肝窦内皮祖细胞促进大鼠肝再生

BM SPC和LSEC正常营业额。

为了研究BM-SPCs在正常LSEC转换中的作用，进行了性别不匹配的BM移植（男性到女性），9个月后分离出LSEC。通过Y染色体的FISH检测，在受体大鼠中鉴定出来自BM的LSEC(8). 在9个月龄时，只有0.8%±0.1%的LSEC和2.7%±0.2%的常驻SPC来源于BM，这表明BM SPC在正常LSEC周转中的作用很小，因此对成年大鼠常驻SPC中未受损肝脏的数量没有显著贡献。

LSEC增殖峰值。

为了研究肝再生过程中LSEC增殖的时间进程，在PHx后分离LSEC，并对其进行增殖细胞核抗原（PCNA）的免疫染色（图​（图4A）。4A） ●●●●。不到2%的LSEC为PCNA⁺假手术后。LSEC增殖在第3天达到峰值，PCNA接近40%⁺LSEC。

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图4

PHx后BM-SPC的增殖、动员、植入和分化。

(A类)用PCNA免疫染色法检测PHx后1-4天从假手术大鼠分离的LSEC中PHx后LSEC增殖峰值。n个= 3; ***P（P）与假对照组相比<0.001。(B类)BM SPC的增殖。PCNA的FACS分析⁺PHx第3天的BM SPC和假对照**P（P）与假手术相比<0.005。(C类)动员。在PHx第3天对外周血（PB）中的BM-SPCs进行计数。n个= 4; *P（P）与假手术对照组相比<0.05。(D类–F类)BM SPC的雕刻。在PHx第3天从进行性别不匹配（雄性到雌性）BM移植和随后的PHx的大鼠中分离出LSEC。通过Y染色体（箭头）的FISH染色鉴定BM衍生的LSEC(D类)假手术控制和(E类)在PHx之后。原始放大倍数，×100。(F类)来自3个单独实验的雕刻数据***P（P）与假手术对照组相比<0.001。(克)BM SPC的雕刻。用Lew-Tg（CAG-EGFP）大鼠的骨髓移植野生型大鼠。在PHx第3天分离LSEC，然后用FACS检测GFP，结果显示24.6%±3.1%的LSEC为GFP⁺因此BM衍生(n个= 3). (H（H）)BM SPC与LSEC的分化。野生型大鼠接受Lew-Tg（CAG-EGFP）大鼠骨髓移植。BM衍生LSEC（GFP⁺)PHx后2周分离，并通过扫描电镜检查开窗情况。黑色圆圈显示出独特的窗。原始放大倍数，×5000；比例尺：5μm。注意，从骨髓分离的SPC没有开窗（数据未显示）。

祖细胞反应。

如果骨髓基质干细胞有助于肝脏再生，那么PHx应引起祖细胞反应，这里定义为骨髓基质干细胞核的增殖、骨髓基质干淋巴细胞向循环的动员、肝内干细胞的植入以及干细胞向LSEC的分化。

SPC（CD133⁺CD45型⁺CD31型⁺细胞）在PHx后第3天或假手术后从BM中分离。PHx治疗后，BM内SPC的增殖从假手术组的20%增加到PHx组的50%（图​（图4B）。4B） ●●●●。PHx后进入循环的BM SPC数量增加了一倍（图​（图4C）。4C） ●●●●。用两种不同的方法测定BM-SPC的植入程度。在性别不匹配的骨髓移植大鼠（雄性骨髓移植到雌性大鼠）中，近25%的分离的LSEC在PHx后第3天通过FISH呈Y染色体阳性，而假手术对照组则不到1%（图​（图4，4，D–F），表明在PHx后BM SPC显著植入。这些发现在野生型Lewis大鼠中得到了证实，这些大鼠移植了来自雄性Lew-Tg（CAG-EGFP）的Lewis鼠的BM；在这些移植大鼠中，所有BM细胞均稳定表达GFP。Lewis大鼠移植Lew-Tg（CAG-EGFP）的BM后第3天，近25%的分离LSEC为GFP⁺，即BM原点（图​（图4G）。4G） ●●●●。图​图55显示GFP的植入⁺PHx后第5天，Lew-Tg（CAG-EGFP）Lewis大鼠BM野生型大鼠肝脏中的BM-SPC。GFP的存在⁺单元格（图​（图5A）5A） 表示植入的BM细胞，CD31染色识别LSEC（图​（图5B），5B） 和GFP的共定位⁺CD31型⁺（图​（图5C）5C） 窦旁细胞显示BM-SPC作为内皮细胞植入。

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图5

BM-SPC在肝脏中的植入。

PHx后第5天，用Lew Tg（CAG-EGFP）ys大鼠的BM移植野生型大鼠的肝脏。(A类)GFP公司⁺骨髓细胞沿窦壁移植。(B类)CD31染色显示LSEC。(C类)的合并图像A类和B类证明GFP⁺骨髓细胞移植为LSEC。原始放大倍数，×100。

BM SPC与LSEC的分化。

移植Lew-Tg（CAG-EGFP）ys BM的野生型Lewis大鼠用于确定植入肝脏的BM-SPC是否分化为LSEC。PHx后2周分离LSEC，GFP⁺将部分（即BM衍生细胞）培养过夜。扫描电镜显示GFP⁺LSEC已经形成了正常的开窗，分组为筛网（图​（图4H），4H） 差异化低收入国家的标志性特征。相反，骨髓中的SPC没有开窗（数据未显示）。

植入和扩展的持续性。

为了确定植入的SPC是否存在于肝脏中，从GFP中分离出常驻SPC⁺转基因大鼠和1×10⁶PHx后3天，将常驻SPC注入野生型Lewis大鼠的尾静脉(n个= 3). 两个月后，分离LSEC并用FACS检测GFP表达。54.2%±5.1%的LSEC和44.4%±3.0%的常驻SPC为GFP⁺，显示注入的常驻SPC持续植入（图​（图6）。6). 1 × 10⁶GFP公司⁺注入常驻SPC，GFP总数⁺2个月后分离出的LSEC平均34.3×10⁶± 5.1 × 10⁶因此，注入的SPC至少是LSEC的34倍。

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图6

植入和扩展的持续性。

从GFP中分离出常驻SPC⁺转基因大鼠和1×10⁶PHx后3天，将常驻SPC注入野生型Lewis大鼠的尾静脉(n个= 3). 两个月后，分离LSEC和常驻SPC，并用FACS检测GFP表达（如x个轴）。(A类)门控区显示53.2%的LSEC为GFP⁺即BM衍生。(B类)封闭区域显示47.7%的常驻SPC为GFP⁺即BM衍生。SSC-H，侧面散射高度；FL1-H，荧光强度。

BM抑制对肝再生的损害和SPC输注的影响。

为了检查BM SPC的招募是否对正常肝再生是必要的，对BM抑制大鼠进行了PHx。大鼠接受选择性后肢照射，1周后外周血白细胞计数降低近40%。照射后一周，大鼠接受PHx。大鼠接受尾静脉输注生理盐水（“不输注”），1×10⁶常驻SPC，或50×10⁶PHx后第1天的BM细胞，在第5天被处死（图​（图7A）。7A） ●●●●。一组大鼠在未经事先照射的情况下接受PHx（“仅PHx”）。PHx后5天，仅PHx组的肝脏重量达到对照窝友的86%（图​（图7B）。7B） ●●●●。BM抑制大鼠输注生理盐水（不输注）后，其肝脏重量恢复量比仅注射PHx的大鼠少40%（图​（图7B）。7B） ●●●●。PHx后1天输注常驻SPC或BM细胞可完全逆转BM抑制引起的肝再生障碍（图​（图7B），7B） 然而，PHx后3天输注并没有显著改善肝再生（数据未显示）。PHx后5天通过PCNA免疫染色检测肝细胞增殖（图​（图7C）。7C） ●●●●。PCNA⁺尽管在PHx后第5天，肝脏重量仅为对照鼠的65%，但在含盐、BM抑制的大鼠中，肝细胞的比例较低。然而，将驻留的SPC或BM细胞输注到BM抑制大鼠体内显著增加肝细胞增殖。

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图7

输注SPC可恢复BM抑制大鼠的正常肝再生。

(A类)动画实验设计。(B类)在以下组中对对照大鼠和PHx后5天（第12天）大鼠的肝脏重量进行了检查：未经照射的大鼠（仅PHx）、未经细胞输注的受照射大鼠（未经输注）、通过输注SPC抢救的受照大鼠（“SPC输注”）和通过输注BM细胞抢救的受照射鼠（“BM输液”）(n个= 4). 2.8克的水平线表示三分之二PHx后立即估计的肝脏重量。(C类)PCNA免疫染色检测PHx后第5天肝细胞增殖(n个= 3). ***P（P）与不输注组相比<0.001。

肝再生期间HGF增加的来源。

据报道肝损伤后肝细胞生长因子增加(2). 为了确定这是由于HGF在常驻LSEC中的表达增加还是由于富含生长因子的BM衍生SPC的涌入，在移植Lew-Tg（CAG-EGFP）ys BM的野生型Lewis大鼠中进行PHx。PHx后第3天，分离LSEC，将其分类为GFP⁺和GFP^–并检测HGF基因和蛋白质的表达。实时PCR显示显著升高血红蛋白GFP中的基因表达⁺与GFP中的细胞相比，淘洗LSEC部分（即BM衍生）中的细胞^–单元格（图​（图8A）。8A） ●●●●。GFP中HGF蛋白的表达^–PHx后的LSEC约为对照大鼠分离的LSEC的2倍，但GFP中HGF的表达⁺PHx后的细胞数量明显增加（图​（图8，8、B和C）。

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图8

骨髓源性SPCs在肝脏再生中的作用。

在PHx后第3天，从移植了Lew-Tg（CAG-EGFP）大鼠骨髓的野生型大鼠中分离出LSEC。(A类)血红蛋白实时PCR检测GFP中mRNA的表达⁺（BM衍生）和GFP^–LSEC。n个= 3; ***P（P）< 0.001. (B类)通过免疫印迹和(C类)通过密度测定法对对照LSEC（从非手术大鼠分离）和GFP进行定量⁺和GFP^–PHx后第3天分离出LSEC(n个= 3). *P（P）< 0.05, **P（P）与GFP相比<0.01^–PHx之后的LSEC。(D类)CD133型⁺对LSEC组分的细胞进行PCNA免疫染色，并通过FACS对GFP进行分类。n个= 3; ***P（P）<0.0001 PCNA百分比比较⁺GFP中的细胞⁺和GFP^–分数。

动物。

Sprague-Dawley、Lewis和Fischer大鼠从Harlan公司获得。Lew-Tg（CAG-EGFP）ys Lewis大鼠的繁殖对从密苏里大学NIH大鼠资源和研究中心获得。

PHx是在全身麻醉下进行的。70%的肝脏被切除。假手术包括剖腹手术和肝脏轻度活动。

本研究遵循了美国国家科学院编制、美国国家卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（美国国家卫生院出版编号86-23，1985年修订）中概述的指南。

LSEC隔离。

如前所述，通过胶原酶灌注、碘克沙醇密度梯度离心和离心淘析分离LSEC(12,13). 平均每只正常大鼠肝脏产生8400万个细胞，存活率超过95%。这些细胞的纯度为99%，这是通过摄取甲醛处理的血清白蛋白（挪威特罗姆瑟大学Bórd Smedsrod赠送）来确定的，这是LSEC特有的功能(24–26)在我们的实验室中，通过该方案分离的细胞具有筛板中的窗孔。过氧化物酶染色显示，库普弗细胞不到1%。如前所述，分离出门脉周围和小叶中心的LSEC(14).

SPC隔离。

通过免疫磁选CD133和CD45分离骨髓和外周血SPC，然后通过FACS分选CD31⁺需要PCNA染色或CD133免疫磁选的研究细胞，然后FACS分选CD45和CD31进行其他实验。对于双标记免疫磁选，用抗CD45 FITC抗体（1:10稀释，4°C下30分钟）培养BM和外周血单个核细胞，并用抗FITC微球（20μl珠，最多10⁷电池）在4°C下保持30分钟。使用autoMACS Pro（Miltenyi Biotec）进行磁性选择后，使用释放试剂夹住磁珠。CD45型⁺细胞与抗CD133微球（100μl微球，最多10个⁸细胞）在4°C下培养30分钟。

为了获得常驻SPC，根据LSEC分离方案，通过胶原酶灌注和碘克沙醇密度梯度离心获得非实质部分(12). 对第一个淘析步骤的淘析部分进行CD133检测⁺细胞。几乎所有CD133⁺在第一个淘洗步骤中，细胞从与LSEC相同的淘洗分数中回收，CD133⁺用这种方法分离的细胞被证实是LSEC祖细胞（见结果）。因此，通过分离LSEC和免疫磁选CD133获得常驻SPC⁺分数。

免疫染色。

肝脏组织冰冻切片用丙酮固定，LSEC盖玻片用4%多聚甲醛固定。将载玻片与抗PCNA、抗VEGF受体1、抗VEGF受体2、抗CD31、抗CD45或抗BrdU抗体（1:100稀释）在37°C下孵育1小时，并用共焦显微镜检查（蔡司LSM 510，卡尔蔡司显微成像公司）。

标签保留分析。

第3天新生幼鼠（Sprague-Dawley大鼠）在盐水中注射7剂50μg/g BrdU s.c.，在3.5天内每天两次。60天后，分离出LSEC；免疫磁珠筛选CD133；CD31、CD45和BrdU免疫染色；并用共焦显微镜检查。

流式细胞术。

0.5 × 10⁶将LSEC与PE结合的抗CD31抗体（1:100稀释）或TRITC结合的抗PCNA抗体（1:1100稀释）在4°C下孵育30分钟，并使用FACSCalibur（BD Biosciences）进行检查。使用Cell Quest Pro软件分析数据。

鱼。

30岁时通过胞浆制备将新分离的LSEC应用于载玻片克持续5分钟。FISH的执行与之前发布的相同(8). 用FITC-标记的抗地高辛（Boehringer-Mannheim，Roche）和含有100 ng/ml碘化丙啶（Molecular Probes）的防褪色贴装介质（Dako Corporation）检测Y染色体。如果在蔡司LSM 510共焦显微镜下看到一个带一个绿点的红核，则认为细胞呈阳性。在15个随机场中的每个场20个细胞中测定Y染色体的存在。只有当Y染色体处于可视化平面时，它才会被可视化。为了纠正Y染色体的非可视性，从对照雄性大鼠中分离出LSEC，并测定Y染色体阳性细胞的百分比。

辐照。

使用位于南加州大学诺里斯癌症研究所（University of Southern California Norris Cancer Research Institute）的瓦里安2300 c/d直线加速器的6 MeV X射线束，对侧骨盆和后肢（不包括爪子）进行800 cGy至2 cm深度的照射。

骨髓移植。

细胞取自供体胫骨和股骨的BM。受试者接受1000 cGy全身照射，并通过尾静脉注射50×10⁶骨髓细胞。BM在使用前允许移植2到3个月。采用两种骨髓移植模型。将雄性Fischer大鼠的骨髓移植到雌性Fischer鼠体内，并通过Y染色体的FISH检测进行追踪(8). 将来自雄性Lew Tg（CAG-EGFP）ys Lewis大鼠的BM移植到野生型雌性Lewis大鼠中，并通过GFP表达进行追踪。

统计。

数值数据表示至少3个单独实验的平均值±SEM。通过双因素方差分析与复制或双侧双尾Student’s吨测试，使用Microsoft Excel（Microsoft）分析工具包。如果方差分析有显著性，则使用最小显著性差异对各个点进行后验比较。P（P）<0.05被认为是显著的。

作者感谢Michelle MacVeigh-Aloni在免疫染色和共焦显微镜方面的帮助，以及Thomas Kampp在放射治疗方面的善意帮助。这项工作得到了NIH拨款R01-DK46357（L.D.DeLeve）和南加州大学肝病研究中心组织学和显微镜子核心（NIH拨款P30DK048522）的支持。