类基因组中的BRACHYURY结合。染色体坐标（hg19）下方的短红线表示PCR扩增子相对于人类基因开始的位置（蓝色）。三个底部轨迹显示了人类和小鼠、斑马鱼和脊椎动物基因组之间的基因组序列保守性（基因组浏览器，http://genome.ucsc.edu/).
有趣的是，这些启动子序列似乎在小鼠和人类基因组之间保守，但在斑马鱼或其他脊椎动物中并不保守()这表明这些靶点可能是哺乳动物独有的。
讨论
我们已经确定了Brachyury在小鼠ES细胞分化中的基因组靶点，证明类胚体为染色质免疫沉淀实验提供了足够的材料，并且它们代表了小鼠早期发育的有效模型。虽然它们没有经历适当的形态发生，但它们确实会产生模式，如跳动心肌细胞的形成所示[42]我们实验中产生的类胚体在培养8到10天后形成心肌细胞，与正常发育过程中形成心脏管的时间相近。如下所述，至少有三个Brachury目标(Wnt3a型，轴2和Fgf8型)在原始条纹形成期间在早期小鼠胚胎中表达，在发育过程中正确表达需要Brachyury公司功能。我们还注意到一些靶点在原始生殖细胞中表达，这可能是在原肠胚形成早期出现的第一个分化群体[43]，[44]，[45]。这些细胞表达Brachyury公司直到E12.5，当该基因在非迁徙种群中下调时[46]，[47].尽管Brachyury公司可能与生殖细胞的规格没有直接关系[48]，[49]它可以调节它们的迁移和效力。
Brachyury靶区分类及与斑马鱼和青蛙的比较
我们的工作已经确定了396个Brachyury的潜在靶点，基因本体分析表明，其中许多编码序列特异性DNA结合蛋白和参与细胞粘附和胚胎形态发生的蛋白。对前一类的分析将有助于阐明中胚层形成的遗传调控网络（见下文）。后者包括细胞连接蛋白和糖基转移酶[31]与纯合突变体的细胞外基质的发现一致Brachyury公司小鼠胚胎发育不良[32]细胞的细胞质突起较少，这两种突起都可能导致突变细胞无法移出原始条纹，也可能导致前后轴伸长失败[30]在Brachyury调控的其他基因中，有编码细胞因子和信号转导途径成分的基因，在大多数方面，我们的结果与使用斑马鱼胚胎进行的类似实验结果相似[16].
类胚体以这种方式与发育中的胚胎相似，这一点很重要，同时也需要注意本研究中确定的Brachyury靶点与斑马鱼中确定的Ntl靶点之间的重叠[16]这两项研究都确定转录调控因子正在被丰富，包括同源异形盒、翼螺旋、配对盒、锌指和奇偶家庭的成员。这两个同源基因调控的基因功能也有相似之处。这些功能包括原肠胚形成（斑马鱼研究发现wnt11，蜗牛1a和blf公司和这个分析Wnt3a型，蜗牛2和基因，如Gdf5型，预计1，Krt5（Krt5），Krt8（Krt8），长x1b，赛克、和格纳克); 肌肉规格（两项研究均确定消息n1和Pax3型); 后认性（斑马鱼研究确定fgfr4、fgfr28、通风口、vox、和缺口3和这个分析Fgf8型
[50])和左右模式（斑马鱼基因包括cx43.4
[51]和我们的鼠标目标Rttn公司
[52]，Fgf8型
[53]和细胞质动力蛋白动力1li1，动力2li1
[54]和Dpcd公司
[55]).
事实上，小鼠和斑马鱼目标之间存在一些差异，这可能是由于存在额外的Brachyury公司斑马鱼基因组中的基因[8]或来自不同T盒家族成员之间基因功能的“共享”。例如比克斯基因被确定为Brachyury和VegT的靶基因爪蟾
[13]，[14]，但他们的老鼠直系亲属混合物1似乎主要受Eomesodermin的调节[56]，[57]此外，如所示哺乳动物基因的一些调控序列(轴2，Fgf8型，Jup公司和Wnt3a型)与斑马鱼的同源性很低。Brachyury可能结合不同基因组中的不同位置，这一点已被其他转录因子所注意[58]尽管目标保持不变。Brachyury很可能不仅与基因转录起始位点附近的启动子结合，还与远处的增强子结合[59]人类基因组中的情况确实如此（T.Faial等.，正在准备中）。我们注意到，小鼠和斑马鱼阵列均基于启动子区域，因此在这些数据集中无法获得增强子结合，这可能解释了为什么某些靶点似乎对每个物种都是唯一的。
规范和非规范T盒结合位点
我们之前寻找斑马鱼Ntl靶点的工作表明，典型的T盒位点TCACACCT在Ntl靶基因附近富集[16]在本实验中，对于大多数靶标没有观察到该基序的显著富集。相反，我们确定了一部小说（AC）n个在电泳迁移率转移实验中识别Brachyury T结构域的重复序列，尽管其识别能力较弱。我们还没有完全理解这一观察的意义。Mouse Brachyury绑定到纳克发起人[60]但该物种中没有其他Brachyury靶标的详细特征。可能Brachyury的老鼠很像果蝇属Brachyenteron，其中T盒共有结合序列的模块化变异决定转录激活的程度[61]一个类似的系统控制脊索的形成玻璃海鞘，具有包含Ci-Brachyury和Ci-foxA结合位点的调控基序[62].
此外，许多转录因子直接与远端增强子元件中的DNA结合[59]，然后通过染色质环连接到启动子区域，允许与参与转录调控的其他蛋白质相互作用[59]在一些小鼠靶点中，典型的Brachyury结合基序可能并不存在于启动子区域，而是存在于上游或下游调控区域。我们的结果表明，这确实发生在人类基因组中（T.Faial等.，正在准备中）。
AC重复也有可能导致左手DNA螺旋和弯曲的短暂形成，改变染色质结构并鼓励转录因子结合[63]Brachyury可能是具有二级识别基序的蛋白质的一个例子[64]并且AC重复序列和TCACACCT序列的存在允许稳定的结合，而这种结合不能被TCACACCT-序列的过量所竞争(图S3B). 重复序列也可以作为预设；也就是说，当DNA区域倾向于进化成新的调控序列时[65].
Wnt和Fgf信号的Brachyury调制
斑马鱼Wnt信号转导途径的几个成分被鉴定为Ntl靶点，我们发现小鼠Brachyury的情况也是如此。为了确定Brachyury是否在小鼠正常发育过程中调节这些潜在靶点的表达，我们询问了Wnt3a型和轴2通常表示为Brachyury公司纯合子突变胚胎，并发现尽管这两个基因都在E7.5表达（尽管在轴2)，在中胚层衍生物中E8.5也不表达(，). 这表明Brachyury不需要对Wnt3a型或轴2，但需要保持其表达。连同Wnt3a保持的观察结果Brachyury公司通过TCF/Lef信号在小鼠早期胚胎中的表达[20]，[21]，以及轴2在中被下调Wnt3a型突变体[66]，我们的数据表明，Brachyury和Wnt信号协同创建一个调控网络，指定小鼠胚胎中后中胚层的形成。
该网络的一部分可能涉及Fgf信令。Brachyury和Fgf信号形成了爪蟾斑马鱼胚胎[67]，[68]，[69]，[70]，我们注意到Fgf8型是类胚体中Brachyury的靶点，其表达在Brachyury公司突变胚胎().
最后，我们的工作揭示了AXIN2型，FGF8公司和WNT3A型也受到BRACHYURY的约束()在人类ES细胞中分化为中胚层样细胞[41]这些结果进一步证实了这些基因的特性真诚地Brachyury以这些关键信号成分的调控为目标，并认为其在人类发展过程中是保守的。
中胚层基因调控网络的构建
理解Brachyury基因调控网络的尝试很重要，不仅因为Brachyure是脊椎动物胚胎中胚层正确形成所必需的，而且因为它足以形成某些中胚层细胞类型，至少在爪蟾
[71]新的Brachyury靶点的识别将使Brachyuri与包括它的遗传调控网络的其他组成部分整合，例如Ets家族成员Elk-1和尾同源物Cdx2[72]并询问这些网络在进化过程中的保存程度。
材料和方法
道德声明
根据1986年《动物（科学程序）法案》的条件，动物程序是根据英国内政部项目许可证进行的。
小鼠ESC培养
胚胎干（ES）细胞培养如所述[73]除有丝分裂失活的小鼠胚胎原代成纤维细胞（MEFs）用作饲养者外。培养皿涂有0.1%明胶（Sigma-Aldrich）。MEF和ES细胞保存在补充有0.1 mMβ-巯基乙醇、非必需氨基酸（Gibco Invitrogen）、2 mM谷氨酸（Gibco-Invitrogen）和分批测试10%（MEF）或15%（ES细胞）胎牛血清（FBS）（GibcoInvitrogin）的DMEM（Sigma-Aldrich）中。在第10天，ES细胞培养基还补充了白血病抑制因子（LIF）（ESGRO®，Millipore）三单位/ml[74].早期传代R1小鼠ES细胞[75]每2天传代一次，每天更换培养基以防止分化。
ES细胞在旋转瓶中分化，产生大量同步分化的类胚体（EB）[76]，[77]将Cellspin培养系统（Integra Biosciences）设置为25 rpm，旋转角度720°，以避免EB聚集。如上所述制备Spinner培养基，但省略了LIF，FBS增加到20%。在第0天，将粘附的对数期ES细胞集落解离并重悬于10ml旋转培养基中。通过37°C下20分钟的差异沉淀，耗尽饲养细胞。
在100 ml硅涂层（Sigmacote，Sigma-Aldrich）旋转烧瓶（Integra Biosciences）中预先平衡培养基（45 ml）。从涂有明胶的差异沉淀板中回收ES细胞，并在800 g下离心5 min。细胞完全分离以确保从单个细胞开始培养，每个旋转瓶接种10个7细胞置于5ml培养基中。24小时（分化的第1天）后，向每个烧瓶中再添加50 ml纺丝培养基。此后，每天让EB下沉，抽吸50 ml培养基，并用50 ml新鲜的预热纺丝培养基替换。
人类ESC培养
人类ESCs（H9[WiCell，Madison，WI]）如前所述得到维持和分化[41]简而言之，通过将hESCs培养在添加了FGF2（20 ng/ml）、LY294002（10µM）和BMP4（10 ng/ml）（称为FLyB培养基）的化学定义培养基（CDM）中，诱导其表达BRACHYURY。在FLyB培养基中培养36小时后收集细胞进行ChIP，此时BRACHYURY表达达到峰值。
定量RT-PCR
实时RT-PCR分析基因表达。使用Tri-Reagent LS（Sigma-Aldrich）从分化的EB中分离出RNA，用不含DNA-的DNAse I（Ambion）消化，并使用安捷伦科技2100生物分析仪检查完整性。使用Superscript III逆转录酶（Invitrogen，Life Technologies）从1µg RNA中生成cDNA，然后使用LightCycler 480 SYBR Green I master kit（Roche）进行实时PCR。鼠标β肌动蛋白引物被用作内源性对照来表达相对表达水平(表S6).
抗体
本研究中测试了几种抗Brachyury抗体。其中，山羊多克隆C19抗体（SC-17745，Santa Cruz Biotechnology）针对人类Brachyry的C末端序列产生，在染色质免疫沉淀中表现最佳。这种抗体是针对不包括T盒的Brachyury的一个不同区域产生的，在以前的研究中已经有了很好的特征[78]，[79]，[80]它给出了早期小鼠胚胎的预期染色模式(图S6A和免疫沉淀实验中识别的Brachyury蛋白（大小正确），然后进行蛋白质印迹(图S6C). 这些实验未能在胚胎干细胞中检测到Brachyury，而在ES细胞中，Brachyuri的表达被ShRNA结构物抑制(图S6D，E）。
整体安装就地杂交
从MF1或129株中收集野生型小鼠胚胎Brachyury公司BTBR T的突变胚胎+tT/J×丁苯橡胶T+tT/J杂合子杂交[39]胚胎在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的4%多聚甲醛中固定过夜，然后脱水并储存在−20°C的100%甲醇中。将小鼠Brachyury编码序列亚克隆到pCS2+并用于生成探针。安轴2探针由IMAGE克隆1361800（Geneservice）生成Wnt3a型IMAGE克隆pENTR223.1 100015989亚克隆到pCS2+后的探针(表S7)，和Fgf8型探针来自pCMV-SPORT 6.1中的IMAGE克隆6513131（Geneservice）。使用T7 RNA聚合酶从线性化模板中生成地高辛标记或荧光素标记的反义RNA探针，并按照所述进行整体原位杂交[81]碱性磷酸酶使用（i）BM紫色检测；（ii）2-[4-碘苯基]-3-[4-硝基苯基]-5-苯基四唑氯化物（250µg/ml）加磷酸品红（250µ的g/ml）（INT/Mag）；或（iii）硝基蓝四唑（175µg/ml）加5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（337.5µg/ml）（NBT/BCIP）（罗氏）。它们分别呈现深蓝色、橙棕色或紫色染色。在染色反应中使用最终浓度为5%的聚乙烯醇（Sigma-Aldrich）。
整体免疫组化
如上所述固定胚胎，并将其重新水化至PBS进行染色。用1M甘氨酸封闭游离醛基团，用PBS/0.1%吐温20（PBST）清洗胚胎，用PBS中3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。胚胎在4°C下在添加0.2%牛血清白蛋白（BSA）和10%热灭活FBS的1∶400 C19抗体的PBST中孵育过夜。然后清洗它们，用1∶400兔抗羊生物素化IgG（E0466，Dako）孵育，并用Vectastain Elite ABC底物（Vector laboratories）和Sigma Fast Nickel Enhanced DAB chromagen（Sigma）染色。
体外翻译和蛋白质印迹
Brachyury公司使用上述pCS2+结构和Ambion mMessage mMachine（Applied Biosystems/Ambion）合成mRNA。mRNA在兔网织红细胞裂解物（Promega）中翻译。体外翻译产物和类胚体提取物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），并使用CAPS转移缓冲液（10 mM CAPS pH 11，10%甲醇）进行蛋白质印迹。用5%奶粉在PBST中隔夜封闭膜，并在相同溶液中稀释抗体。洗涤液在PBST中。主要抗体是R&D Systems抗T和SantaCruz抗T（见上文）。两者均以1∶250的稀释度使用。二级抗体为HRP-连接的SantaCruz D抗羊IgG（1∶20000）和HRP-链接的Amersham NA934V抗兔IgG。所有抗体在室温下孵育1小时。内源性和在体外使用Santacruz Exactacruz D抗羊系统（SC-45041，Santa Cruz）免疫沉淀翻译的T蛋白进行免疫印迹，以避免检测IP抗体的重链和轻链。检测使用Pierce Supersignal West Dura Extended Dura基板（Thermo Scientific）。
染色质免疫沉淀（小鼠ESCs）
染色质免疫沉淀/定位分析基于安捷伦哺乳动物ChIP-ChIP协议，结合全基因组扩增基因组Plex试剂盒（Sigma）[82]完整EB（1.5×109当Brachyury公司表达水平最高（通常在分化4天后）。随后是核的淬灭和分离。我们的协议不同于以前发布的程序[83]EB在固定前不会被破坏。使用Misonix 3000超声波仪对细胞核进行超声波处理，以产生500 bp的片段，并使用多克隆山羊抗Brachyury C-19（Santa Cruz Biotechnology）或正常山羊IgG（Santa克鲁兹Biotechnology）作为同型对照物对这些片段进行免疫沉淀。在洗涤和洗脱步骤之后，交联在65°C下翻转过夜。样品通过启动子特异性引物进行分析，或通过GenomePlex全基因组扩增进行微阵列研究。
染色质免疫沉淀（人ESCs）
如前所述进行ChIP[83]进行了一些修改。简言之，在FLyB培养基中培养36小时后收集H9 hESCs（一个10厘米的融合培养皿）[41]当BRACHYURY表达达到高峰时。按说明固定细胞[83]，分离细胞核并使用Misonix 4000进行声波处理，以获得约1000 bp的DNA片段。使用10µg抗BRACHYURY山羊IgG（研发系统）在4°C下孵育样品过夜，并使用10μg非特异性山羊IgC作为对照。染色质通过加入100µl蛋白G动态珠（Invitrogen）进行免疫沉淀，然后在4°C下孵育1小时，并使用磁性支架收集珠。清洗珠子后，洗脱染色质，并在65°C下翻转交联过夜。然后用RNA酶和蛋白酶K处理样品，用苯酚/氯仿提取DNA，乙醇沉淀，最后在无核水中洗脱。这个实验重复了三次，结果相似。
使用基因组定量PCR对选择的靶点进行了靶点富集验证。根据制造商关于7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）的说明，使用Fast SYBR®Green Master Mix（应用生物系统）扩增DNA片段。启动子特异性引物(表S8)目的是扩增小鼠T结合位点（AXIN2、FGF8、JUP和WNT3A）的同源区域。NCAPD2号机组作为阴性对照基因。
电泳迁移率变化分析
小鼠的T域Brachyury公司通过PCR扩增（引物序列表S7)并将框架内插入谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合载体pGEX-6P-1。融合蛋白表达于大肠杆菌通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导，并使用GSTrap FF柱和预分离蛋白酶（GE Healthcare）在4°C下纯化，只留下甘氨酸和脯氨酸残基附着在蛋白质上。使用Amicon Ultra 4柱（Millipore）对其进行浓缩，并通过SDS PAGE和质谱法确认所得蛋白质的身份。
含有（i）核心Brachury共有结合序列TCACACCT，（ii）简单AC重复序列，或（iii）核心Brachury序列与AC重复序列及其突变版本的双链低聚物具有相同的BglII/BamH1 5′外伸(表S7). 这些经过PAGE纯化、退火，并用[α-32P] dCTP使用Klenow片段。使用Sephadex G-50柱去除未结合核苷酸（GE Healthcare）。在1×EMSA结合缓冲液（25 mM HEPES pH8.0、100 mM KCl、1 mM DTT、0.1%NP-40、5%甘油、10 mM EDTA）、0.5%奶粉和50 ng/µl dI/dC中使用30000 cpm/µl和8–10 fmol标记的低聚物在冰上培养结合反应40分钟。使用4 pmol冷低聚物的竞争反应在冰上预培养10分钟。在超位移实验中，在结合后添加山羊多克隆抗Brachyury N19抗体（SC-17743，Santa Cruz），然后在冰上再培养20分钟。
支持信息
图S1
目标验证。箱形图显示靶基因结合启动子区域的基因组定量PCR轴2，福克斯1，地图2，Nkx2.6个，Pax3型，Rttn公司，梵高和已发布的目标纳克，和未结合或阴性启动子区域纳米3′，1700010C24Rik公司和β肌动蛋白.方框表示四分位范围，上边缘为75第个百分位和下边缘25第个百分位数。晶须显示最小值和最大值。线以上的值富含染色质免疫沉淀。数据来自五个独立的染色质免疫沉淀。探头识别纳克安捷伦244K启动子阵列上不存在。
（畅通节能法）
图S2
目标基因的功能分析。条形图显示（A）生物过程的基因本体（GO）注释；（B） 细胞成分；和（C）使用GOToolBox的分子功能。水平条表示富集率（观察频率/预期频率），纵轴给出GO项，后面是括号和层次结构级别中的GO标识号。颜色条表示统计显著性。与Brachyury功能相关的GO术语以红色方框突出显示。
（畅通节能法）
图S3
小鼠Brachury T结构域与DNA的相互作用。（A） 结合探针周围的序列富含（AC）n个相对于它们的基因组邻居重复。该基序是使用NestedMICA位置权重矩阵生成的。这可能代表一个次要的Brachyury识别基序。（B） 电泳迁移率变化分析。小组a：结合反应使用32P标记的TCACACCT。车道1，无蛋白质；泳道2，来源于空载体的对照蛋白；通道3–6，小鼠T域蛋白：通道4包括多余的未标记探针；通道5包括多余的未标记突变探针；6号车道是一个使用反T N-19（SC-17743，圣克鲁斯）的“超级换档”车道。请注意，Brachyury T结构域与T位点寡核苷酸结合，这种结合由冷野生型寡核苷酸竞争，而不是由突变的寡核苷酸竞争。小组b：7–9号车道包括32P标记的TCACACCT；第10道使用了该寡核苷酸的指定突变版本。注意，Brachyury T结构域不与突变的寡核苷酸结合。小组c：使用32P标记的AC重复序列寡核苷酸。11–13号车道作为面板a；车道14包括多余的未标记探针；车道15包括多余的未标记突变探针；16号车道是一个“超级换档”。请注意，Brachyury T结构域与AC重复序列寡核苷酸的结合较弱，但这种结合似乎并不与冷野生型寡核苷酸竞争。然而，该复合物是使用Brachyury抗体“超移”的。小组d：使用32P标记的基序，包括T位点TCACACCT和AC重复序列。17–20道显示，Brachyury结合了这种寡核苷酸，这种结合是由冷野生型寡核苷酸竞争的。第21条和第22条通道表明，未标记的寡核苷酸没有显著竞争结合，其中任一基序发生突变。23号车道显示“超换档”。在相同条件下进行（a–d）中的实验，并暴露相同的时间。
（畅通节能法）
图S4
的表达域
Brachyury公司
，
Wnt3a型
和
轴2
E7.75小鼠胚胎重叠。（A） 的表达式轴2使用NBT/BCIP（紫色）检测到的荧光素标记反义探针进行分析。（B） 使用地高辛标记的反义试剂分析（A）中的胚胎腕表用INT/Mg磷酸盐（棕色）检测探头。（C） 的表达式Wnt3a型使用NBT/BCIP（紫色）检测到的荧光素标记反义探针进行分析。（D） 用地高辛标记的反义物分析（C）中的胚胎Brachyury公司用INT/Mg磷酸盐检测到的探针（棕色）。所有胚胎的定向如（A）所示。比例尺为200µm。
（畅通节能法）
图S5
的表达域
Brachyury公司
和Fgf8在E7.75小鼠胚胎的原始条纹中重叠。（A） ●●●●。的表达式Fgf8型使用NBT/BCIP（紫色）检测到的荧光素标记反义探针进行分析。（B） ●●●●。用地高辛标记的反义物分析（A）中的胚胎Brachyury公司用INT/Mg磷酸盐（棕色）检测探头。黑条为200µm。
（畅通节能法）
图S6
抗Brachyury抗体的验证。（A） 使用Santa Cruz抗人T C19和镍增强DAB底物对E9.5胚胎进行免疫组化。染色出现在脊索（箭头）、胸前中胚层（箭头）和尾芽中。在省略初级或次级抗体的对照组中没有染色。（B） 的表达式Brachyury公司通过原位杂交研究E9.5胚胎中的RNA。注意与（A）的相似性。（A）和（B）中的棒材代表250µm。（C） Western blot检测抗体特异性。尺寸标记显示在左侧。通道1：小鼠Brachyury网织红细胞裂解物翻译产物；通道2：未编程网织红细胞裂解物翻译产物；通道3：来自Brachyury网织红细胞裂解物翻译产物的免疫沉淀物质；车道4：车道3中免疫沉淀物质的上清液；泳道5：来源于第4天胚状体的免疫沉淀物质；泳道6：泳道5中的免疫沉淀物质的上清液；通道7：来自第4天类胚体的免疫沉淀物质，省略了第一抗体；车道8：车道7中免疫沉淀物质的上清液。所有免疫沉淀均使用Santa Cruz抗T C19。Western blots使用R&D Systems抗T作为一级抗体，使用SantaCruz D抗山羊IgG HRP连接的二级抗体。（D） 创建缺乏Brachyury的ES细胞克隆的策略。克隆是用65 bp的ShRNA双链体靶向腕表(T型). 将序列插入pSingle-ShRNA载体（Clontech）的XhoI/HindIII位点，该载体包括一个四环素控制的转录阻遏物，该阻遏剂反过来调节ShRNA序列的表达。通过在G418中培养选择稳定株系，并通过添加1µg/ml多西环素诱导ShRNA表达。（E） 含有靶向ShRNA结构的克隆的第5天类胚体提取物的Western blot分析Brachyury公司外显子1（T1）或该序列的扰乱版本（Ts），或者用强力霉素（+）治疗，或者不治疗（−）。样品按（C）所示进行免疫沉淀。注意3号车道上Brachyury带的缺失。
（畅通节能法）
表S7
原位杂交、T盒和电泳迁移率转移分析引物。
（文件）
