VI型胶原α5和α6链在人类肌肉和Duchenne肌营养不良相关肌肉纤维化中的表达

摘要

集锦

1.简介

胶原VI是一种细胞外基质蛋白，在大多数结缔组织中形成独特的微纤丝网络。长期以来，人们认为它由三条遗传上不同的α链（α1、α2和α3）组成，分泌到细胞外基质中，在那里形成延伸的微丝网络(Chu等人，1988年；Knupp和Squire，2001年). 胶原VIα1、α2和α3链形成异三聚单体，在细胞内组装成二聚体和四聚体。分泌后，丝由预先组装的四聚体的端到端相互作用形成，形成特征的串珠丝(布伦斯，1984年)通过旋转阴影电子显微镜技术显示(von der Mark等人，1984年；Sabatelli等人，2001年).

VI型胶原在维持骨骼肌功能完整性方面起着关键作用；事实上，COL6A1、COL6A2和COL6A3基因的突变会导致一组遗传性肌营养不良，即Ullrich先天性肌营养障碍（UCMD）(Camacho Vanegas等人，2001年)、Bethlem肌病（BM）(Jöbsis等人，1996年；兰普和布什比，2005年；Gualandi等人，2009年)和肌硬化性肌病(Merlini等人，2008年). 第6a1列^−/−小鼠完全没有VI型胶原链(Bonaldo等人，1998年；Gara等人，2008年)并表现出与自噬流量受损相关的肌病表型，自噬通量受损决定了肌浆网扩张和线粒体异常：这些表现出潜在的功能障碍，导致肌纤维凋亡增加(Irwin等人，2003年；Grumati等人，2010年). 此外，斑马鱼人类VI型胶原肌病模型出现肌病，并显示线粒体超微结构改变以及自发凋亡率增加(Telfer等人，2010年).

VI型胶原也被认为与组织重塑和伤口愈合有关，因为VI型胶原表达的变化在许多病理条件下都有报道，如肌肉和肝纤维化(Freise等人，2009年). 纤维化是营养不良肌肉中最显著的病理改变；它的特点是胶原蛋白和其他ECM成分过度积累，包括VI型胶原蛋白(Zanotti等人，2007年)并且受涉及细胞-细胞和细胞-基质相互作用的机制以及分泌到ECM的因子调节。TGF-β1是组织创伤愈合和纤维化的最有效调节因子之一(卡托内奥，2007年). 在损伤后再生肌肉和营养不良肌肉中高度表达，包括Duchenne肌营养不良患者和mdx小鼠(Zhou等人，2006年)携带由LAMA2基因突变引起的肌营养不良蛋白基因和MDC1A突变(Zanotti和Mora，2006年).

最近，发现了三种新的胶原VI链，α4、α5和α6(菲茨杰拉德等人，2008年；Gara等人，2008年). 新链在结构上类似于VIα3胶原链，每个链由七个VWA结构域组成，随后是一个胶原结构域、两个或三个C末端VWA域和链特异性结构域。在小鼠中，这种新型链表现出差异性和限制性表达(Gara等人，2011年). 由于Col6a1基因敲除小鼠没有在细胞外基质中沉积新的胶原VI链，因此有人提出，它们的组装和分泌需要α1链的存在，并且新的链可以替代α3链，可能形成（α1α2和α4）、（α1β2和α5）或（α1γ2和α6）异源三聚体(Gara等人，2008年，2011年). 由于大规模的心周倒置，3号染色体上的人类COL6A4基因被分成两段，成为一个未经处理的假基因(Wagener等人，2009年). 在人类中，COL6A5 mRNA的表达仅限于少数组织，包括肺、睾丸和结肠。相反，COL6A6 mRNA在广泛的胎儿和成人组织中发现，包括肺、肾、肝、脾、胸腺、心脏、骨骼肌、胰腺、睾丸和子宫(菲茨杰拉德等人，2008年). 迄今为止，仅在皮肤中研究了人类胶原蛋白VIα5链蛋白的表达，在皮肤表皮基底膜下方和血管周围的狭窄区域发现了胶原蛋白VI(Sabatelli等人，2011年). 早先有报道称α5链存在于表皮中(Söderhäll等人，2007年)，但这一观察受到质疑(Sabatelli等人，2011年). 在人类肾脏、骨骼肌和心肌、肺、血管、胰腺、脾脏和软骨中发现VIα6胶原蛋白的表达(Fitzgerald等人，2008年). 然而，VI型胶原依赖性疾病主要表现在肌肉中，新链在该组织中的精确定位尚未得到全面研究。人类体内另外两条VI型胶原链的发现，为细胞外基质中VI型胶原的功能增加了一层复杂性(菲茨杰拉德等人，2008年；Gara等人，2008年).

为了深入了解人类骨骼肌中α5和α6六型胶原链的表达和功能，我们研究了正常肌肉组织和细胞培养物中的这些蛋白质和相应的mRNA，以及由六型胶原基因的任何突变独立产生的明显纤维化的杜氏肌营养不良（DMD）肌肉中的这些蛋白和对应的mRNA。

2.结果

2.1. 正常骨骼肌VIα6胶原链的免疫荧光分析

为了评估人骨骼肌中α6链的组织分布，用抗α6链抗体对正常人胫骨前肌和比目鱼肌的冰冻切片进行染色。α6链定位于肌周和肌内膜，与同源α3链的标记相比，肌内膜中的模式不太均匀(图1a） ●●●●。抗α3和α6链抗体的双重标记显示部分共定位(图1b） 为了更好地表征α3和α6链的差异分布，我们用抗层粘连蛋白γ1链的抗体（肌纤维和血管基底膜的标记物）和抗胶原III（纤维基质的成分）的抗体进行了双重标记反应。α6链主要表现为间质，事实上，它在肌肉和血管的基底膜上都不存在，而与III型胶原共存(图1b） 。相反，α3链在肌纤维和血管的基底膜上检测到，因为它与层粘连蛋白γ1链共定位(图1b） ●●●●。

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图1

正常人胫骨前横肌段VIα6和α3胶原链的免疫荧光分析。

a： α6链在肌周和肌内膜中均有表达，肌纤维周围有不连续的模式。α3链免疫标记在肌周和肌内膜均呈弥散均匀分布。棒材，100μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

b： α6链标记在肌内膜中不连续（箭头所示），双重标记显示与抗α3链部分共定位。α3链抗体强烈染色基底膜，如层粘连蛋白γ1链的双重标记所示（合并图像中的黄色荧光）；α6链在相邻纤维间质中表达，在毛细血管和肌纤维的基底膜中缺失。与间质定位一致，α6链与III型胶原共定位。Bar，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

2.2. VIα5胶原链选择性定位于肌腱连接处的基底膜

免疫荧光分析显示，在胫骨前肌内膜和肌周膜中未检测到α5链(图2)然而，当我们分析一个来自比目鱼肌的样本时，我们发现α5链在肌腱连接处（MTJ）选择性表达，在那里它与层粘连蛋白α2链共存，层粘连素α2链是肌纤维基底膜的标记。用pFAK抗体获得的标记模式在MTJ选择性表达，在细胞质侧反映了MTJ水平细胞外侧的α5链信号(图2). α5链在连接外肌纤维基底膜和肌腱内缺失(图2). α6链也在肌腱连接处检测到，虽然不是作为一种特定的定位，而是作为肌内膜的连续标记。与α5链类似，肌腱内也没有α5链（数据未显示）。

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图2

人体肌肉中VIα6胶原的免疫荧光分析。

a： 胶原VIα5链在胫骨前（交界外，左侧面板）和比目鱼肌插入跟腱（MTJ，中间和右侧面板）的横截面的定位。α5链（绿色）不存在于胫骨前间隙，而选择性表达于比目鱼肌肌腱连接处（箭头），与层粘连蛋白α2链（红色）共定位，后者是基底膜的标记物。条形图，左面板和中面板为100μm，右上面板和下面板为20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

b条：用抗α5链（绿色）和抗pFAK（红色）抗体对插入Achille’s腱的比目鱼肌部分进行双重标记，表明α5链在肌腱连接的细胞外侧表达，pFAK标记集中在那里。合并后的图像显示了两种标记模式的清晰对应。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

2.4. 正常肌肉细胞培养中VIα5和α6链的表达

我们比较了在不同培养条件下，即生长48小时（增殖）或7天（长期）、添加或不添加0.25 mM L-抗坏血酸以及诱导肌源性分化后，原代正常肌肉细胞培养物中α5和α6链及其同源物α3链的表达和组织。在增殖样本和长期样本的细胞外基质中都检测到了α3链，但在长期培养中，微纤维网络似乎组织和发育得更好(图3a） ●●●●。在增殖的原代肌肉细胞培养物中未检测到α6和α5链（未显示）。在长期培养中，在细胞外基质中检测到轻微的丝状含α6的沉积物(图3b） α5链完全缺失（未显示）。α6抗体与α3阳性丝状结构共定位，但也可以检测到基于α3的独立网络(图3b） 。在增殖细胞和长期细胞中均未检测到COL6A5转录物。与增殖细胞相比，长期培养的COL6A3和COL6A6转录水平均增加（1.7:1 COL6A5和2.9:1 COL 6A3）(图3c） ●●●●。来自肌肉活检的原代培养物可能同时含有间质细胞和肌源细胞。为了评估哪些细胞产生α6链，在缺乏抗坏血酸的情况下对长期肌肉培养物进行分析，以诱导细胞内未羟基化胶原VI链的积累(Engvall等人，1986年). 与先前的一项研究一致，该研究确定间质细胞而非肌细胞产生VI型胶原(邹等人，2008)我们发现α3链在肌源性（结蛋白阳性）细胞中缺失，而在大多数结蛋白阴性细胞中积累。α6链仅在一部分结蛋白阴性细胞中的细胞内检测到，与α3链类似，在肌源性细胞中也不存在。有趣的是，大多数α6链产生细胞呈扁平状，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性，表明它们可能是肌成纤维细胞，可能起源于间质(图3d） ●●●●。

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图3

正常肌肉培养中VI型胶原α3和α6链的免疫荧光分析。

a： 在增殖和长期（抗坏血酸处理汇合后7天）样品的细胞外基质中均检测到VIα3胶原链（红色荧光），但在长期培养中，VI胶原网络的排列似乎更有条理。棒材，100μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

b： 抗坏血酸处理7天后，在肌肉培养物的细胞外基质中可检测到胶原VIα6链（红色荧光）沉积。包含α6的结构（箭头，左上面板）显示出丝状排列，如在高倍镜下检测到的那样（右上面板）。下部面板显示抗α6（红色荧光）和α3（绿色荧光）链抗体的双重标记。丝状α6链状结构（红色）与α3链状阳性微丝共存，如合并图像所示（右下图），但也可以检测到独立的α3链式网络（绿色荧光）。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

c： COL6A3和COL6A6转录物的实时PCR分析。报告值是使用ACTB和GAPDH作为参考转录物的两个不同实验的平均值。以下各项的相对比率COL6A3系列/肌动蛋白-GAPDH和COL6A6系列/增殖细胞中的肌动蛋白GAPDH mRNA被标准化为1。长期细胞中COL6A3和COL6A6转录水平均增加（COL6A2为1.7:1，COL6A1为2.9:1）。

d： 在无抗坏血酸处理的长期正常肌肉细胞培养中对VIα3和α6胶原链的免疫荧光分析。样品被双重标记为结蛋白（上面板，绿色荧光）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA；下面板，绿色萤光）。胶原VIα3链（红色荧光，左上图）似乎在结蛋白阳性细胞中缺失，在结蛋白阴性细胞中积聚，表明成纤维细胞是α3链的主要来源。类似地，结蛋白阳性细胞中不存在α6链（红色，右侧，上面板），但与α3链不同，它仅在细胞内结蛋白阴性细胞的子集中检测到。细胞生成胶原VIα6链（红色）对α-平滑肌肌动蛋白呈阳性（绿色，右侧，下图），表明它们可能是肌成纤维细胞。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

在分化条件下，α3链既存在于肌管周围的细胞外基质中，也存在于结蛋白阴性细胞的细胞质中。细胞质中这种蛋白质的存在可以归因于分化培养基中缺乏抗坏血酸(Lattanzi等人，2000年). 肌管细胞质内未检测到α3链，证实肌源性细胞不产生VI型胶原(邹等人，2008). α6链在细胞外基质中微弱地检测到，是一个发育不良的网络。一些结蛋白阴性细胞显示出细胞质标记，而肌管中没有蛋白质(补充图2). α5链在肌管和结蛋白阴性细胞中均未检测到，类似于增殖和长期培养（未显示）。这些数据强烈表明，α5和α6链的调节不受肌源性分化的影响。

2.5。TGFβ1诱导肌肉成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞强烈增加正常肌肉培养细胞外基质中胶原VIα6链的沉积

当应用于原代肌肉细胞培养时，TGFβ1是肌肉成纤维细胞激活的强烈诱导剂，并且可以诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞（获得α-SMA阳性表型）。相反，TGFβ1抑制肌源性分化。为了评估转化生长因子β1对新型VI型胶原链表达的影响，对正常初级肌细胞进行了10天的处理。正如预期的那样，我们检测到α-SMA阳性细胞的数量显著增加(图4a） ●●●●。相反，结蛋白表达减少，自发分化的肌管数量也减少（未显示）。在这些条件下，α6链的数量增加，分泌的蛋白质沉积在细胞外基质的宽丝状网络中(图4a） ●●●●。α6链主要与α3链共定位，但也可以检测到一个独特的含有α3链的网络(图4a） ●●●●。长期（10天）TGFβ1治疗后，细胞内COL6A3和COL6A6转录水平均显著降低（0.48:1 COL6O3和0.16:1 COL6 A6）。通过分析不同时间点的mRNA水平，我们发现从治疗24小时开始，COL6A6 mRNA的转录水平一直较低。不同的是，COL6A3 mRNA在24-48小时开始上调，随后TGFβ1延长治疗后逐渐降低(图4b） 。TGFβ1治疗在RNA和蛋白质水平上均未影响α5链的表达和合成（未显示）。

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图4

TGFβ1治疗后正常肌肉培养中α6链的免疫荧光和实时PCR分析。

a： TGFβ1治疗10天后，大多数间质细胞表达α-SMA（左上角，绿色荧光），表明转分化为肌纤维母细胞样表型。在缺乏抗坏血酸的情况下（右上图），大多数表达α-SMA的细胞在细胞内积聚VIα6链胶原蛋白（红色）。抗坏血酸处理后（左、右中面板），细胞外基质中大量分泌α6链（红色）并排列成宽丝状网络。TGFβ1处理样品10天后，左、右下面板显示抗α6和α3链抗体的双重标记。α6链（红色荧光）主要与α3链（绿色）标记共存。然而，还可以检测到独特的含α3−的网络（绿色荧光）。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

b条：实时PCR分析。报告值是使用ACTB和GAPDH作为参考转录本的两个不同实验的平均值COL6A3系列/肌动蛋白-GAPDH和COL6A6系列/未经处理的细胞中的肌动蛋白GAPDH mRNA归一化为1。长期（10天）TGFβ1治疗后，细胞内COL6A3和COL6A6转录水平显著降低（COL6O3为0.48:1，COL6A2为0.16:1）。对不同时间点的mRNA水平的分析显示，从治疗24小时开始，COL6A6mRNA的转录水平一直很低。相反，COL6A3 mRNA在24-48小时开始轻微上调，随后在延长TGFβ1治疗后逐渐降低。

2.6. 在营养不良的肌肉中，VI型胶原α6链上调，而不是α5链上调

由于肌成纤维细胞在纤维化中起着主要作用，我们研究了5名杜氏肌营养不良（DMD）患者肌肉活检中α6链的表达，DMD是一种以明显纤维化为特征的肌营养不良，绝对独立于VI型胶原基因的任何突变。由于缺乏组织，仅通过免疫荧光、Western blotting和mRNA分析对DMD815活检进行了研究。其他DMD患者通过免疫荧光加mRNA或免疫荧光加免疫印迹分析进行研究。

通过免疫荧光分析，α6链抗体显示所有DMD患者细胞外基质中的蛋白量增加(图5a和补充图3a). α6链定位于间质，事实上，在肌纤维和血管的基底膜上未检测到标记，如抗层粘连蛋白γ1抗体的双重标记所示(图5a） ●●●●。通过双重染色，α6链标记与III型胶原阳性区域相关，用作纤维化标记物。半定量分析显示，α6链的增加与III型胶原蛋白量之间有很强的相关性(补充图3b，c). 所有DMD患者的α3链也增加(图5b） 与纤维化程度相匹配。抗α3和α6链抗体的双重标记显示了部分共定位，并证实了血管和肌纤维基底膜中没有α6链。高倍镜下，在纤维化区域检测到含有α6和α3链的不同大小的纤维束，这些纤维束呈波浪状(图5c） 表明α6和α3链可能在纤维化时共同组装并协同重塑细胞外基质。Western blot分析证实了三名DMD患者（DMD815、DMD1112、DMD1179）中α3和α6链的增加。α1免疫印迹显示，α3和α6链蛋白水平的增加与VI型胶原的普遍增加相匹配(图6a） ●●●●。蛋白质增加与COL6A6转录水平的相关增加相匹配，在三个分析的DMD肌肉（DMD815、DMD1和DMD23、，图6b） 。然而，在转录水平上，纤维化DMD肌肉中COL6A3 mRNA的增加（2–4倍变化）显著低于COL6A6 mRNA的增长。相反，未检测到α5链和相应的转录物（未显示）。

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图5

DMD患者肌肉活检中α6链的免疫荧光分析。

a： 对三名Duchenne肌营养不良患者（DMD815、DMD1、DMD23）肌肉切片中的VIα6胶原链（红色）和层粘连蛋白γ1链（绿色）进行免疫荧光分析。α6链标记在肌内膜和肌周出现增加，其增加与纤维化程度相关。α6链定位严格为间质定位，与层粘连蛋白γ1链（右图，绿色荧光）（基底层的标记）没有共同定位就证明了这一点。棒材，100μm。

b： DMD815肌肉切片中胶原VIα3链的免疫荧光分析显示纤维化区域显著增加（红色荧光，左图）。用抗层粘连蛋白γ1链抗体双重标记（绿色），显示肌纤维基底层存在α3链（合并图像中的黄色荧光，右图）。

c： 高倍放大患者DMD815的肌肉切片，用抗胶原VIα6（红色荧光）和-α3（绿色荧光）链的抗体双重标记，显示存在包含α6和α3链的不同大小的波动/波浪状纤维束。在肌纤维的基膜中，只发现α3链（箭头所示）。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

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图6

DMD患者肌肉活检中VI型胶原链的Western blot和RT-PCR分析。

a： 健康对照组（CTRL1,2）和DMD815、DMD1112和DMD1179患者骨骼肌提取物的Western blot分析。在还原条件下用SDS-PAGE分离蛋白质，并用针对VI型胶原α6、α3和α1链的多克隆抗体检测蛋白质；肌动蛋白作为负荷控制。

b： DMD骨骼肌活检中COL6A6转录物的实时PCR分析。报告值是使用ACTB和GAPDH作为参考转录物的两个不同实验的平均值。The relative ratios ofCOL6A3系列/肌动蛋白-GAPDH和COL6A6系列/对照肌肉中的肌动蛋白GAPDH mRNA被标准化为1。DMD肌肉中VIα3和α6胶原链的增加与相应mRNA的增加相匹配。在三个分析样本中，COL6A6转录水平显示出10到14倍的变化，而COL6A3 mRNA水平的变化较低（2到4倍的变化）。

3.讨论

在人类中发现了两条额外的VI型胶原链（α5和α6），可能替代α3链，这表明VI型胶原存在额外的组装形式(菲茨杰拉德等人，2008年；Gara等人，2008年，2011年). 到目前为止，这种新型链在人类骨骼肌中的定位和表达模式尚不清楚，骨骼肌是受VI型胶原缺乏影响最大的组织，除了在商业上可获得的样品中报告的存在，例如胎儿人类骨骼肌提取物和来自正常成人人体组织板的非特定骨骼肌组织(菲茨杰拉德等人，2008年).

我们的研究旨在更精确地确定VI型胶原α5和α6链在成熟人体骨骼肌中的表达和分布。事实上，我们发现在人类骨骼肌中，α5和α6链在许多方面与同源的α3链不同，例如定位模式、细胞起源和参与肌肉纤维化后ECM重塑。区分不同的装配形式(Gara等人，2008年)，我们使用针对单个α3、α5和α6链的抗体(Sabatelli等人，2011年).

在正常骨骼肌切片中，α5链被选择性地检测到位于肌腱连接处的基底膜。我们以前的研究表明，α5链也定位于人类皮肤的结合部位，尤其是皮肤-表皮结合处(Sabatelli等人，2011年). 这些数据表明，含有α5链的VI型胶原微纤维可能在承受拉伸应力的特殊组织区域具有特定功能。肌腱连接是肌肉通过肌腱向骨骼元件传递机械力的关键元件。在该位点已鉴定出几种分子，其基因突变导致肌腱连接的病理变化：α7β1整合素、层粘连蛋白2和肌营养不良蛋白糖蛋白复合物在该位点起关键作用(Mayer等人，1997年；Pegoraro等人，2002年；Vainzof和Zatz，2003年). Tenascin是一种寡聚的细胞外基质蛋白，是首批肌腱连接标记物之一(Chiquet and Fambrough，1984年). 值得注意的是，tenascin XB基因突变会导致Ehlers–Danlos综合征(Zweers等人，2003年)肌肉无力、挛缩、VI型胶原继发性缺乏，与VI型胶原肌病表型重叠(Voermans等人，2007年)并指出这些肌腱连接成分之间可能存在功能性相互作用。因此，对已知突变阴性的埃勒-丹洛斯病患者进行α5基因突变筛查可能会产生吸引力。

α6链的丰度低于同源α3链。其定位主要为间质性，与α3链部分共定位。α6和α3链定位之间最相关的差异是肌纤维和血管基底膜中都没有α6链，相反，α3链是专门检测到的。考虑到连接外基底膜上也没有α5链，含有α3的微纤丝可能代表特定的基底膜VI型胶原。最近用VI型胶原特异性抗体进行的免疫电子显微镜研究支持了这一假设异源三聚体，证实了这种VI型胶原在骨骼肌纤维中的基底膜定位(Gara等人，2011年)和内皮细胞(Groulx等人，2011年). 有趣的是，从COL6A1、COL6A2和COL6A3基因突变的患者获得的UCMD/BM肌肉活检的特征是肌肉基底膜VI型胶原的缺失/减少(石川等人，2004年；Kawahara等人，2007年；Merlini等人，2008年；Gualandi等人，2009年). Ullrich先天性肌营养不良患者的肌纤维也检测到基底膜异常(Niiyama等人，2002年；Squarzoni等人，2006年)和肌硬化性肌病患者的血管中(Merlini等人，2008年). 这些数据表明，α1α2α3 VI型胶原在维持基底膜功能完整性方面起着关键作用。

正如软骨和皮肤所显示的那样，人类和小鼠肌肉中新链的表达也不同(菲茨杰拉德等人，2008年；Gara等人，2011年；Sabatelli等人，2011年). 人的α5链选择性地表达在肌腱连接处，而小鼠的α5链条在肌周强烈表达，在肌表稀疏表达，此外在肌内外周神经的神经束膜和神经肌肉连接的基底膜也有表达(Gara等人，2011年). 人和小鼠之间组织分布的差异可能是人类α4链基因缺失的结果，这导致其余链的功能重新定向。与此相反，α6链在人类和小鼠骨骼肌中的表达相似。与Col6a1基因缺失小鼠模型的研究报告一致，携带α1基因缺失突变的UCMD患者的骨骼肌中未表达α6胶原VI链。这一结果表明，与小鼠一样，在人类中，α6链与α1链共同组装(Gara等人，2008年).

为了确定细胞外基质中新型胶原VI链的组织，我们分析了正常骨骼肌培养物。只有在长期培养的细胞外基质中才能检测到丝状α6链沉积，其中含有α6链的网络不如含有α3链的网络丰富和组织。观察到共定位，表明分泌的α3和α6链可能共同组装并形成一个共同的网络，而不同的α3基网络的存在证实了组织切片中观察到的免疫组织化学模式。

在增殖和长期培养中，α5链在蛋白质和mRNA水平上均缺失。这可能是由于培养物的来源，事实上，我们用于建立原代培养物的肌肉碎片不包括肌腱连接。另一方面，α5链的缺失表明，在正常条件下，它对细胞基质粘附是不必要的，并且可能强调了该链对连接结构的特殊性。

我们确定了哪些细胞在原代肌肉培养物中合成α6链，因为其中既包含肌源性（结蛋白阳性）细胞，也包含间质（结蛋白阴性）细胞。可以通过省略抗坏血酸处理来识别胶原VI生成细胞(Prockop等人，1976年；Engvall等人，1986年)由于在这种情况下，他们显示出抗VI型胶原抗体的细胞内染色。α3链仅在结蛋白阴性细胞中积累，证实它是由间质而非肌源性细胞产生的(邹等人，2008). α6链在结蛋白阳性细胞中也不存在，但与α3链相反，α6链仅在一部分结蛋白阴性细胞中在细胞内检测到，这导致α-SMA阳性，可能是间质来源的肌成纤维细胞。

转化生长因子β1治疗诱导间质肌成纤维细胞转分化为肌成纤维表型(Zanotti等人，2010年)，我们评估了其对细胞外基质中α5和α6链表达和沉积的影响。治疗10天后，观察到α-SMA阳性细胞数量显著增加，表明治疗诱导了转分化。此外，TGFβ1处理诱导ECM中含有α6链的丝状网络显著增加，仅与α3链标记部分重叠。相反，即使在TGFβ1治疗后，α5链的表达仍然无法检测到。正如预期的那样，与α6链增加相反，结蛋白表达减少，自发分化的肌管数量也减少。

时间进程实时PCR实验显示，从TGFβ1处理24小时开始，COL6A6 mRNA水平下调，这表明在细胞培养模型中，尽管发生了很早的诱导，但蛋白质数量的增加不能归因于TGFβ2对COL6A转录的直接影响。

先前的研究报告称，TGF-β1体外治疗可诱导几种VI型胶原相互作用蛋白的表达，如I型胶原和IV型胶原(Evans等人，2003年)，二聚糖(Todorova等人，2011年)，以及纤连蛋白和整合素(Reinboth等人，2006年；本田等，2010年). TGF-β1治疗可能通过诱导VI型胶原相关蛋白提高α6链的细胞外结合/组装效率，从而增加细胞外基质的沉积。

我们的结果表明，肌成纤维细胞是主要的α6链生成细胞，TGF-β1治疗可增强α6链分泌，提示α6链可能参与纤维化(Wipf和Hinz，2008年). 纤维化是营养不良肌肉的一种显著病理变化。其特点是胶原蛋白和其他ECM成分（包括胶原蛋白VI）过度积累。为此，我们评估了三名不同程度纤维化的DMD患者肌肉活检中α5和α6链的表达。我们发现，纤维化肌肉中VI型胶原普遍增加，尤其是DMD肌肉中α6链在蛋白质水平上强烈上调，如Western blot、实时PCR和免疫化学分析所示。由于未检测到与基底膜标记物共定位，α6链的增加在纤维化区域尤其明显，并在肌内膜处保持间质定位。

基于与α3链的高度同源性，胶原VIα5和α6链可能与α1和α2链相互作用，这与先前对Col6a1敲除小鼠的研究一致(Gara等人，2008年，2011年)和在人类皮肤上(Sabatelli等人，2011年). 这可能会产生同源异源三聚体，其功能似乎不同，很可能与组织粘附有关。具体来说，在人类骨骼肌中，我们假设含有α3的VI型胶原参与基底膜与间质细胞外基质的粘附；含有α5的VI型胶原参与肌腱连接处和皮肤-表皮连接处的连接粘连，而含有α6的VI型胶原蛋白与纤维性胶原相关，在肌腱内膜的粘连和纤维化的发展中起作用。未来的研究将关注新型胶原VI链在人类疾病中的作用。此外，由于我们的数据表明α5和α6链在特定ECM结构中具有特定作用，即与拉伸应力相关的α5和与ECM纤维化重塑相关的α6，因此它们可能分别代表监测这些应激事件的新生物标记物。

4.实验程序

4.6. 蛋白质印迹分析

从两名健康捐赠者和患者DMD815、DMD1112和DMD1179的骨骼肌活检中制备冰冻切片（20μm）。通过在70°C下在含有50 mM Tris–HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、2%SDS、1%Triton X-100、0.5 mM二硫苏糖醇、1 mM乙二胺四乙酸、10%甘油和蛋白酶抑制剂的裂解液中培养10分钟来提取切片。使用“BCA蛋白质测定试剂盒”（Pierce）测定每个样品的总蛋白质含量。样品用5%β-巯基乙醇还原，并用SDS-PAGE在3-8%（w/v）梯度聚丙烯酰胺凝胶上分离。使用兔体内开发的亲和纯化抗体检测胶原VIα3和α6链(Sabatelli等人，2011年). 使用特定的VIα1胶原抗体（H-200，Santa Cruz Biotechnologies）检测VIα1胶原蛋白链。作为负荷控制，使用肌动蛋白（Sigma）。使用与辣根过氧化物酶缀合的二级抗体（GE Healthcare），并通过化学发光检测条带（SuperSignal West Pico，Pierce）。

以下是与本文相关的补充材料。

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补充图1

UCMD患者胫骨前肌层粘连蛋白γ1链（左图）、胶原VIα1α2α3链（中图）和胶原VIα6链（右图）的免疫荧光分析COL6A1系列该基因显示肌肉和毛细血管中完全没有VI型胶原链，相反显示正常的层粘连蛋白γ1标记。棒材，20μm。

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补充图2

肌源性分化7天后，对正常肌肉培养物中的VIα3胶原（左面板，红色）和α6链（右面板，红色。结蛋白抗体（绿色）双重标记显示有效的肌源性分化，如多核肌管的存在所示。α3链（红色，左上下面板）存在于肌管周围的细胞外基质和结蛋白阴性细胞的细胞质内。分化肌管内部（左下面板）未检测到红色标记。α6链在细胞外基质中隐约可见。一些结蛋白阴性细胞显示出细胞质标记（箭头，右下面板），而肌管中没有蛋白质。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

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补充图3

a： 对DMD1179和DMD1112患者的肌肉切片进行免疫荧光分析，结果显示，两次营养不良活检的肌内膜中都有显著的α6链沉积。棒材20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。b： 正常对照CTRL2、DMD1112、DMD1179和DMD815患者肌肉切片中III型胶原的免疫荧光分析。与对照组CTRL2相比，表明结缔组织增生的III型胶原在所有DMD患者的肌内膜和肌周出现增加。棒材20μm。c： VI型胶原α6链和III型胶原阳性区域的半定量分析的图形表示，表明DMD患者III型胶原的增加与α6链蛋白量之间存在强烈的相关性*P<0.05。

与本文相关的补充材料可以在网上找到doi:10.1016/j.matbio.2011.12.003.

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