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神经科学杂志。2010年12月8日；30(49): 16509–16513.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.2442-10.2010
预防性维修识别码：PMC3313909型
尼姆斯：尼姆斯257105
PMID：21147990

重组狂犬病病毒转基因靶向性揭示特定神经元的单突触连接

阿尔迪斯·韦伯,1,* 莱斯利·施瓦茨,2的情况下，* 伊恩·维克沙姆（Ian R.Wickersham）,三 利亚·德布兰德,1 吴海燕,1 爱德华·M·卡拉威,4 H.Sebastian Seung先生,三和克利福德·G·肯特罗斯通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

了解神经回路是如何工作的，需要对细胞水平的连接性有详细的了解。我们目前对神经回路的理解受到现有跨突触追踪工具的限制。一些最棘手的问题是缺乏细胞对摄取的特异性，在融合直接和间接输入的多个突触步骤间的传递，以及对次要输入标记不良。我们使用了转基因小鼠技术和最近开发的基于狂犬病病毒的追踪系统的新组合(Wickersham等人，2007a,b条)克服所有三个限制。由于该病毒在初始感染和随后的逆行突触性感染中都需要转基因表达，我们创建了几种小鼠系，使用四环素依赖性反式激活剂系统在特定的细胞类型中表达这些基因(Mansuy和Bujard，2000年). 因此，病毒复制的荧光标记仅限于确定的神经元细胞类型及其直接的单突触输入。因为病毒复制不依赖于转基因表达，所以无论输入强度如何，它都能在突触前神经元中提供强大的信号放大。我们将病毒注射到在海马结构的特定细胞类型中表达病毒转基因的转基因杂交中，以证明病毒的细胞特异性感染和单突触逆行运输，这强烈标记了即使是微小的输入。这种重组狂犬病病毒的神经特异性转基因互补物有望获得哺乳动物中枢神经系统的细胞-分辨率接线图。

介绍

哺乳动物的中枢神经系统由大量的神经元组成，每个神经元通常与数千个其他神经元相连。发展对神经回路功能性理解的关键一步是阐明其连通性，这最好通过跨突触示踪剂实现。神经解剖学家使用了多种顺行和逆行示踪剂，包括凝集素(Köbbert等人，2000年)病毒(Kelly and Strick，2000年;Ugolini，2008年)以获得对大脑连通性的一般理解。然而，先前的方法存在局限性，无法在细胞水平上详细了解大脑的电路(罗等人，2008). 关键的局限性包括缺乏标签摄取的细胞特异性，难以确定给定神经元是单突触体还是多突触体连接到最初标记的神经元，以及标记强度的高度可变，使得很难可视化次要输入。我们提出了一种将重组狂犬病病毒与新型转基因小鼠相结合的方法，该方法首次克服了所有这三个限制，能够明确确定特定神经元细胞类型的直接单突触输入。

野生型狂犬病病毒以非特异性方式感染神经元，并沿突触逆行传播。重组病毒含有狂犬病病毒包膜糖蛋白（RG）的基因，该基因负责传染性和跨突触传播，从其基因组中删除并替换为荧光载体mCherry的基因（见材料和方法）。注射用狂犬病病毒[SADΔG-mCherry（EnvA）]在RG的细胞质域与禽肉瘤和白细胞病病毒蛋白EnvA的病毒包膜之间有一个融合蛋白（即假型），因此它只能感染表达EnvA受体TVA的细胞(Wickersham等人，2007a). 由于哺乳动物神经元不表达TVA，注射的病毒不能感染野生型神经元。在感染TVA阳性神经元后，病毒可以复制，强烈标记一级（即最初感染的）神经元，但由于其基因组缺乏RG，它不能自己感染其他神经元。因此，感染是由转基因表达决定的，逆行运输仅限于单个突触，而不受限制的病毒复制提供了强大的信号放大。

因此，我们将该病毒系统提供的跨突触特异性和信号放大与小鼠分子遗传学的解剖特异性相结合，以确定完整大脑中特定神经元细胞类型的单突触输入。我们从四环素反应杂交启动子（pTRE）中产生了八个能够表达两个转基因（TVAG）的转基因小鼠系紧的)（补充图S1，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料），当与表达四环素依赖性反式激活因子（tTA；tet-off）或反向tTA（tet-on）融合蛋白的反式激活子系杂交时（背景见Mansuy和Bujard，2000年). 然后将这些株系与我们使用CaMKIIα启动子创建的几个神经元特异性tTA株系交叉，并通过立体定向将重组病毒注射到双阳性（tTA和TVAG，或+/+）动物的海马结构中来证明神经元特异性单突触连接。

材料和方法

生物试剂的产生。

如前所述，产生了EnvA伪型慢病毒(Wickersham等人，2007a)但VSV糖蛋白表达载体被质粒pCMMP-EnvARGCD-IRES-EGFP替换(Wickersham等人，2007b)用狂犬病病毒糖蛋白的细胞质域编码EnvA包膜糖蛋白。用mCherry基因取代病毒糖蛋白基因的狂犬病病毒起始库存是Karl Klaus Conzelmann博士的慷慨礼物，产生了EnvA假型浓缩库存，并用EnvA包膜蛋白进行了假型(Wickersham等人，2007b). 含有myc标记的EnvA受体（TVA）和狂犬病病毒外壳蛋白（RG）的2441 bp片段，由口蹄疫病毒2A元件分离(Szymczak等人，2004年)从母体质粒中切下，定向克隆到pTRE的多克隆位点紧的（pTT）质粒（Clontech），包含一个专为严格转录控制设计的四环素转化依赖启动子。切割并纯化得到的构建物，用于原核注射。对于反式激活因子系，含有钙/钙调蛋白依赖性激酶IIα亚单位（CK2）启动子的质粒驱动密码优化的四环素反式激活剂（tTA或tetof），其两侧有loxP位点，以允许使用Cre重组酶进行切除。切割得到的结构以去除载体臂，并纯化凝胶以进行原核注射。我们还使用了一种市售的反式激活因子线，该线在CaMKIIα启动子[B6；CBA-Tg（Camk2a-tTA）1My/J小鼠；Jackson Laboratories，菌株#003010）]的前脑中表达tTA，这通常导致表达水平过于密集，无法满足我们的目的。

组织和解剖程序。

所有程序均按照俄勒冈州大学动物护理和使用委员会和国家卫生研究院《实验动物护理和应用指南》（NIH出版物编号：80-23）批准的指南进行。在本研究中，共有46只小鼠注射了病毒（补充表S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。使用两组引物通过PCR进行基因分型（补充图S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。海马CA1区注射狂犬病病毒50 nl，滴度9.9×108/ml）分别在距角的前后（AP）−2.0 mm和中外侧（ml）1.8 mm处进行，深度（背腹，DV）为1.1 mm9/ml）在距前角-1.7mm的AP−3.0mm处和ml-1.8mm处进行注射。另外还对M1（50 nl狂犬病病毒；AP，1.0mm；ml，1.3mm；DV，0.6mm）、内鼻皮层（50 nl狂犬病毒；AP，−4.8mm；ml-3.1mm；DV-1.0mm）和杏仁核（100 nl狂犬病毒；AP（−1.0mm）；ml-3.0mm；DV-4.0mm）进行了额外的对照注射。真正的野生型（TVA阴性）动物没有表达TVA的方式，而TRE-leak对照组没有tTA，因此对TRE系的泄漏进行了控制。tTA泄漏控制有两种类型：注射到已知不表达TVA mRNA的区域，以及注射到基因型双阳性但未能在靶结构中表达可检测量的TVA mRNA的动物中（尽管大多数在其他结构中的少数神经元中表达TVA mRNA，证实了基因分型结果）。

手术后7天（狂犬病病毒）或16天（慢病毒）处死小鼠；如前所述进行灌注和组织切片（30μm厚）(Wehr等人，2009年). 所有切片在室温下保存24小时，然后用就地TVA mRNA表达和荧光Nissl染色杂交（ISH）或储存于−80°C。

使用蔡司Axioplan显微镜观察切片。在处理mRNA表达或Nissl荧光之前，捕获病毒标记组织的所有显微照片。使用尼康Coolpix 3.34像素相机拍摄显微照片。未对显示感染或运输的显微照片进行图像后处理。在某些情况下，调整对比度和亮度以提高Nissl或mRNA图像的清晰度，但在任何单个合成图像或图形中始终保持相同的水平。显示了给定插图边界内的所有mCherry荧光神经元。复合材料和照片覆盖是使用Canvas X软件（ACD Systems）创建的。

如前所述执行非放射性ISH(Wehr等人，2009年). 核糖探针模板是从pTT/TVAG结构中切除的TVA基因片段中克隆出来的，并连接到pBSKS+中（补充图S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。在存在T3 RNA聚合酶和双标记核苷酸的情况下，使用BamHI线性化pTVA核糖探针模板生成492 bp的转录物。在室温下培养过夜后，用MABT缓冲液5×5′在室温下清洗切片，然后用碱性磷酸酶染色缓冲液2×10′清洗切片，之后添加3.5μl/ml NBT、2.6μl/ml BCIP和80μl/ml左旋咪唑，并在37°C搅拌下使比色反应发展3 h。用PBS（0.1%吐温20）进行两次洗涤，然后在去离子H中进行两次清洗，从而停止反应2O.ISH后，对切片进行荧光尼塞尔染色处理（使用1:30 PBS稀释的NeuroTrace；N21480型或N21482号; Invitrogen）。

切片后立即对组织进行检查（不考虑基因型），以确定注射部位的位置和显微照片，并对与病毒感染和/或传播相关的任何荧光信号进行分类。在对mRNA和Nissl染色进行处理后，对感染和/或转运明显的切片进行显微摄影，并对图像进行叠加以进行分析。

结果

感染特异性

为了证明细胞特异性感染，将TRE-TVAG系与我们基于CaMKIIα启动子建立的一系列前脑特异性tTA表达的多个tTA驱动系交叉(Mayford等人，1996年)并注射病毒（补充表S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。每个杂交都有不同的转基因表达模式，从单个神经元亚型中极为稀疏的表达到前脑大多数初级神经元中相对密集的表达。尽管表达更密集的十字架提供了最具美学冲击力的图像（例如。，图3D类,E类)，那些表达得非常稀疏的可以说信息量更大，因为人们可以更容易地计数受感染的神经元并可视化单个过程。细胞特异性感染最直接的证明是用mCherry和TVA mRNA进行双重标记，但狂犬病病毒感染似乎会破坏转基因表达，这使情况变得复杂。我们看到了mRNA和mCherry标记密度之间的反比关系（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），可能是由于病毒感染。我们通过注射GFP标记的慢病毒[LV-CMVP-eGFP（EnvA）]伪型，与注射的狂犬病病毒具有相同的EnvA-RG融合蛋白，以证明感染的特异性，从而规避了这个问题。由于慢病毒不能跨突触转运，标记的神经元一定是直接感染的结果。这表明感染对TVA阳性神经元的限制；感染慢病毒的每一个少数神经元也表达TVA mRNA(图1).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns9991092380001.jpg

病毒感染的转基因规范。一个，EnvA-假型慢病毒控制注射部位的位置。B–D，所有感染的（绿色）神经元被包围，并与TVA ISH进行比较(B类)确定转基因表达(C类)尼塞尔染色计数细胞核(D类). 尽管只有少数神经元为mRNA阳性（191/1015），但每一个受感染的神经元均为mRNA-阳性（43/43），这表明感染限制于转基因神经元。海马CA1区；海马CA3区；DG，齿状回；S、 副心室。

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对次要投入进行强有力的标记。一个–E类、矢状面合成图像(一个,B类,E类)和冠状的(C类,D类)显示逆行病毒（mCherry）向海马锥体神经元（包括边缘丘脑）相对较小输入的切片(一个,C类)，腹侧被盖区(B类)和基底前脑胆碱能核(D类,E类). 以及mCherry标签（中间），E类显示了CA1神经元通过穹窿伞通过Nissl（左）和Nissl覆盖层（右）与基底前脑胆碱能核的连接。海马CA1区；DG，齿状回；3V，第三脑室；伏隔核，核心；cc，胼胝体；Cg2，扣带回皮质，2区；CM，丘脑中央内侧核；df，背穹隆；f、 穹隆；fr，反屈束；gcc，胼胝体膝；ic，内囊；LSI，外侧隔核，中间部分；LV，侧脑室；MDM，丘脑内侧核，内侧部；MS，内侧隔膜；mt，乳头丘脑束；ns，黑质纹状体束；opt，视神经束；Re，重新聚合丘脑核；胼胝体脾；VDB，布罗卡对角线带的垂直肢；VTA，腹侧被盖区。

由于重组病毒具有复制能力，理论上只需感染一个病毒就可以标记。这种方法的一个积极特点是，即使是很小的输入也能清晰地标记出来，但它也有潜在的缺点：极少量TVA的泄漏表达可能导致注射部位周围的标记神经元，即使没有检测到mRNA水平。由于这会破坏该方法核心的特异性，我们通过进行三种不同的对照注射来研究感染的紧密性（见补充表S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料，以总结所有注射）。野生型注射进入在基因上不能表达任何病毒蛋白的动物（即TVAG−/tTA−和TVAG–/tTA+窝友），以测量重组病毒感染组织的能力。然而，一个杂交的两个转基因系（tTA×TVAG）中的任何一个的漏表达也可能导致感染，因此我们也对TVAG+动物进行了两种对照注射。一种（TRE-leak对照）涉及将病毒注射到TVAG+/tTA-动物体内，以测试来自混合TRE启动子的tTA-非依赖性转录。最后，正如驱动TVA的杂交启动子可能泄漏一样，驱动tTA的启动子也可能泄漏，这可能通过在感兴趣的细胞外驱动tTA依赖性TVA表达而类似地降低特异性。我们通过将病毒注射到TVAG+/tTA+动物中未显示TVA mRNA的大脑区域来测试这种潜在的tTA泄漏，这两种方法都选择了不表达mRNA的区域，并且因为最稀疏的交叉（例如涉及TVAG2系的交叉）有时不表达可观数量的TVA mRNA。

在所有情况下，只在+/+小鼠中观察到重组狂犬病病毒的强劲摄取、复制和逆行运输（补充表S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。绝大多数野生型对照注射（13/14只TVAG阴性动物）完全没有导致感染，但与已知的EnvA对哺乳动物细胞的低水平嗜性一致(Wickersham等人，2007a,b条)，向野生型动物注射一次，在注射部位附近产生三个标记神经元。三个TRE-leak（tTA−/TRE-TVAG+）对照组也表现出少数神经元感染（7±4）。然而，由于他们都来自同一个品系（TVAG6），并且其他TRE-leak对照组均未表现出任何感染，因此我们得出结论，这种泄漏是该品系插入部位特有的，我们已终止该品系。也许最令人信服的感染特异性证明来自tTA-泄漏控制，即基因型+/+动物，注射部位周围没有显示TVA mRNA。在9次这样的注射中，7次没有产生感染细胞，而其余两次平均产生4个荧光神经元。值得注意的是，后两种动物是杂交的，在其他+/+动物中，CA1中的mRNA表达稀疏但可检测。

尽管这三种对照注射中的每一种都有少量导致少数神经元感染，但没有一种在距离注射部位>200μm处出现病毒标记，也没有任何已知对受感染神经元具有突触前作用的神经元出现病毒标记。这表明，尽管偶尔转基因mRNA的菌株特异性泄漏可能会触发mRNA阴性神经元的感染，但这些神经元并不表达足够的病毒糖蛋白来支持感染竞争性狂犬病病毒颗粒的组装。因此，感染似乎受到转基因表达的严格控制，只有当注射靶向明确表达TVA mRNA的神经元时，除一株外，所有TVAG菌株都表现出EnvA介导的感染。此外，标记的逆行运输仅限于mRNA阳性神经元。

单突触运输

我们选择集中精力研究CA1锥体神经元，因为它们不仅具有非常好的连接性特征，而且是已知的为数不多的几个相互连接的神经元细胞类型之一（有关综述，请参阅Amaral和Lavenex，2007年)这大大方便了一级神经元的识别。因此，我们使用在少数CA1锥体神经元中稀疏表达病毒转基因的杂交来提供某种程度的跨突触病毒标记量化，并证明逆行转运到单个突触的限制。将病毒注射到背侧CA1层锥体后，在注射部位周围的小部分锥体神经元和推测的中间神经元中观察到mCherry标记(图2和补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。如上所述，病毒标签和TVA mRNA在CA1中密度相似，并且呈反相关。总之，它们与对侧海马中TVA mRNA的模式非常相似，表明只直接感染转基因CA1锥体神经元（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

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病毒运输的单突触限制。在CA1锥体细胞层中注射SADΔG-mCherry（EnvA）的转基因交叉的矢状截面。一个，仅Viral mCherry标签。B类，节与相同一个与TVA mRNA杂交。该杂交仅在小部分脑室下层和CA1锥体细胞层神经元中表达TVA mRNA，而在CA3锥体神经元中不表达。如图所示一个病毒运输仅限于CA1锥体神经元（CA3神经元）的直接突触前输入，齿状颗粒神经元（已知为CA3锥体神经元的突触前神经元）中没有标记。注意注射部位周围的信使核糖核酸表达和病毒信号之间的反相关性，可能是由病毒干扰宿主细胞基因表达引起的。海马CA1区；海马CA3区；DG，齿状回；hf、海马裂。

目前的结果令人信服地表明，跨突触标记仅限于单个突触。最明显的表现是齿状回（DG）完全没有标记(图2，补充表S2，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料），该项目为CA3而非CA1（有关审查，请参阅Amaral和Lavenex，2007年). 据估计，狂犬病病毒只需要24小时就可以穿过突触(Ugolini，2008年)，这不太可能是因为感染后时间不足（7天）。然而，即使只有少数CA1锥体神经元受到感染，在其主要的单突触输入中，如同侧和对侧的CA3，也可以看到单个神经元的强大标记(图2和补充图S3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）和内嗅皮层（补充图S3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）（有关审查，请参阅Amaral和Lavenex，2007年).

次要单突触输入的明确标签

由于病毒具有细胞内复制能力，即使是单个病毒颗粒感染也会导致神经元的强烈标记(Wickersham等人，2007年a). 尽管这一事实使得这种方法很容易泄漏，如上所述，但通过对相对较小输入的神经元进行强烈标记，它确实解决了神经解剖学中另一个长期存在的问题。图3在已知直接投射到海马锥体神经元较弱的区域，显示出强烈的神经元逆行标记（有关综述，请参阅Amaral和Lavenex，2007年)比如边缘丘脑(图3一个,C类)，腹侧被盖区(图3B类)和基底前脑胆碱能核(图3D类,E类)以及推测的CA1中间神经元和蓝斑神经元（数据未显示）。这些数据表明，病毒复制能够放大来自微弱输入的信号，将这些神经元标记得与提供主要突触输入的神经元一样清晰。

讨论

上述数据说明了这种病毒和转基因相结合的方法的巨大潜力。这两种病毒以前都实现了示踪剂摄取的细胞特异性(DeFalco等人，2001年)和转基因(Braz等人，2002年)这意味着，但之前的方法还没有能力将传输限制在单个突触步骤，并且无论输入强度如何，都能获得稳健的信号。因此，这种设计用于补充重组狂犬病病毒的转基因小鼠组合似乎解决了研究人员在试图确定哺乳动物中枢神经系统连接性时面临的一些最棘手的问题。病毒式方法以前有过描述。将感染和转运所需的转基因随机导入培养脑片(Wickersham等人，2007a,b条)或进入单个皮层细胞(Marshel等人，2010年). 然而，我们的锥体细胞数据最明确地证明了该系统最显著的特征，即对单个突触的转运限制。此外，转基因方法为系统提供了有价值的模块化；这些TRE-TVAG线可以与任何神经元特异性四环素反式激活物线交叉，以赋予其感染的特异性，从而有可能研究存在tTA驱动线的任何神经元细胞类型的连接性。因此，将这些线分布到科学界应该能够确定对任何可能感兴趣的神经细胞类型的直接单突触输入。

尽管上述属性使其成为一种独特而强大的方法，但它也有其局限性。突触前CA3锥体神经元的标记比例相对较小，令人困惑。先前的估计表明，单个CA3锥体神经元可能会与多达30000至60000个CA1锥体神经元突触(Li等人，1994年). 如补充图S4所示（可从网址：www.jneurosci.org作为补充材料），我们在量化的四种CA1感染中观察到的CA3（二级）与CA1锥体神经元的比率始终低很多数量级（补充表S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。转化诱导的转基因糖蛋白表达下调可能会限制感染性病毒在一级神经元中的生成量，这将导致仅在一小部分上游神经元中进行病毒标记。病毒糖蛋白可能有一个临界浓度，这是组装抗感染病毒所必需的，因此感染时转基因表达的水平可能决定标记的上游神经元的比例。此外，尽管神经元在细胞结构上看起来正常，但宿主细胞mRNA表达的下调（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）可能对受感染的神经元产生有害影响，尽管这对于使用狂犬病病毒作为载体而不是作为示踪剂来说是更重要的问题。

然而，即使系统不能给神经元提供准确的输入数量，这个缺点也与所有竞争方法相同。例如，用于估计CA3–CA1连接的填充神经元的静脉曲张的计数充满了警告，特别容易高估功能性突触。此外，如果系统被一个一致的标量关闭，那么它仍然可以提供有用的定量数据，正如我们量化的四次注射的CA1–CA3比率的相似性所表明的那样（补充图S4和表S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

总之，细胞特异性、单突触转运和明确标记的综合特征使这种方法具有独特的价值；标记特定细胞类型的单突触连接具有重要价值。然而，系统的特异性将需要相应的努力来确定一级和二级神经元的细胞类型；除非以相等的粒度确定标记神经元的身份，否则细胞选择性被浪费。如果这些挑战得到了满足，本文提出的重组狂犬病病毒的转基因补充将是系统神经科学的一个宝贵工具，能够用精确电路建模和重建所需的细胞级分辨率来确定哺乳动物大脑的连通性(Seung，2009年).

脚注

由国家精神卫生研究所拨款R21 MH076289和国防部拨款W81XWH-09–2-0114资助，由国家神经疾病和中风研究所拨款RC2 NS069464资助，由E.M.C.和C.G.K.资助，由霍华德·休斯医学研究所资助，由H.S.和I.R.W.资助。我们感谢升学实验室的Heather Sullivan提供的杰出技术援助，以及Karl-Klaus Conzelmann博士启动SADdG-mCherry库存。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会