结果
PICK1和Syntenin与GluR5相互作用2亿和GluR6在酵母双杂交系统中
为了寻找与KAR调控有关的蛋白质，我们用KAR亚基选择性剪接变异体ct-GluR5对成年大鼠大脑cDNA文库进行了酵母双杂交筛选2亿。检测到与两个单独的PDZ结构域蛋白的强相互作用(). 我们分离出84个克隆，编码syntenin的整个编码序列，syntenin是一种具有两个PDZ结构域重复的蛋白质，首次被报道为与syndecans（一组细胞表面蛋白聚糖）的相互作用物(Grootjans等人，1997年). 我们还分离出10个编码PICK1的克隆，PICK1是一种含有单个PDZ结构域的蛋白质，最初是为了与PKCα相互作用而分离出来的(Staudinger等人，1995年).
酵母双杂交系统中KAR亚基与PICK1和Syntenin的相互作用
（A） β-半乳糖苷酶检测范围为+++（过滤器在15分钟内变蓝）至阴性（−）。在所有实验中，至少对三批独立转化的酵母进行了三次分析。
（B） GluR5的重叠缺失突变体和单点突变2亿.
这两种相互作用物针对一系列包含其他谷氨酸受体和亚单位的ct结构域的诱饵进行测试：mGluR1-8、GluR1-4、NR1和NR2A-D公司Syntenin与其他毒饵均无相互作用(Hirbec等人，2002年和数据未显示）。然而，与先前的报道一致，PICK1与GluR2和3的ct结构域相互作用(Dev等人，1999年;Xia等人，1999年)和mGluR7一(Dev等人，2000年; 数据未显示）。我们还测试了PICK1和syntenin对其他KAR亚单位的特异性。PICK1和syntenin均未与GluR5相互作用2a个或GluR7一Syntenin（而非PICK1）与GluR5相互作用2厘米.缺乏与GluR5结合的可检测PICK12厘米酵母中的这一亚基与GluR5具有相同的30个极端ct氨基酸，这一点令人惊讶2亿在酵母双杂交试验中，我们还观察到GluR6与PICK1和syntenin之间存在一致但不太稳定的相互作用。
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定义GluR5之间的确切相互作用位点2亿以及syntenin或PICK1、重叠截断突变和GluR5的各种点突变2亿已生成。表明GluR5最后10个氨基酸的缺失2亿完全消除了与syntenin和PICK1的相互作用。令人惊讶的是，我们测试的最短区域对应于最后20个残基，其中包含PDZ结合基序，与PICK1相互作用，但与合成蛋白没有相互作用。因此，GluR5的最后20个氨基酸2亿对于syntenin相互作用是必要的，但还不够。
GluR5最后三个氨基酸的点突变2亿表明了这些残留物的重要性。有趣的是，syntenin和PICK1对特定残留变化表现出不同的耐受性。将位置−1处的缬氨酸替换为丙氨酸（ΔV[904]A），可消除与PICK1的相互作用，但不消除与合成蛋白的相互作用。相反，将−2处的苏氨酸替换为脯氨酸（ΔT[903]P）可消除与syntenin的相互作用，但与PICK1无相互作用。最后，用丝氨酸（ΔA[905]S）取代末端丙氨酸，消除了与合成蛋白和PICK1的相互作用().
合成蛋白第二PDZ结构域内关键甘氨酸残基的取代(Ponting等人，1997年)导致其失去与ct-GluR5的相互作用2亿类似地，用谷氨酰胺替代PICK1的PDZ结构域中的赖氨酸(Dev等人，1999年)消除了PICK1与GluR5的结合2亿（未显示数据）。这些结果证实与GluR5的结合2亿通过PICK1的PDZ域和syntenin的第二个PDZ域发生。
GluR5的体外结合2亿，谷氨酸52厘米，和GluR6转化为重组Syntenin、PICK1、GRIP和PSD95
为了验证和扩展酵母双杂交分析，我们使用GST-ct-GluR5进行了下拉实验2a个，GST-ct-GluR52亿，谷胱甘肽转移酶-ct-GluR52厘米、GST-ct-GluR6和GST-ct/GluR7一虽然我们在酵母双杂交分析中没有检测到它们，但我们还通过每个构建物筛选了GRIP和PSD95的保留，因为GRIP和PICK1一样，是一个与GluR2的强PDZ相互作用物(Dev等人，1999年;Xia等人，1999年)和PSD95被报道为GluR6相互作用物(Garcia等人，1998年).
如所示、重组表位标记的合成素、PICK1、PSD95和含有PDZ结构域4-7（GRIP）的GRIP部分片段[4-7]; GST-ct-GluR5有效地保留了COS7细胞中表达的残基430–1112）2亿，GST-ct-GluR52厘米和GST-ct-GluR6。每个相互作用体以相似的量结合KAR亚单位。没有一种蛋白单独与GST结合，即GST-ct-GluR52a个或GST-ct-GluR7一(和数据未显示）。对额外相互作用物的检测表明，使用纯化蛋白质的下拉实验在检测某些蛋白质-蛋白质相互作用方面比酵母双杂交分析更为敏感。
Ct-GluR5型2亿和GluR6在体外与重组Syntenin、PICK1、GRIP和PSD95结合
（A） 重组表位标记相互作用蛋白的GST-ct融合下拉的代表性蛋白质印迹。下部插入物显示了相应的考马斯蓝染色凝胶。
（B） GST下拉的量化。数据为平均值±SEM（n>3），表示为野生型GST-ct-GluR5保留量的百分比2亿.
GluR5体外相互作用的特异性2亿和PDZ蛋白质
点突变
酵母双杂交实验表明，GluR5的极端C末端残基2亿对于与合成蛋白和PICK1的相互作用是至关重要的。三点突变，即–EP（P）VA（ct-GluR52亿ΔT[903]P），–ETA类A（ct-GluR52亿ΔV[904]A）和–ETVS公司（ct-GluR52亿ΔA[905]S）特别有趣，因为它们区分了这两种相互作用体(). 因此，我们在下拉分析中量化了这些点突变的影响(). 与酵母数据一致，GST-ct-GluR52亿ΔT（903）P结合PICK1，水平类似于野生型GST-ct-GluR52亿，但与合成蛋白、GRIP和PSD95结合的水平降低。GST-ct-GluR52亿ΔV（904）A与PSD95和较小程度的syntenin有较强的结合，但与PICK1和GRIP的结合大大减少。有趣的是，GST-ct-GluR52亿ΔA（905）S与GRIP的结合非常牢固，但与PICK1、syntenin或PSD95的结合很少或没有。因此，在神经元中，输注GST-ct-GluR52亿ΔV（904）A被预测为syntenin和PSD95结合的抑制剂，而GST-ct-GluR52亿ΔA（905）S将选择性地阻止GRIP绑定到KAR。
肽阻滞剂
在补充策略中，我们在GST-ct-GluR5中加入了与GluR2的C末端11氨基酸的野生型或点突变体相对应的肽2亿下拉分析。我们和其他人已经使用这些肽来区分GRIP和PICK1与GluR2的相互作用(Li等人，1999年;Daw等人，2000年;Kim等人，2001年). 野生型GluR2序列肽（pep2-SVKI）的内含物(Dev等人，1999年;Xia等人，1999年)阻止GST-ct-GluR5之间的相互作用2亿和PICK1（6%±4%，p<0.001；). 该肽对与syntenin或PSD95的结合没有影响（分别为94%±6%和93%±7%）。令人惊讶的是，pep2-SVKI对GRIP与GST-ct-GluR5的结合只有中间作用，且在统计学上无显著性影响2亿（52%±15%，p>0.05）。由于pep2-SVKI有效地抑制GRIP与GluR2的结合，后一结果增加了GluR5的可能性2亿和GluR2绑定到GRIP的不同PDZ域。为了测试这个想法，我们研究了仅包括PDZ域4和5（GRIP）的更受限制的GRIP截断的绑定[4-5]). 把手[4-5]与GluR2、GluR5有效结合2亿和GluR6（未显示数据）。这些数据表明GluR52亿和GluR2与GRIP上的PDZ域4和5有差异地结合。
与其对GluR2的作用一致(Daw等人，2000年;Li等人，1999年)，pep2 EVKI阻止了PICK1与GST-ct-GluR5的结合2亿（8%±5%，p<0.001），但对与syntenin、GRIP或PSD95的相互作用没有显著影响（分别为86%±24%、90%±28%和81%±6%）。pep2-SVKE肽对GST-ct-GluR5的结合几乎没有影响2亿与任何PDZ蛋白结合。这些结果表明，pep2-SVKI和pep2-EVKI可以在KAR上选择性地区分PICK1和其他已识别的PDZ相互作用体。
这些生化工具通过选择性阻断PICK1和GRIP的结合，使我们能够区分其作用。然而，我们无法选择性地阻止syntenin或PSD95的结合。因此，我们主要致力于确定PICK1和GRIP在神经元中的作用，并在适当的情况下使用PSD95作为对照。
大脑中KAR与PICK1、GRIP和PSD95的相互作用
可溶性大鼠脑提取物中的GST下拉与COS7细胞中表达的重组蛋白的结果一致。使用P2膜的天然PICK1、GRIP和PSD95获得了相同的相互作用模式。GST-ct-GluR5保留了每种蛋白质2亿和GST-ct-GluR6，但不仅仅是GST().
Ct-GluR5的绑定2亿和Ct-GluR6连接到本机PICK1、GRIP和PSD95
（A） 从溶解的大鼠大脑P2声波获得的天然蛋白质的GST下拉。这些数据代表了每个抗体至少三个单独的印迹。
（B） 14日龄大鼠的协同免疫沉淀（a）。用单克隆抗GluR5/6/7抗体对PSD95和GRIP进行免疫共沉淀。myc-GluR6转基因小鼠PICK1的共免疫沉淀（b）。使用单克隆抗myc抗体沉淀表达myc标记的GluR6的小鼠脑组织。
（C） 成年大鼠脑的亚细胞分布。1000×g粗匀浆上清液（S1）；胞浆（S2）；粗膜分数（P2）；线粒体；髓鞘分数（My）；突触体（Sy）和可抵抗单个Triton（PSD I）、双Triton（PS II）或Triton和肉糖（PSD III）提取的部分。每条泳道20μg蛋白质。
接下来，我们进行了共免疫沉淀实验，以证明大脑中天然蛋白质之间的相互作用。与之前的研究一致(Garcia等人，1998年)，我们成功地使用抗GluR6/7抗体从大鼠大脑共沉淀天然PSD95（数据未显示）。然而，我们无法与该抗体共免疫沉淀任何其他PDZ相互作用物。最可能的原因是，抗GluR6/7抗体识别GluR6的C末端结构域中的一个表位，该表位屏蔽了PSD95以外的相互作用蛋白。为了克服这个技术问题，我们使用了一种单克隆抗GluR5/6/7抗体，该抗体识别KAR亚基的N末端结构域，以免疫沉淀大鼠脑中的天然KAR。有了这种抗体，我们能够联合免疫沉淀天然PSD95和GRIP(). 然而，与多克隆抗体相比，单克隆抗体的KAR免疫沉淀产率始终低于C末端导向的多克隆抗GluR6/7抗体（数据未显示）。这种较低的效率，再加上PICK1抗体不如GRIP或PSD95抗体敏感，阻止了从大鼠脑中检测到PICK1共免疫沉淀。
由于针对天然受体的可用抗体的局限性，我们采用了另一种策略，即使用转基因小鼠，其中GluR6亚基在其N-末端细胞外结构域上被myc标记(Coussen等人，2002年). 使用单克隆抗myc抗体GRIP和PICK1()成功与myc-GluR6共免疫沉淀。提取介质中钙的存在或缺失对沉淀的相互作用蛋白的数量没有任何显著影响。在野生型（即不表达myc-GluR6）小鼠中使用抗myc抗体的平行对照实验中未获得免疫沉淀。
含GluR6/7和PDZ相互作用体的亚细胞定位
我们比较了GluR6/7和PDZ相互作用蛋白在大鼠大脑中的亚细胞分布情况。没有有效的GluR5抗体，因此不可能与该亚单位进行直接比较。在包括突触体在内的不同组分中检测到GluR6/7和相互作用蛋白的免疫反应性(). 对突触体突触后密度（PSD）部分的逐步清洁提取显示，所有部分中都存在GluR6/7，具有相对较高的水平，但降低的水平使提取过程更加苛刻。PSD95是PSDIII中唯一富集的相互作用物，表明其与突触后密度密切相关。GRIP和PICK1在PSDI中丰富，在PSDII中存在，但在PSDIII中不存在。突触体部分富含突触素，但突触后部分仅在低水平的PSDI中存在。这些数据表明，KAR和每个相互作用体都存在于突触中，但它们对突触后密度的依附程度不同。
阻断PDZ相互作用对KAR介导的EPSC的影响
接下来，我们研究了这些相互作用蛋白在苔藓纤维CA3突触中调节突触后KAR的功能作用，其中有一个特征良好的KAR介导成分来传递(Castillo等人，1997年;维格斯和柯林里奇，1997年). 用含有GST融合蛋白（100 nM）的电极从海马脑片中的CA3神经元获得全细胞斑贴灯记录，该融合蛋白包含整个ct-GluR52亿或ct-GluR6。KAR介导的突触反应是通过用简短的高频序列刺激苔藓纤维（5次100 Hz的刺激）诱发的(Castillo等人，1997年;Lauri等人，2001年;维格斯和柯林里奇，1997年).
研究阻断KAR蛋白-蛋白质相互作用对药物分离的KAR介导的EPSCs的影响() (Lauri等人，2001年). 加入GST-ct-GluR52亿在全细胞记录溶液中，KAR介导的EPSC（EPSC）的大小迅速减小K（K）;). EPSCK（K）首次获得全细胞通路后约15分钟内，波幅降至对照组的50%左右，并且只要记录保持不变，波幅就一直处于抑制状态。在电极溶液中单独使用GST的交叉实验中，EPSC有小而缓慢的减少K（K）()类似于最近在没有GST的情况下报道的情况，并归因于KAR介导的电流缓慢下降(Lauri等人，2001年). 然而，EPSC的这种减少K（K）对照实验中观察到的结果比GST-ct-GluR5的结果小得多，速度慢得多2亿.
细胞内蛋白质相互作用对KAR介导的EPSC的快速调节
（A） EPSC的药理分离K（K）轨迹显示，在控制条件（1）、GYKI53655（50μM）（2）和添加NBQX（20μM）后，在100 Hz的5次电击下诱发双成分EPSC（3）。减法（2和3）显示EPSCK（K）插图：刺激和记录姿势。
（B） EPSC振幅的汇集数据（n=12）K（K）在使用含有GST-ct-GluR5的电极进行记录期间（在GYKI53655存在的情况下，由5个100 Hz的刺激诱发）2亿（100 nM）。本图和下图中的数据归一化为前三点，并以平均值±SEM表示。
（C） 使用不含蛋白质的溶液（n=8；30分钟时为对照的83%±6%）或单独使用GST（100 nM；n=6；30分钟后为对照的82%±6%K（K）实验中的振幅与（B）中的振幅交错。（B）和（C）中的插图是在指定时间（1和2）进行的四到六次连续扫描的典型EPSC记录道。
为了在相同的实验中监测对AMPAR和KAR的影响，我们收集了双组分AMPAR-和KAR-介导的EPSCs，这些EPSCs是在没有GYKI53655的情况下，通过5个100 Hz的刺激诱发的(). 在整个记录过程中，在最后一次刺激后110–120毫秒测量慢KAR介导的尾巴的振幅。对AMPAR介导的EPSC（EPSC）的影响A类)通过在每次实验开始和结束时测量单次电击刺激诱发的EPSCs峰值振幅来确定。在这些条件下，GST-ct-GluR52亿()，但不仅仅是GST()，导致EPSC减少约50%K（K）与药物分离EPSC的观察结果相似K（K）(). 然而，GST-ct-GluR52亿GST对EPSC没有任何影响A类(). 我们还发现GST-ct-GluR6在EPSC中引起了类似的抑郁K（K）与AMPAR相比，KAR具有类似的选择性().
GRIP积极监管KAR介导的EPSC
（A） GST对EPSC影响的汇总数据（n=21）K（K），由双组分EPSC测量。示例记录道是通过指定的时间（1和2）获得的。
（B） GST-ct-GluR5效应的汇集数据（n=19）和相应的示例跟踪2亿.
（C） GST-ct-GluR6效应的汇总数据（n=17）和相应的示例跟踪。
（D） GST-ct-GluR5影响的汇总数据（n=11）2亿ΔA（905）秒。
（E） GST-ct-GluR5影响的汇总数据（n=16）2亿ΔV（904）A。
（F） 显示GST构建体在30分钟时对EPSC的影响的汇总数据K（K）（开杆为隔离EPSCK（K）数据来自). *p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
（G） EPSC汇总数据A类在相同的实验中，取30分钟。
为了确定哪种PDZ相互作用物对急性调节突触KAR很重要，我们研究了注入GST-ct-GluR5的特异点突变体的影响2亿并将其作用与GST下拉分析中的结合特征相关联。用丝氨酸代替0位的丙氨酸（Δa[905]S）或用脯氨酸代替−2位的苏氨酸（Δ）T[903]P）对GST-ct-GluR5的能力没有影响2亿按下EPSCK（K）(). 相反，在−1位置（ΔV[904]A）用丙氨酸替代缬氨酸大大降低了GST-ct-GluR5的能力2亿阻止EPSCK（K）(). 从相互作用曲线的生化分析()这些结果表明，GRIP而非PSD95或syntenin的结合在急性维持突触KAR功能中起重要作用。然而，这些数据并不排除PICK1的作用。
我们还使用了包含PDZ结合基序及其点突变体的ct-GluR2肽“pep2-SVKI”、“pep2-EVKI，”和“pep2_SVKE”。这些肽以前被用于生化和电生理研究，以破坏PDZ结构域蛋白与GluR2的结合(Li等人，1999年;Daw等人，2000年;Kim等人，2001年). 输入pep2-SVKI或pep2-EVKI（100μM）可显著降低EPSCK（K）测量为双分量EPSC慢尾的振幅(). 这种效果与GST-ct-GluR5观察到的效果非常相似2亿相反，pep2 SVKE（100μM）几乎没有作用(). 在生化实验中，pep2-SVKI和pep2-EVKI选择性地阻断PICK1-GluR52亿而pep2-SVKE对任何相互作用均无强烈抑制作用。因此，这些结果表明，除GRIP外，PICK1还参与突触KAR的急性调节。
PDZ蛋白对AMPAR和KAR介导突触传递的快速差异调节
（A） 在获得细胞内pep2-SVKI的全细胞通路后，通过100 Hz的五次电击诱发的EPSC分别获得3分钟（黑色痕迹）和25分钟（灰色痕迹）。注意EPSC的增加A类EPSC下降K（K）这在EPSC衰变的扩展中更为明显（右手轨迹）。
（B） EPSC振幅的汇总数据（n=14）A类和EPSCK（K）用于注入pep2-SVKI的神经元。
（C） EPSC振幅的汇集数据（n=9）A类和EPSCK（K）用于注入pep2-EVKI的神经元。
（D） EPSC振幅的汇集数据（n=9）A类和EPSCK（K）用于注入pep2-SVKE的神经元。
（E） EPSC汇总数据A类（左侧面板）和EPSCK（K）（右侧面板），在30分钟时进行。
突触AMPARs和KARs的差异调节
我们同时通过测量五个电击刺激序列诱发的第五个EPSC的峰值振幅来研究这些肽对AMPAR介导的EPSC的影响。与我们之前在CA1突触上AMPAR介导的EPSC的结果一致(Daw等人，2000年)，pep2-SVKI导致EPSC增加A类大约三分之一细胞（5/14细胞）的振幅。当平均作用于所有14个细胞时，pep2-SVKI导致EPSC显著增加A类63%±34%()伴随着EPSC的下降K（K）52%±8%。也与我们之前对CA1突触的研究一致(Daw等人，2000年; 但请看Kim等人，2001年)输注pep2 EVKI对EPSC没有影响A类振幅(); 然而，如上所述，pep2-EVKI导致EPSC大幅度降低K（K）在相同的神经元中。非活性控制肽pep2-SVKE对EPSC无影响A类().
PKC对突触KAR的调节
电生理学数据表明任何一个把手或PICK1结合导致功能性突触KAR的丢失。为了研究KAR快速选择性调节的机制，我们将重点放在PKC的作用上，因为PICK1是PKCα的相互作用体(Staudinger等人，1995年,1997). Ct-GluR5型2亿根据NetPhos数据库的预测，至少有五个候选丝氨酸和一个苏氨酸用于PKC磷酸化。为了测试这些残基是否能被PKCα磷酸化，我们在体外进行了32使用GST-ct-GluR5进行P分析2a个，GST-ct-GluR52亿和GST-ct-GluR6。在所有实验中，GST-ct-GluR2被用作阳性对照，因为此前有报道称其被PKCα磷酸化（Chung等人，2000b；Perez等人，2001年). 谷氨酸52亿和GluR6，但不是GluR52a个，在体外被PKC有效磷酸化（数据未显示）。
接下来，我们构建了一系列重叠截断突变体，以确定GST-ct-GluR5上的磷酸化位点2亿。如所示，Δ4截断被PKC强烈磷酸化，而Δ3几乎没有磷酸化。从预测的PKC磷酸化位点来看，这些数据表明S880和/或S886在体外被PKCα磷酸化。为了更好地识别磷酸化位点，我们将全长ct-GluR5中的S880、S886或两者突变为丙氨酸2亿与野生型ct-GluR5相比，每个突变体显示PKC磷酸化水平显著降低2亿与单点突变体相比，双突变体的磷酸化水平显著降低。这些结果表明GluR5的S880和S8862亿可以被PKCα磷酸化。
PKC磷酸化物GluR52亿PKC活性的抑制减少KAR介导的EPSCs
（A） ct-GluR5上产生的截断突变体和共识PKC磷酸化位点（S）示意图2亿插入面板显示PKC对每个截短片段的体外磷酸化。
（B） 代表性放射自显影显示PKCα对点突变体的体外磷酸化（左图）。对每个突变体至少三个单独实验的数据进行量化（右侧面板）。
（C） 来自12个实验的示例轨迹（左）和汇总条形图（右），在这些实验中，在监测苔藓纤维突触传递的同时，应用了钙磷锡-C（1μM），并以50Hz进行了五次电击。
为了确定PKC活性是否调节突触的KAR功能，我们研究了阻断内源性PKC活性对EPSC的影响K（K）在CA3神经元中。镀液中应用选择性PKC抑制剂钙磷蛋白C（1μM）导致EPSC振幅迅速降低K（K），测量为50 Hz下五次电击诱发的双成分EPSC的慢成分(). 然而，PKC抑制对EPSC的振幅没有影响A类在相同实验中同时测量为第五个EPSC的峰值(). EPSC的选择性减少K（K）振幅与pep2 EVKI观察到的振幅非常相似，后者选择性地阻断PICK1与GluR5的结合2亿这些结果表明，PKC可以在相同的突触群中差异调节AMPAR和KAR功能。此外，这提供了一种机制，PICK1可以通过将PKC靶向KAR来维持KAR功能，并且与PICK1和GRIP差异调节AMPAR和KAR的模型一致。
讨论
在这里，我们发现，与AMPAR介导的突触传递一样（综述见Braithwaite等人，2000年;Scannevin和Huganir，2000年;马利诺和马伦卡，2002年)，KAR介导的突触传递由PDZ相互作用蛋白快速调节。然而，PDZ蛋白结合对这两种谷氨酸受体亚型的影响是不同的。阻断GluR2与GRIP的相互作用会导致AMPAR介导的一部分神经元的突触传递迅速增加，而阻断GluR2与PICK1的相互作用不会产生急性影响。相反，阻塞任何一个把手或PICK1相互作用导致KAR介导的突触传递迅速减少。因此，我们的数据表明，GRIP和PICK1都需要维持KAR突触功能。一个特别引人注目的发现是，阻断PDZ与pep2-SVKI的相互作用导致了AMPAR和KAR介导的苔藓纤维突触传递成分的同时差异调节。因此，PDZ蛋白与谷氨酸受体的相互作用可能参与突触AMPAR/KAR组成的快速转换。此外，我们发现PKCα可以磷酸化GluR5的S880和S8862亿PKC的抑制模拟了PICK1与突触KAR相互作用的阻断效应。这表明GluR5的PKC磷酸化2亿S880/S886参与了PICK1快速调节突触KAR的潜在机制。
KAR与PICK1、Syntenin、PSD95和GRIP相互作用的分子表征
我们使用了最有效的抗KAR抗体和转基因myc标记的GluR6小鼠组织的组合(Coussen等人，2002年)证明神经元中KAR与PDZ蛋白PSD95、PICK1和GRIP之间的相互作用。我们还证明了在酵母双杂交和GST下拉框中，另一种PDZ域蛋白syntenin的相互作用。然而，由于缺乏合适的工具，本研究没有研究该蛋白的功能作用。
缺失和点突变结构确定相互作用通过PDZ域发生。pep2-SVKI对GluR5缺乏显著作用2亿-GRIP相互作用，尽管它有效地阻止了GluR2 AMPAR亚基和GRIP之间的相互作用(Daw等人，2000年;Li等人，1999年)，表明KARs和AMPAR可能与GRIP的不同PDZ结构域结合。此外，由于GluR2和GluR52亿绑定到仅包含PDZ域4和5的简化GRIP截断，可能在这两个域中发生差异交互作用。这些数据表明，肽抑制剂以及ct突变体可以选择性地抑制PDZ蛋白和特定谷氨酸受体亚单位之间的相互作用，因此为研究这些相互作用的功能相关性提供了有用的工具。
一个意外的结果是GluR5的C末端之间缺乏相互作用2厘米酵母双杂交试验中的PICK1。最近的一项研究表明，GluR2的NSF结合域（PDZ结合域上游的非相邻区域）内的残基对GluR2-PICK1相互作用很重要(Hanley等人，2002年). 类似地，一种解释可能是ct-GluR5中插入物的存在2厘米对PICK1与–ETVA PDZ结合域的结合产生负面影响。PICK1绑定到ct-GluR5的事实2厘米在下拉实验中可以反映该测定的更高灵敏度和/或相对高浓度的相互作用蛋白的存在。ct-GluR5之间缺乏相互作用的替代性和/或辅助性解释2厘米在双杂交分析中，PICK1可能是较长ct-GluR5的错误折叠2厘米酵母细胞核中的蛋白质（另请参见Hirbec等人，2002年).
KAR及其相互作用蛋白的亚细胞定位
与功能研究一致（有关审查，请参阅Lerma等人，2001年)，我们的亚细胞分馏结果显示突触体和PSD部分中的KAR亚单位与突触前终末和突触后膜上的KAR子单位一致。每个相互作用的蛋白也在突触体部分表达。通过差异洗涤剂提取对突触体PSD组分的进一步分析表明，PSD95与突触后密度关系最密切，因为它富含PSDIII。GluR6/7也存在于PSDIII中，但与PSDII和PSDI相比其水平降低。GRIP和PICK1在PSDI中富集，存在于PSDII中，但在PSDIII中未检测到，这表明这些蛋白在突触后密度上的锚定不太紧密，可能更具流动性(). 这与GRIP和PICK1对AMPAR的已知作用一致，并表明这些蛋白可能参与KAR的运输和表面表达。例如，最近有研究表明，GRIP与驱动蛋白运动蛋白直接相关，从而为含GluR2的AMPAR提供了转运机制(Setou等人，2002年). 由于GRIP上的驱动蛋白结合域不涉及PDZ域，因此GRIP驱动蛋白复合物也可能参与KAR的靶向和转运。有趣的是，syntenin显示出与其他相互作用体截然不同的亚细胞分布特征。突触体部分富含合蛋白，在PSDI中含量较低，但在PSDII和PSDIII中完全缺失。这些数据表明，syntenin可能在很大程度上具有突触前定位，在突触前KAR的靶向中发挥作用。
突触AMPARs和KARs的差异调节
在大多数实验中，我们同时监测AMPAR和KAR介导的EPSCs。肽对EPSC的影响A类苔藓纤维与CA1突触相同(Daw等人，2000年). 这表明PDZ蛋白相互作用在不同类型的谷氨酸能突触中以类似的方式调节AMPAR。因此，PICK1特异性抑制剂pep2-EVKI不影响基础传递，而pep2-SVKI在大约三分之一的突触中引起快速增长。这种效应归因于突触下GluR2-GRIP相互作用的中断导致AMPAR插入突触。在本研究中，输注ct-GluR52亿ct-GluR6和某些结合GRIP的突变体并没有导致EPSC持续升高A类这与这些KAR亚基C末端选择性阻断KAR-GRIP相互作用一致，而没有显著阻断GluR2-GRIP相互反应。
AMPAR和KAR的差异调节模型
KARs和AMPARs可以与PDZ蛋白的共同库结合的发现表明，这些蛋白可能在谷氨酸能突触的调节中发挥重要的一般作用。基于目前的研究结果和之前关于AMPAR的工作（Chung等人，2000a；Daw等人，2000年;Kim等人，2001年;Perez等人，2001年)，可以推测这些PDZ蛋白介导AMPAR和KAR差异调节的分子机制(). 在该方案中，AMPAR通过GluR2亚基与GRIP和/或ABP的结合在细胞内池中得到保护。在我们的电生理实验过程中，这些“被抓住”的受体是不动的。PICK1交换GRIP并靶向PKCα，PKCα随后磷酸化GluR2的S880，从而阻止GRIP的重新结合。S880-磷酸化AMPAR具有流动性，可用于表面表达。这个急性AMPAR调节模型与我们目前的数据一致，也与我们之前对CA1突触的研究一致(Daw等人，2000年; 但请参见Kim等人，2001年). 我们认为KAR也被GRIP“抓住”，但在这种情况下，PICK1靶向的PKC依赖性磷酸化稳定了GRIP与GluR5/6的相互作用，并将受体锚定在突触后膜上。这些数据与阻断GRIP或PICK1结合或抑制PKC导致KAR介导的突触电流快速下降的观察结果完全一致。我们推测，虽然GluR2的S880磷酸化阻止了GRIP结合(Chung等人，2000年)、S880的磷酸化和/或GluR5的S8862亿（和/或GluR6的等效残基）稳定GRIP结合并将受体锚定在突触上。
PKC介导的AMPARs和KARs磷酸化的分子结果差异可以解释功能性突触反应在相反方向上的差异调节。我们的结果表明，在相同的突触群中，PDZ蛋白相互作用的中断导致EPSC的增加A类EPSC同时下降K（K）提示这些蛋白可能会调节突触AMPAR和KAR的相对比例。生理学上，鉴于AMPARs和KARs独特的生物物理和功能特征，这些相互作用的动态调节将在调节基础谷氨酸能突触传递中发挥重要作用。此外，以前有报道称，某些形式的发育性和活动依赖性突触可塑性涉及从功能性表达的KAR到AMPAR的转换(基德和艾萨克，1999年). PDZ相互作用蛋白在这两种受体类型上的差异效应为解释突触AMPAR和KAR补体的这些发育性和活性依赖性变化提供了一种有吸引力的分子机制。
实验程序
cDNA构建
编码大鼠KAR亚基GluR5 C末端细胞质结构域的cDNA2亿（残基841-905），包括野生型和突变体，以及GluR5的C末端2a个（残留物841–856），GluR52厘米（残基841–934）、GluR6a（残基84–908）和GluR7一使用特异性引物通过PCR克隆（残基811-888），并将其插入pBTM116载体（诱饵载体）。
通过酵母双杂交筛选成年大鼠脑cDNA文库，将pBTM116-ct-GluR5克隆到GAL4激活域载体pGAD10（鱼类载体；Clontech）中，分离出大鼠合成素和PICK1 cDNA2亿(Nishimune等人，1998年). 把手[4-7]（pGAD10中的残基430-1112）是从使用ct-GluR2作为诱饵进行的酵母双杂交筛选中分离出来的。为了绘制相互作用位点，使用特异性引物通过PCR制备PICK1或合成蛋白的截短突变体，并将其亚克隆到pGAD10载体中。所有结构均通过测序进行验证。
通过PCR将FLAG标签导入PICK1的N末端并亚克隆到哺乳动物表达载体pCIneo中(Dev等人，1999年). Myc和HA表位标签被引入GRIP的N末端[4-7]以及通过将其从pGAD10亚克隆到pCMV-myc或pCMV-HA（Clontech）的全长合成酶。Myc-tagged全长PSD95来自S.Grant（爱丁堡大学）。
酵母双杂交系统
如前所述进行筛选(Nishimune等人，1998年). 阳性GluR52亿通过在三重脱落培养基（–Trp/–Leu/–His）上生长和β-半乳糖苷酶过滤试验选择相互作用物。
膜制备
在冰上解剖成年Wistar大鼠的大脑，并在320 mM含蔗糖蛋白酶抑制剂（Complete，Boehringer-Mannheim）中均质。亚细胞分离是通过差速离心获得的(格雷和惠塔克，1962年). PSD部分的制备如前所述(Carlin等人，1980年)，进行了以下修改。突触体部分在冰镇的0.5%Triton X-100中溶解15分钟，然后在32000×g下离心20分钟，得到PSD I颗粒。PSD II和PSD III颗粒分别通过将PSD I颗粒重新悬浮在0.5%Triton X-100和冰镇3%肉桂糖中获得。在冰上培养10分钟后，通过1小时离心分离201800×g的不溶性部分。所有颗粒在PBS或40 mM Tris-HCl（pH 8.0）中重新悬浮。使用BCA蛋白质分析（Pierce）测定蛋白质浓度。
可溶性蛋白质的制备
myc-GRIP抓取器活门[4-7]从使用FuGene6（Roche）瞬时转染的COS7细胞的细胞裂解液中获得myc-PSD95和HA-Syntenin可溶性重组蛋白。将细胞颗粒重新悬浮在PTxE中（PBS含有0.1 mM EDTA、1%Triton X-100[2%Triton X-100]，用于提取myc-GRIP[4-7]]pH 7.4），在冰上超声6×10 s，在4°C下旋转溶解1小时，在4℃下以15000 rpm离心20分钟。上清液用于下拉测定。
对于使用天然蛋白质的下拉，成年大鼠脑匀浆在320 mM蔗糖、4 mM HEPES、1 mM EDTA和1 mM EGTA中使用玻璃/特氟隆均质器制备（十次）。将匀浆在4°C，1000×g下离心10 min，上清液（S1）在4℃，48000×g下分离30 min。将所得颗粒（P2）重新悬浮在PTxE中（PBS含有0.1 mM EDTA，1%TritonX-100，pH 7.4），超声处理（6×10s冰上），并在4℃下旋转溶解1 hr。离心（10万×g，在4°C下1小时）后，上清液（S3）用于下拉分析。
对于体内联合免疫沉淀，将14日龄大鼠的P2组分重新悬浮在50 mM Tris、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、1.5%CHAPS和0.75%正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pH 8.0）中，并加入蛋白酶抑制剂。使用玻璃/聚四氟乙烯均质器溶解再悬浮膜（两个系列，共十次，在冰上培养10分钟），然后在4°C下轻轻旋转1小时。在使用成年或3日龄myc-GluR6转基因小鼠进行的实验中(Coussen等人，2002年)，在存在或不存在0.5mM Ca的情况下，使用1%Triton X-100作为洗涤剂提取并溶解膜级分2+旋转后，将悬浮液在4°C下以13000 rpm离心45 min，所得上清液（S3）用于免疫沉淀。
亲和色谱法（GST下拉）
ct-GluR52a个，谷氨酸52亿，谷氨酸52厘米、GluR6和GluR7一亚克隆到pGEX-4T-1质粒（Pharmacia）中，表达于大肠杆菌菌株BL21，并使用BugBuster（Novagen）提取。仅GST和GST融合蛋白与25μl（从大脑下拉50μl）谷胱甘肽Sepharose 4B（Pharmacia）在1 mg/ml BSA存在下在4°C下结合30分钟。然后用1 ml PTx将耦合的Sepharose清洗两次[0.1]（PBS含有0.1%Triton X-100，pH 7.4）。然后在2 mg/ml BSA存在下，将含有标记或天然蛋白的上清液与耦合珠培养。在4°C下旋转1小时（从大脑下拉过夜）后，用1 ml PTx清洗悬浮液五次[0.1]缓冲液，然后进行蛋白质印迹处理。
协同免疫沉淀
将4-10μl抗GluR5/6/7（Chemicon，CA）与大鼠大脑S3部分在4°C下孵育90分钟。然后添加100μl 50%的抗小鼠IgM琼脂糖浆液（西格玛，圣路易斯，密苏里州），并在4°C下继续培养过夜。用20 mM Tris、1 mM EDTA、100 mM NaCl、0.5%Nonide P-40、pH 7.4清洗悬浮液六次。对于myc-GluR6转基因小鼠的免疫沉淀，将8μg抗myc抗体（克隆9E10；Roche）与预先分离的S3组分在4°C下孵育60分钟。添加50μl 50%浆液蛋白-G琼脂糖（Sigma），并在4°C下放置过夜。用20 mM HEPES、1%TritonX-100、150 mM NaCl和0.15 mM EDTA（pH 7.5）清洗珠子，其中含有蛋白酶抑制剂混合物。
西方印迹法和抗体
蛋白质在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到PVDF膜（Millipore）上，并在室温下用5%脱脂奶粉在TBS-T中封闭1小时（200 mM Tris，137 mM NaCl，0.1%吐温20pH 7.4），然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。主要抗体为：（i）亲和纯化抗PICK1兔抗体(Dev等人，1999年)（1:200稀释）；（ii）抗HA抗体（加利福尼亚州圣克鲁斯）；（iii）抗GRIP（Upstate Biotechnologies）；（iv）抗yntenin血清（1:200稀释）；（v） 抗GluR6/7抗体（Upstate Biotechnologies）；（vi）抗GluR6/7（C18）抗体（加利福尼亚州圣克鲁斯）；（vii）抗巴松单克隆抗体（Stressgen）；（viii）抗PSD95单抗（Chemicon），（ix）抗FLAG M2单抗（Sigma）；和（x）抗myc单克隆抗体（癌基因）。使用适当的HRP结合二级抗体进行Western blotting（Sigma），并使用ECL检测。免疫印迹上条带的强度通过使用Gel Doc系统（Biorad）的密度计进行定量。
体外磷酸化分析
对5μg纯化的GST融合GluR5进行体外PKC介导的磷酸化检测2a个，GluR52亿和GluR6使用先前发布的协议(Nakajima等人，1999年). 简单地说，反应在30°C的磷酸化缓冲液中进行30分钟（40 mM Tris-HCl，pH 7.5，20 mM MgCl2，200μg·ml−1L-α-磷脂酰-L-亚麻酸，40μg·ml−11,2-二油酰基-sn-甘油），纯化PKCα（1.5μg·ml−1; 钙生物化学）和100μM ATP。所有反应包括5–10μCi的[γ-32P] ATP，用SDS-PAGE样品缓冲液停止。磷酸化融合蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影进行可视化。
海马切片电生理学
从13至15日龄Wistar大鼠制备海马切片。将大鼠麻醉、斩首，并将其大脑置于冰镇的细胞外溶液中。在震动器上制备横向海马切片（400μm厚），并将其置于恢复室中，浸没在细胞外溶液中1–3小时。然后将切片置于记录室中，在室温（23°C–25°C）下与细胞外溶液连续过量混合。细胞外溶液如下：124.0 mM NaCl、3.0 mM KCl、1.0 mM MgSO4，1.25 mM NaH2人事军官4，26.0 mM氯化钠三，2.0 mM氯化钙2、15 mM D-葡萄糖、2.0 mM抗坏血酸、100μM苦毒毒素和50μM D-AP5，用95%O饱和2：5%一氧化碳2295毫摩尔，pH 7.4。使用电阻为2–4 MΩ的电极，在CA3锥体细胞上进行全细胞电压灯记录，电极充满细胞内溶液：130.0 mM CsMethanesulphonate、10.0 mM HEPES、0.5 mM EGTA、8.0 mM NaCl、5.0 mM QX-314Cl、4.0 mM MgATP和0.3 mM NaGTP、285 mOsm、pH 7.2。细胞内溶液还含有蛋白酶抑制剂bestatin（100μM）、leupeptin（100μM）、pepstatin-A（100µM）和相关纯化的GST-ct-fusion蛋白质（100 nM）或合成肽（100¦ΜM）。
通过100 Hz、间隔40 s的5次电击对齿状颗粒细胞层（苔藓纤维通路）的传入刺激，诱发双AMPA和红藻氨酸受体介导的突触电流。使用LTP程序在线收集和分析数据(www.ltp-program.com)并在线估计串联电阻(Anderson和Collingridge，2001年). 获得全细胞记录后立即开始传入刺激。通过对前五到六个响应进行平均得到基线值。KAR介导的EPSC（EPSC）成分的振幅K（K）)在火车上最后一次刺激后110–120毫秒测量。药物分离的EPSCK（K）在峰值处测量。在一些实验中，AMPAR介导的EPSC（EPSCA类)被测量为由单次电击刺激引起的EPSC的峰值。在记录开始时（使用五次电击刺激方案收集五到六次反应的初始基线后）和记录结束时收集这些数据（0.1 Hz时为10-20）。在其他实验中，EPSCA类通过监测列车中第五个EPSC的峰值振幅，在整个实验中进行测量。数据表示为平均值±SEM。对于统计测试，使用配对双尾Student t检验。
肽是定制合成的（Sigma），纯度高于98%。如上所述，制备GST和GST融合蛋白，在4°C下用5 mM Na透析20小时（2×2升）2高性能操作4，0.9 mM千赫2人事军官4和0.5 mM EGTA（pH 7.2），然后使用Centiprep系统（Millipore）进行浓缩。然后立即对纯化的蛋白质进行校准，并将其储存在−20°C下，直至使用。所有含有肽/GST融合蛋白的细胞内溶液平行配制并以完全相同的方式储存，并检查溶液的pH值和渗透压。
