结构。2012年3月7日;20-135(3-3): 414–428.
ESCRT-I的UBAP1亚单位通过SOUBA域与泛素相互作用
,1,4 ,2,4 ,1 ,1 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,1 ,三 ,三 ,1 ,1,∗和2,∗∗
莫妮卡·农场主
1英国伦敦SE1 9RT国王学院伦敦医学院传染病系
尼古拉斯·索勒
2英国剑桥大学分子生物学MRC实验室CB2 0QH
安娜·卡巴莱
1英国伦敦SE1 9RT国王学院伦敦医学院传染病系
托尼亚·库克
1英国伦敦SE1 9RT国王学院伦敦医学院传染病系
斯特凡·M。弗伦德
2英国剑桥CB2 0QH分子生物学MRC实验室
标记D。艾伦
2英国剑桥CB2 0QH分子生物学MRC实验室
马克·拜克罗夫特
2英国剑桥CB2 0QH分子生物学MRC实验室
奥尔加·佩里西奇
2英国剑桥CB2 0QH分子生物学MRC实验室
于晔
2英国剑桥CB2 0QH分子生物学MRC实验室
贝珊·麦克唐纳
1英国伦敦SE1 9RT国王学院伦敦医学院传染病系
哈特穆特·谢尔
三Miltenyi Biotec,51429 Bergisch-Gladbach,德国
凯·霍夫曼
三Miltenyi Biotec,51429 Bergisch-Gladbach,德国
斯图亚特·J。D.尼尔
1英国伦敦SE1 9RT国王学院伦敦医学院传染病系
胡安·马丁·西洛
1英国伦敦SE1 9RT国王学院伦敦医学院传染病系
罗杰·L。威廉姆斯
2英国剑桥CB2 0QH分子生物学MRC实验室
1英国伦敦SE1 9RT国王学院伦敦医学院传染病系
2英国剑桥CB2 0QH分子生物学MRC实验室
三Miltenyi Biotec,51429 Bergisch Gladbach,德国
4这些作者对这项工作贡献均等
2011年8月22日收到;2011年12月13日修订;2011年12月30日接受。
- 补充资料
文件S1。图S1、表S1-S3和补充实验程序
GUID:303D29C3-049F-46FF-9D03-67C70D110C82
总结
运输所需的内体分选复合体(ESCRT)有助于泛素化货物的内体分拣、MVB生物发生、胞质分裂晚期和逆转录病毒出芽。这里我们显示,泛素相关蛋白1(UBAP1)是人类ESCRT-I的一个亚单位,与Vps23/TSG101、VPS28和VPS37在稳定的1:1:1:1复合物中结合。UBAP1 C端区域的X射线晶体结构揭示了一个我们描述为重叠UBA螺线管(SOUBA)的畴。核磁共振分析表明,构成SOUBA的三个刚性排列的重叠UBA分别与泛素相互作用。我们证明,含有UBAP1的ESCRT-I对于通过病毒对抗手段,即HIV-1辅助蛋白Vpu和卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)泛素连接酶K5,降解抗病毒细胞表面蛋白,如栓蛋白(BST-2/CD317)至关重要。
集锦
► ESCRT-I亚单位UBAP1对抗病毒蛋白链蛋白的降解至关重要►UBAP1有一个由重叠UBA(SOUBA)螺线管组成的结构域►SOUBA中的三个UBA中每一个都与单泛素结合
结果
含UBAP1的ESCRT-I配合物的组成和化学计量
重组全长人UBAP1,在大肠杆菌与ESCRT-I亚基VPS28、TSG101和VPS37A形成一个稳定的复合体,四个亚基的化学计量比为1:1:1:1(B类;图S1在线提供)。VPS37A、VPS37B、VPS37 C或VPS37D的核心都能与UBAP1形成稳定的重组ESCRT-I复合物大肠杆菌(图S1A) ●●●●。在含有TSG101的复合物中,从HEK293细胞裂解液中洗脱出接近440kDa标记物的内源性UBAP1(图S1B) ●●●●。此外,内源性UBAP1与TSG101和VPS37A有效共纯化,该细胞系稳定表达带有One-Strep标签的TSG101(OSHA-TSG101)(C) ●●●●。OSHA-TSG101融合物在这些细胞中以内源性水平表达(麦当劳和马丁·西洛,2008年),允许在生理条件下亲和纯化TSG101-结合蛋白。同样,当这些蛋白在293T细胞中过度表达为GST融合并用谷胱甘肽珠纯化时,内源性TSG101也结合UBAP1和VPS28(图S1C) ●●●●。正如其他ESCRT-I亚单位所观察到的那样,UBAP1通过将ESCRT机制的一个成分直接融合到缺陷的Gag蛋白中来拯救L域缺陷的HIV-1,从而在跨补体分析中从功能上招募ESCRT机制(Martin-Serro等人。,2001). 融合到互补Gag蛋白C末端的UBAP1的表达恢复了感染性病毒的产生(图S1E–S1H)。
重组蛋白的缺失分析表明,UBAP1的N末端片段包含残基1到68,足以与TSG101、VPS28和VPS37A形成稳定的复合物(D) ●●●●。此N端构造对应于UMA域(A) ●●●●。UMA结构域过度表达构建YFP-UBAP11至68和YFP-UBAP11-92在293T细胞中,转染HIV-1前病毒DNA的细胞具有明显的负效应,导致HIV-1感染性病毒释放受到约5倍的抑制(图S1D) ●●●●。这表明,UBAP1的ESCRT-I结合区的过度表达破坏了内源性ESCRT-1的化学计量组成或适当定位,从而抑制了HIV-1的出芽,如TSG101所示(Martin-Serro等人。,2003).
为了鉴定与其他ESCRT-I亚单位相互作用所必需的UMA残基,我们测试了该结构域几个保守残基中的点突变子形成ESCRT-1复合物的能力(UMA突变子M1到M4A) ●●●●。鉴于酵母Mvb12与Vps37直接接触(Kostelansky等人。,2007),我们测试了UMA突变体组装成包含VPS37A或VPS37B的ESCRT-I复合物的能力。用表达GST-TSG101、Myc-VPS28、HA-VPS37A/B和HA-UBAP1的质粒转染细胞,然后用谷胱甘肽包被珠纯化并免疫检测标记的ESCRT-I亚单位。丙氨酸取代基L17D类18D类19/AAA和V20P(P)21F类22/AAA(突变体M1和M2)导致ESCRT-I结合的完全阻断(E、 车道4至7),而F28A(突变M3)没有(E、 车道8和9)。有趣的是,当HA-VPS37B被共转染时,保守的Glu-59(E59A,突变体M4)的突变导致与ESCRT-I的结合丢失,而当HA-VPS37A存在于蛋白质复合物中时,则没有(E、 通道10和11),表明VPS37亚单位直接与UBAP1相互作用。这些结果通过HIV-1转补体分析得到证实,表明与野生型UBAP1或M3相比,将携带突变M1、M2或M4的UBAP1构建物融合到Gag并不能恢复新生缺陷HIV-1的释放,这表明UBAP1与ESCRT-I组分的相互作用需要这些残基(图S1H) ●●●●。
UBAP1在抗病毒蛋白Tetherin MVB分类中的作用
鉴于ESCRT机制在分选泛素化膜蛋白中的作用,我们测试了UBAP1在这一过程中的功能。我们利用了几种病毒的能力,通过ESCRT机制减少了感染细胞中抗病毒蛋白系链蛋白的细胞表面表达。第一种实验方法是基于HIV-1的Vpu调节栓系蛋白降解的能力。因此,用UBAP1特异性siRNA或非靶向对照处理稳定表达人类系链蛋白(293T/系链蛋白)的293T细胞,然后作为对照感染HIV-1(HIV-1 wt)或Vpu缺陷型HIV-1。然后对Tetherin进行免疫沉淀、去糖基化,并通过western blot进行可视化。正如预期的那样,感染HIV-1野生型的细胞大大降低了栓系蛋白的水平(A) ●●●●。然而,这种栓蛋白降解在感染HIV-1野生型病毒的UBAP1缺失细胞中被阻止,并且在这些细胞中检测到大量栓蛋白。UBAP1缺失、HIV-1感染的细胞中的这种系链蛋白是高度泛素化的(比较B) 这表明,在缺乏UBAP1的情况下,MVB途径的泛素依赖性排序受到抑制。感染Vpu缺陷型HIV的细胞中的Tetherin水平很高,与未感染的细胞相似。尽管感染野生型HIV-1的UBAP1缺失细胞中的栓系蛋白水平恢复,但病毒释放没有受到影响(C) ●●●●。正如预期的那样,在栓系蛋白表达细胞中,Vpu缺陷病毒的释放效率约为野生型病毒的100倍(Neil等人。,2008)UBAP1耗竭对此没有影响。这些结果表明,尽管Vpu诱导了栓蛋白靶向UBAP1依赖的ESCRT介导的降解,但栓蛋白的最终破坏并不是Vpu对抗其抗病毒活性所必需的。相反,它表明Vpu与系链蛋白的相互作用(在UBAP1/ESCRT-I招募之前)通过将其连接到内胚体途径使蛋白质失活,而内胚体通路使其无法逃逸回细胞表面以抑制病毒释放。此外,栓系蛋白在UBAP1缺失细胞中限制HIV-1 delVpu释放的能力相当,这表明这种敲除对栓系蛋白向质膜的转运没有显著影响。
UBAP1对病毒对抗引起的Tetherin降解至关重要
(A) Tetherin从稳定表达Tetherin的293T细胞中免疫沉淀。这些细胞未感染(未感染)、感染HIV-1(HIV-1wt)或Vpu缺陷型HIV-1(HIV-1delVpu),并用不相关的对照siRNA(Cont)或抗UBAP1的siRNA(UBAP1Q3和UBAP1Q4)处理。蛋白质印迹显示免疫沉淀的系链蛋白(上图)、siRNA介导的内源性UBAP1沉默(上图)和作为蛋白质负载对照的HSP90(下图)。
(B) 从感染HIV-1(HIV-1 wt)的细胞中免疫沉淀Tetherin,并转染表达HA标记泛素和对照(cont)或UBAP1特异性siRNA(UBAP1 Q3)的质粒。用抗HA抗体(顶面板,THN-Ubn)观察Tetherin泛素化。作为对照,同样的分析是在感染了Vpu缺陷型HIV-1(HIV-1 delVpu)并用无关siRNA(Cont)处理的细胞中进行的。底部面板显示免疫沉淀栓蛋白、UBAP1耗竭和微管蛋白作为负荷控制。
(C) 感染性HIV-1病毒产生量通过接种TZM-bl指示细胞进行测量,并表示为相对发光单位(R.L.U.)。误差线表示与三个独立实验平均值的标准偏差。另请参见表S2.
确定UBAP1在内胚体分选中功能的第二种方法涉及K5,一种KSHV编码的泛素连接酶,可减少栓系蛋白的细胞表面表达(Mansouri等人。,2009; Pardieu等人。,2010). 我们在HT1080细胞中采用敲除方法,稳定表达除K5(HT1080/HA-THN/K5)外的HA-tetherin结构。定量western blot分析用于测量这些细胞中HA-乙醚的总水平。正如预期的那样,表达K5泛素连接酶的细胞的HA-tetherin水平要低得多(A、 下部面板)。靶向UBAP1的siRNAs转染阻止了K5介导的栓系蛋白降解,栓系蛋白水平显著降低(下面板A) ●●●●。重要的是,当相同的siRNAs转染到缺乏K5的细胞中时,没有发现HA-tetherin的变化。作为对照,TSG101的耗竭还导致K5对HA-乙醚降解的损害(A) ●●●●。与Vpu数据一致,在UBAP1和TSG101缺失细胞中都积累了高分子量的栓蛋白,这表明该蛋白是泛素化的物种(A) ●●●●。与UBAP1缺失细胞内体分选抑制作用一致,HA-聚醚在细胞内点状物中积累,显示与晚期内体标记物CD63和泛素部分共定位(B) TSG101-缺失细胞中也观察到这种表型。总的来说,这些结果表明,UBAP1是泛素化货物蛋白即栓蛋白的MVB分选所必需的。
UBAP1耗竭防止K5-介导的Tetherin降解
(A) HT1080细胞裂解物的Western blots,其来源于单独稳定表达HA-tetherin(HT1080:HA-THN)或与K5结合(HT1080:HA-THN/K5)的细胞,并用siRNAs对无关对照(cont)、TSG101或UBAP1进行处理。用抗HA抗体检测THN-HA,以微管蛋白作为负荷对照,并用Li-Cor荧光偶联650 nm和800 nm二级抗体进行可视化。图表显示了成熟栓系蛋白水平的百分比,归一化为微管蛋白负荷。误差线表示与三个独立实验平均值的标准偏差。下部面板显示TSG101和UBAP1的耗竭,以及作为负荷控制的微管蛋白。
(B) 共聚焦免疫荧光显示用对照siRNA-、TSG101-或UBAP1特异性siRNA处理的细胞中栓系蛋白、CD63和泛素的定位。TSG101-和UBAP1处理的面板中显示了框区的更高放大率。在覆盖面板中,DNA显示为蓝色,系链蛋白显示为绿色,CD63或泛素显示为红色。另请参阅表S3.
HIV-1出芽或细胞分裂不需要UBAP1
我们还测试了UBAP1在另外两个ESCRT促进的过程中的作用,即HIV-1出芽和胞质分裂期间中体的分解。令人惊讶的是,用两种不同的siRNAs去除UBAP1(蛋白质水平下降92%以上)并没有显著改变HIV-1的出芽,而TSG101的去除如预期的那样抑制了感染性HIV-1产生(A) ●●●●。在胞质分裂中也得到了类似的负面结果:尽管耗尽了对胞质分裂至关重要的一种与ESCRT相关的蛋白hIST1(Agromayor等人。,2009; Bajorek等人。,2009),导致胞质分裂失败和多核细胞积聚,UBAP1缺失没有(B) 。UBAP1缺失对胞质分裂没有影响,这与最近报道的结果一致(Stefani等人。,2011). 对这种表型缺失的一个可能解释是,siRNA处理细胞中UBAP1蛋白的残留量可能足以支持ESCRT-I功能,但对照实验中类似程度的耗竭导致内胚体缺陷(如上所示)的事实反驳了这种可能性。
UBAP1在ESCRT-I介导的HIV-1释放和细胞分裂中的作用
(A) HIV-1前病毒与无关siRNA(Cont)、针对TSG101的siRNA或针对UBAP1的两种不同siRNA共表达时,感染性病毒释放。Western blot显示细胞内TSG101、UBAP1和HSP90(蛋白质负载控制)以及细胞内(细胞裂解物)和病毒相关(病毒)HIV Gag蛋白。
(B) 用无关对照siRNA(Cont)、抗hIST1的siRNA(阳性对照)或两种不同的抗UBAP1的siRNA中的任何一种处理后,对多核细胞进行定量。至于(A),western blot显示siRNA介导的内源性hIST1、UBAP1和HSP90沉默作为蛋白质负荷控制。误差线表示与三个独立实验平均值的标准偏差。
UBAP1是泛素结合ESCRT-I亚单位
UBAP1在内胚体分选中的特殊需求以及从细胞中去除UBAP1后泛素化产物的积累表明,UBAP1可能通过ESCRT-I促进泛素化物的识别。我们在无标签的装置中,使用等温滴定量热法(ITC)检查溶液中的泛素结合。使用UBAP1的重组片段,仅包含提议的UBA包含区域(残基389至502),与泛素相互作用的Kd约为70μM(A) ●●●●。这是在通常观察到的与单泛素结合的UBA结构域的20-1300μM范围的高亲和力端。此外,这是ESCRT途径中UBD之间相对较高的亲和力。我们还测量了含有TSG101亚基的ESCRT-I复合物中单泛素与全长UBAP1的结合,其中N末端泛素结合UEV结构域被删除,以避免TSG101与泛素结合。ESCRT-I/UBAP1与单泛素相互作用的表观Kd约为140μM(B) ●●●●。由于许多UBA与K48键联的双泛素结合的亲和力明显高于单泛素(K48键合双泛素的典型Kds为1–10μM),并且一些UBA与K63键联的二泛素结合,因此我们对无标签的K48键或K63键联双泛素与SOUBA的结合进行了ITC实验。我们发现这些双泛素结合分离的SOUBA的亲和力与单泛素相当().
泛素与UBAP1的结合
人类UBAP1 SOUBA结构域(389–502)或包含ESCRT-I复合物的UBAP1的结合,包括全长UBAP1、VPS28(全长)、TSG101(198–390,即缺乏UEV结构域)和VPS37A(229–397,即缺乏EUV结构域。实验数据(正方形)使用一组独立位点的结合模型进行拟合。平均Kd和标准偏差由三个独立测量值计算得出。
(A) ITC滴定含有UBAP1-SOUBA结构域(389-502)的细胞中的单泛素,温度图显示在顶部,积分峰显示在底部。
(B) ITC滴定含有全长UBAP1的ESCRT-I细胞中的单泛素:温度图(顶部)和积分峰(底部)。
(C) 将SOUBA结构域滴定到含有K63双泛素的细胞中:温度图(顶部)和积分峰(底部)。
(D) 将SOUBA结构域滴定到含有K48双泛素的细胞中:温度图(顶部)和积分峰(底部)。
UBAP1 C末端UBA区的结构分析
UBAP1有两个M/L-G-F/Y基序的拷贝,最近通过突变显示其对内体分选很重要(Stefani等人。,2011). 为了深入了解该区域的结构和功能,我们确定了其晶体结构,并通过核磁共振表征了其与溶液中泛素的结合。覆盖UBAP1 C末端的两个结构体(残基381-502和389-502)产生了大量蛋白质,但没有结晶。因此,我们使用了表面熵减少方法(Derewenda,2011年)由SERp服务器指导(Goldschmidt等人。,2007) (http://services.mbi.ucla.edu/SER网站)产生几个突变体,其中带电表面残基簇被突变为丙氨酸。其中一个突变株415-KKGE-418突变为AAGA,很容易结晶。UBAP1中含有UBA的C末端区域的1.65μl分辨率晶体结构在不对称单元中有两个分子,它们通过二硫键相互连接。然而,多角度激光散射表明该分子是溶液中的单体(数据未显示)。似乎二硫键二聚体是随着蛋白质在结晶过程中氧化而形成的。该结构显示了一个由七个α螺旋组成的单域,这些螺旋排列成右手螺线管,其中包含三个重叠的UBA(UBA1、UBA2和UBA3)(A) ●●●●。据我们所知,我们将把这个新领域称为重叠UBA(SOUBA)的螺线管。SOUBA褶皱与传统UBA的关系可以通过将一个UBA的第三螺旋视为下一个UBA的第一螺旋来最好地描述(A和6B)。有几个例子表明,蛋白质具有多个UBA,这些UBA由低复杂度的连接子连接,可能是结构紊乱的。然而,这是重叠UBA刚性阵列的第一个示例。三个UBA的螺线管布置形成一个凸面,其中包含每个UBA的一个和三个螺旋。对面形成一个凹面,由每个UBA的第二个螺旋线构成。每个UBA中螺旋线之间的角度在其他UBA的观察范围内。因此,每个成分UBA都与其他蛋白质的UBA结构很好地对齐(C) ●●●●。
重叠UBA构建紧凑的SOUBA域
(A) UBAP1 SOUBA域(389–502)概述,显示三个重叠UBA域的串联排列,从N端(蓝色)到C端(红色)呈彩虹色。
(B) UBAP1的三个UBA结构域中的每一个都与另外三个特征良好的UBA结构区进行序列比对。UBA特征基序残基以红色显示,并在(A)中表示为棒状。SOUBA晶体结构中突变的残基显示为蓝色背景。
(C) 三个UBAP1 UBA域中的每个域与序列比对(B)中存在的三个先前报告的UBA域进行结构比对,即浅灰色的Ubiquilin1(2JY5)、中灰色的DSK2 UBA(2BWB)和深灰色的HHR23A UBA2(1DV0)。另请参见.
SOUBA和泛素的相互作用
化学位移扰动(CSP)15添加未标记的SOUBA后,N标记的泛素显示泛素(包括Ile44和Val70)表面疏水性斑块中的残基移位(A–7C)。对多种UBA与单泛素相互作用的广泛结构分析表明,UBA上的相互作用表面通常包括两个疏水性UBA斑块,分别位于螺旋末端α1/loop 1和螺旋末端α3(Zhang等人。,2008). 与K48连接的多泛素结合通常包括α2和α3另一侧的额外补丁。的CSP15N标记的SOUBA结构域加上三摩尔当量的未标记单泛素表明,三个重叠的UBA中的每一个都受到泛素结合的影响(D–7F)。表现出最大扰动的残基位于SOUBA结构域的凸面上,覆盖了一个扩展的疏水表面(F) ●●●●。特征性M/L-G-F/Y基序位于SOUBA结构域的一侧,CSP表明这些残基与泛素结合有关。这与已经报道的来自其他蛋白质的UBA的泛素结合一致(Long等人。,2008; Ohno等人。,2005; Varadan等人。,2005; Zhang等人。,2008). UBAP1 SOUBA中的第二个UBA缺少签名基序,相反,它在类似位置有一个KGF序列。然而,CSP映射表明,KGF基序也参与泛素结合,因为它在泛素结合的所有残基中具有最高的CSP。除了这些特征基序中的残基之外,SOUBA同一面上的其他残基也显示出大于0.2 ppm的CSP。对于UBA1和UBA2,几乎所有这些残基都位于UBA内第一螺旋的末端和第三螺旋的一面。虽然UBA结构域第三螺旋中的“双亮氨酸”基序是第二个通用的特征基序,但SOUBA中的等效残基(UBA1中的残基427-LF、UBA2中的461-LQ和UBA3中的495-LM)在泛素结合上没有显示大的CSP。每个基序中的亮氨酸都参与疏水核中的螺旋堆积。我们在UBA1和UBA2中观察到的最大CSP与之前描述的UBA/单泛素相互作用表面的典型相互作用一致。然而,SOUBA UBA3的所有三个螺旋上都有较大CSP的残基分布更广,包括一个被称为第三个UBA螺旋“背面”的区域。这可能是由于第三个UBA在泛素结合上的构象变化,或者由于一个额外的泛素结合位点。
核磁共振化学位移微扰法检测UBAP1与泛素的相互作用
(A) HSQC光谱叠加15无标记UBAP1 SOUBA的2.5摩尔当量(黑色)和存在(红色)的N-标记单泛素。对具有显著化学位移变化的酰胺共振进行了注释。
(B) 化学位移扰动(CSP)图15N标记的泛素作为残基数的函数。脯氨酸残基(无可用数据)的赋值为0 ppm,并用星号标记。
(C) 单泛素的CSP映射到其结构上。
(D) HSQC光谱叠加15在没有(黑色)和(红色)三摩尔当量的未标记泛素的情况下,使用N-标记的SOUBA。
(E) 的CSP图15N标记的SOUBA作为残数的函数。
(F) SOUBA的CSP映射到其结构。
(G–J)连接到K6C(G)和K48C(I)突变体泛素的自旋标记诱导的SOUBA/Ub复合物中的顺磁弛豫增强效应。该图绘制了添加SL-泛素后在SOUBA中观察到的实验PRE与残留数的关系。K6C-SL(H)和K48C-SL。K6和K48的侧链(突变为Cys用于自旋标记)显示为鲑鱼杆。
通过顺磁弛豫增强(PRE)测量直接探测SOUBA中三个UBA结构域与泛素的结合,并研究SOUBA和单泛素在复合物中的相对取向。将顺磁性自旋标记(SL)附着在泛素中取代赖氨酸的半胱氨酸残基上,以便在SL附近的细胞核中诱导强烈的信号衰减。描述了SOUBA中的信号衰减,该复合物的泛素自旋标记在任一残基6(K6C突变,G和7H)或残基48(K48C突变,I和7J)与其中SL探针被抗坏血酸灭活的相同复合物相比。结果清楚地显示了K6C-SL泛素的三个显著衰减区域(对应于螺旋1的末端和螺旋1和螺旋2之间的环;螺旋3的末端和螺旋3和螺旋4之间的环;螺旋5的末端和螺旋5和螺旋6之间的环)。在含有K48C-SL泛素的SOUBA上观察到四个衰减区域(螺旋1和螺旋2之间的环;螺旋3的末端和螺旋3和螺旋4之间的环,螺旋5的末端以及螺旋5和螺旋6之间的环以及螺旋7的末端)。K48C-SL的额外信号衰减表明K48C泛素的自旋标签在空间上靠近每个UBA基序的两个区域。D39C和S57C自旋标记的单泛素没有观察到顺磁效应。SOUBA与三个单泛素分子结合的模型揭示了SL如何实现观察到的效果(H和7J)。PRE测量值似乎与Zhang等人。(2008)当SL用于研究泛素-1的UBA结构域与单泛素的结合时。值得注意的是,SL与突变泛素的结合并不影响它们与SOUBA相互作用的能力。核磁共振波谱的比较15在存在WT-Ub和SL-Ub(K6C、K39C、K48C和K57C)的情况下,N-SOUBA表明观察到相同的CSP和弛豫状态。
讨论
本研究中的结果表明,重组UBAP1与TSG101、VPS28和VPS37组装成化学计量比为1:1:1:1的复合物,重要的是,在体内还观察到与内源性UBAP1和剩余ESCRT-I亚单位的生理水平的相互作用。用抗TSG101的siRNA处理的细胞中TSG101和UBAP1的编码完成表明内源性UBAP1通过与TSG101相互作用而稳定。此外,UBAP1以TSG101-依赖的方式在功能上招募ESCRT机制的能力为UBAP1和ESCRT-I之间的功能联系提供了进一步的证据。根据这些观察结果,我们提出UBAP1是人类ESCRT-I的一个稳定亚单位。在编写这份手稿时,Woodman和他的同事报告了与我们的结果完全一致的发现(Stefani等人。,2011).
在重组系统中,UBAP1可以与TSG101、VPS28和四个VPS37亚基中的每一个形成异四聚物复合物。我们的结果还表明,瞬时转染的VPS37A和VPS37B在293T细胞中形成含有UBAP1的复合物。类似地,最近对HeLa细胞中表达的UBAP1的研究表明,它与VPS37A形成复合物。然而,同样的研究没有检测到UBAP1与VPS37C复合物的形成(Stefani等人。,2011). 这可能意味着诸如翻译后修饰等其他因素可以调节细胞中UBAP1和VPS37亚单位之间的关联。对于不同VPS37亚基或竞争MVB12A和MVB12B的组织分布和细胞丰度知之甚少,所有这些都可能影响与UBAP1的关联。
UBAP1的功能仅用于降解泛素化的内体货物,而不用于其他ESCRT-I介导的过程,如中体脱落或病毒芽变。更具体地说,我们表明,含有UBAP1的ESCRT-I复合物被病毒免疫调节蛋白寄生,这些蛋白以宿主膜蛋白为靶点,以进行内体降解,特别是通过HIV-1 Vpu和KSHV K5泛素连接酶对抗病毒蛋白系链蛋白的靶向破坏。UBAP1在K5功能中的重要作用与之前的研究结果完全一致,这些研究结果表明,系链蛋白通过其细胞质尾部的单个赖氨酸受到ESCRT依赖性破坏(Mansouri等人。,2009; Pardieu等人。,2010). 相比之下,Vpu参与栓系蛋白降解和拮抗的途径还不太清楚(Martin-Serrio和Neil,2011年). 尽管早期研究表明,Vpu可诱导栓蛋白的蛋白酶体降解(Goffinet等人。,2009)最近的报告显示,在HIV-1感染的细胞中,系链蛋白以溶酶体为靶点(Douglas等人。,2009; Iwabu等人。,2009; Mitchell等人。,2009)其失活依赖于与Hrs的关联(ESCRT-0)(Janvier等人。,2011). 我们证明UBAP1对Vpu诱导的系链蛋白破坏至关重要,这表明系链蛋白在MVB途径中降解,而不是被蛋白酶体降解。然而,系链蛋白降解并不是Vpu活性的先决条件。尽管系链蛋白在UBAP1缺失的细胞中没有降解,并在内体中积累,但Vpu仍然能够有效对抗系链蛋白的抗病毒活性。
泛素与SOUBA结合的模型
在机制水平上,我们证明了UBAP1促进ESCRT-I与泛素相互作用的能力。含有UBAP1的ESCRT-I复合物能够通过位于UBAP1 C末端区域的SOUBA结构域结合泛素。据报道,在一例家族性额颞叶退行性变病例中,一种移码突变精确地删除了SOUBA结构域(S391Afs21X),表明了这种相互作用的重要性(罗林森等人。,2009). 因此,SOUBA结构域的突变破坏了内体货物的分类(Stefani等人。,2011). 据我们所知,该区域的结构显示了一种新的泛素结合折叠,即SOUBA结构域。UBAP1结合单泛素的能力可能对ESCRT-I途径的功能很重要,因为一半的共轭泛素是以单泛素或多泛素链的末端帽的形式存在(Ziv等人。,2011),单泛素化是空泡/溶酶体交通的充分信号(Stringer和Piper,2011年).
通过将SOUBA结构域叠加到不同的UBA上,这些UBA的结构已在单泛素配合物中得到解决,因此有可能生成一个与泛素结合的SOUBA模型。在这个模型中,SOUBA可以很容易地在域的凸面上容纳三个相邻的单泛素(). 三种UBA中的每一种都与泛素的疏水贴片(包括Ile44和Val70)结合。观察到的两个CSP15添加过量未标记的SOUBA后的N-标记泛素(C) 以及在泛素与SOUBA的络合物中附着顺磁性探针所诱导的弛豫(G–7J),与泛素结合模型一致。在这个模型中,泛素的取向似乎不允许占据SOUBA上相邻位点的泛素通过K48或K63异肽键相互连接。这与我们的ITC结果一致,该结果表明,这些连接与SOUBA的结合并不比单泛素好(). 先前对存在K48连接的双喹素的几种不同蛋白质的UBA的NMR研究表明,第二泛素的第二个结合位点涉及UBA上的单独界面(Sims等人。,2009; Song等人。,2009; Trempe等人。,2005; Varadan等人。,2005). SOUBA的电磁阀布置似乎会阻止这种绑定,至少对于前两个UBA是这样的。
泛素与UBAP1-SOUBA结合的模型
UBA1、UBA2和UBA3分别为蓝色、黄色和红色。在与单泛素结合时显示CSP>0.2ppm的UBAP1残基显示为绿色棒。三种单泛素在每个UBA结构域与泛素复合物中的ubiqulin-UBA结构域叠加的基础上进行了对接(PDB-ID2JY6号). 当CSPs与UBAP1 SOUBA结合时,CSPs>0.2 ppm的泛素残基显示为洋红色条。PRE和CSP测量表明,所有三种UBA都与泛素结合。泛素亚化学计量量的逐渐增加导致所有三个UBA基序中的残基发生化学位移,这表明泛素与一个位点的结合与另一个位点无关。核磁共振数据表明,结合发生在每个位点,但无法区分是一个、两个还是三个分子同时结合。然而,模型中似乎没有空间位阻冲突,这将阻止所有三种泛素同时结合。
核磁共振数据表明,三种UBA中的每一种都参与泛素结合,但是否所有三种UBAs都能同时结合泛素还有待证明。我们试图通过在(M/K)G(F/Y)基序中生成双点突变体来研究每个UBA对泛素的亲和力:我们构建了三个突变的SOUBA,每个都只有一个功能UBA。然而,核磁共振HSQC谱显示,这些突变体中的每一个都是非结构化的,阻止了进一步的研究。ESCRT-I复合物中全长UBAP1的ITC结果显示,与分离的SOUBA结构域相比,单泛素的亲和力更低。这可能意味着对ESCRT-I综合体中的SOUBA的访问受到更多限制。由于难以产生足够数量的双泛素,因此无法通过ITC测定含有UBAP1的ESCRT-I对K63键和K48键双泛素的亲和力。
由于SOUBA结构域的形状和核磁共振成像的相互作用位点导致了一个模型,其中三个结合泛素排列紧密,可以通过K48或K63以外的其他类型的连接进行连接,因此研究其他多泛素连接的UBAP1亲和力将是令人兴奋的。或者,除了提供对单泛素化货物的控制外,SOUBA域还可以与多个单泛素货物或单泛素聚集货物进行快速交互。所有这些都是依赖于ESCRT的MVB分拣中的常客。
实验程序
质粒构建
人类UBAP1公司通过PCR从IMAGE克隆40011243中扩增。所有缺失和点突变衍生物都是以类似的方式通过PCR产生的。研究中使用的所有结构均列于表S1.
重组ESCRT-I蛋白的表达与纯化
在多顺反子共表达载体中克隆了编码人类VPS28(全长或1-122)、TSG101(198-390)、VPS37A(229-397)和UBAP1(带有C末端His6标记的全长或缺失变体)的基因,如其他地方所述(Teo等人。,2006). 所表达的结构列于表S1。按照中所述进行表达和纯化补充实验程序.
SOUBA的表达与纯化
在N末端His下游的pOPTH(tev)表达载体中克隆了人类SOUBA结构域(UBAP1 389-502),该结构域为野生型或包含K415A、K416A和E418A三重突变6-标签后面是TEV蛋白酶裂解位点。按照中所述进行表达和纯化补充实验程序.
SOUBA的结晶、数据收集和精制
人SOUBA结构域(UBAP1 389-502)的硒甲硫氨酸晶体,具有K415A、K416A和E418A三重突变,旨在降低表面焓电荷(使用SERp服务器:http://services.mbi.ucla.edu/SER网站/)用于结晶(参见补充实验程序和).
表1
| 用于结构细化的Se-Met晶体 |
---|
数据收集 |
|
“空间”组 | 第1页 |
单元格尺寸 |
一,b条,c(c)(Å) | 34.40, 43.48, 59.41 |
α, β, γ (°) | 102.57, 96.47, 113.24 |
波长 | 0.98 |
分辨率(Ω) | 38.3 (1.65)一 |
R(右)sym(对称)或R(右)合并 | 0.055 (0.54) |
我/ σ我 | 9.9 (1.9) |
完整性(%) | 95.9 (94.4) |
冗余 | 3.9 (3.9) |
|
精炼
|
分辨率(Ω) | 1.65 |
没有。反思 | 36253 |
R(右)工作/R(右)自由的 | 0.1494/0.1907 |
没有。原子 | 2101 |
蛋白质 | 1822 |
配体/离子 | 37 |
水 | 242 |
B类-因素 | 34 |
蛋白质 | 32 |
配体/离子 | 66 |
水 | 47 |
R.m.s偏差 |
粘结长度(Ω) | 0.0165 |
结合角(°) | 1.536 |
等温滴定量热仪
使用Microcal ITC200在20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、100 mM NaCl和1 mM TCEP中进行分析。ITC细胞含有150μM的SOUBA结构域(UBAP1(389-502))或与VPS28(全长)、TSG101(198-390,即缺乏UEV结构域)和VPS37A(229-397,即缺乏UEV结构域)相关的全长UBAP1(75μM),并用38次注射3mM的单泛素(SIGMA U6253)进行滴定。对K63连接和K48连接的双喹素进行测定,使细胞中的双喹素为100μM,通过38次注射2.3mM的SOUBA结构域进行滴定。数据通过使用一组独立站点的绑定模型进行拟合。
顺磁性标记的单泛素的表达和纯化如补充实验程序.
核磁共振波谱
为核磁共振波谱实验制备的野生型SOUBA(UBAP1_389-502)样品在90%H2O中通常为1.0 mM,在具有10 mM DTT的PBS中通常为10%D2O。所有光谱都是在20°C下使用Bruker Advance 700或DRX600光谱仪获得的,并参考外部2,2-二甲基-2-硅烷-5-磺酸钠(DSS)以获得质子和碳信号,或参考液体铵以获得氮信号。使用标准核磁共振方法获得赋值13C类/15N标记和15N标记样品。使用以下标准的2D和3D异核光谱集获得主干分配:1H(H)-15N HSQC、HNCACB、CBCA(CO)NH、HACACO、HNCO、CCCONH和1H(H)-13C HSQC。使用0.5 mM进行HSQC滴定15N标记的UBAP1和不同浓度的未标记泛素。用0.3 mM进行类似滴定15N标记泛素和未标记UBAP1。酰胺类CSP计算如下:
式中ΔδH(H)和ΔδN个观察到的化学位移变化1H和15N、 分别是。使用含有0.3 mM SOUBA和0.3 mM化学修饰的单泛素的样品进行顺磁实验。
稳定细胞系的产生
HT1080/THN-HA K5细胞已在别处描述(Pardieu等人。,2010). 为了产生HeLa OSHA-TSG101,用100ng的pHIT VSVG、700ng的MLV GagPol和200ng的pCMS28逆转录病毒包装载体转染293T细胞48小时。收集含病毒的上清液并用于转导HeLa。48小时后用嘌呤霉素(200 ng/ml)进行选择,并在连续选择下传代细胞。
HIV感染性检测
使用聚乙烯亚胺将250 ng YFP融合物和300 ng pNL/HXB转染细胞(293T)。转染48小时后收集的培养上清液通过低速离心进行澄清,250μl中的颗粒通过14000 rpm的20%蔗糖垫离心2小时获得。用抗Gag抗体进行western印迹分析细胞和颗粒裂解物中的病毒蛋白含量。或者,指示HeLa-TZM-bl细胞(CD4+,CXCR4型+,立方厘米5+,HIV-1 LTR-LacZ)(Derdeyn等人。,2000)感染1μl上清液,48小时后,使用化学发光检测试剂Galacto-Star(Applied Biosystems)测量细胞裂解液中的β-半乳糖苷酶活性。
为了通过siRNA介导的细胞UBAP1耗竭来检测病毒生成的抑制,使用Dharmafect1(Dharmacon)首次将50 pmol siRNA转染293T细胞,并在第二天进行分裂。首次转染48小时后,使用脂质体2000(Invitrogen)将50 pmol siRNA和HIV前病毒质粒共同转染细胞。所用siRNA寡核苷酸的详细序列见表S2转补体分析的质粒和方法已在前面描述过(Martin-Serro等人。,2001).
Vpu介导的Tetherin降解试验
将稳定表达栓系蛋白的亚流入293T细胞接种在六孔板中,并在板后2小时使用Dharmafect-1(Dharmacon)转染50 pmol siRNA。48小时后,重新接种细胞并再次转染50 pmol的siRNA。第二次RNAi转染6小时后,细胞在MOI为2时感染HIV-1野生型或Vpu缺乏型。感染后48小时,在含有50 mM Tris-HCl(pH 7.4)、150 mM NaCl、完整蛋白酶抑制剂(Roche)和1%洋地黄素(Calbiochem)的缓冲液中,将细胞在冰上溶解30分钟。去除细胞核后,将产生的上清液与1μg/ml小鼠抗乙醚(eBiosciences)在4°C下孵育2小时,然后再添加40μl蛋白g-琼脂糖(Invitrogen)3小时。然后在含有0.1%洋地黄素的裂解缓冲液中清洗珠子四次。最终清洗后,将珠子重新悬浮在水中,并在供应商规定的变性条件下使用新英格兰生物实验室的蛋白质脱糖试剂盒进行处理。将样品重新悬浮在SDS-PAGE加载缓冲液中,然后使用兔抗BST2蛋白(由K.Strebel通过NIH ARRP善意提供)对细胞裂解物和免疫沉淀物进行western blot,以检测栓蛋白。
K5-Mediated Tetherin降解试验
对单独稳定表达HA-tetherin(HT1080:HA-THN)或与K5(HT1080:HA-THN/K5)联合表达的HT1080细胞进行siRNA处理后,通过细胞裂解产物的western blot分析总栓蛋白-HA水平。用抗HA抗体检测Tetherin-HA,以微管蛋白作为负荷对照,并用Li-Cor荧光偶联650 nm和800 nm二级抗体进行可视化。
Western Blot分析
在10%或12%的聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞提取物和病毒离子裂解物,并转移到硝化纤维素膜上。使用的抗体列表见表S3.
免疫荧光显微镜
HT1080:HA-THN和HT1080:HA-THN/K5细胞按照上述方法用siRNA处理以进行多核分析。转染后24小时,将细胞固定在4%多聚甲醛中,在0.1%Triton X-100中透化,并使用兔抗HA抗体(Rockland)和小鼠抗CD63(爱荷华大学杂交瘤银行发展研究)或小鼠抗单和多泛素偶联物(克隆FK2)(Enzo Life Sciences)进行免疫染色其次是与Alexa 488和594荧光团(Invitrogen)偶联的适当驴次级抗体。使用Hoechst 33258对Nuclei进行可视化,并在Mowiol安装盖玻片。使用徕卡AOBS SP2共焦显微镜拍摄图像。
致谢
J.M.S.由李斯特研究所、EMBO青年研究员计划和医学研究理事会资助(G0802777号拨款)。J.M.S.和M.A.由Wellcome信托基金资助(授予WT093056MA)。R.L.W.由威康信托基金(拨款083639/Z/07/Z)和医学研究委员会(文件编号U105184308)资助。我们感谢Michael Hadders对手稿的评论,感谢Chris Johnson对ITC的帮助,感谢Stephen McLaughlin对Octet测量的帮助。我们感谢David Cobessi和Elspeth Gordon分别在ESRF波束线BM30A和ID23-1的数据采集方面提供的帮助。
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