多西环素的治疗潜力测试黑腹果蝇阿尔茨海默病模型^*

免疫组织化学

在含有0.05%（v/v）Triton X-100的PBS中通过解剖分离苍蝇脑，并在室温下将其固定在4%（v/v）多聚甲醛中1h。用0.05%（v/v）Triton X-100在PBS中清洗大脑三次，并在室温下用5%（w/v）牛血清白蛋白封闭1小时。小鼠抗Aβ抗体（6E10，Signet）在封闭缓冲液中以1:1000稀释，与组织孵育过夜。在进一步清洗三次后，将组织培养在山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 546（Invitrogen）中，并用TOTO-3（Invitorgen）进行复染，然后安装在Vectashide（Vector Labs）中。使用尼康E90i立式支架（尼康）上的尼康Eclipse C1si，以2或4μm的间隔采集共焦串行扫描图像。使用ImageJ（版本1.42k）投影图像堆栈，并使用Photoshop CS4软件（Adobe Systems）处理最终合成图像。

蛋白质提取和蛋白质印迹

每种基因型的25只苍蝇在液氮中被snap冷冻并通过旋涡斩首。用1%（w/v）SDS和蛋白酶抑制剂（Complete，Roche）在PBS中均质苍蝇头。匀浆以18000×克持续2分钟，取出上清液并称为“可溶性Aβ级分”。然后在尿素（9米尿素，1%（w/v）十二烷基硫酸钠，25 m米三氯化氢，1 m米EDTA），超声处理，并在55°C下保持1 h。在18000×克，并去除上清液，称为“不溶性Aβ部分”。蛋白质浓度通过洗涤剂相容性（DC）蛋白质分析（Bio-Rad）测定。将等量的蛋白质加载到4–12%（w/v）丙烯酰胺双/三SDS-PAGE凝胶（Invitrogen）上。电泳发生在非还原条件下，蛋白质被半干法转移到硝化纤维素膜上。使用小鼠单克隆抗Aβ抗体（6E10，Signet）检测Aβ。所有的印迹均使用超信号West Femto最大灵敏度ECL基板（Pierce）进行显影。

多西环素溶液的制备

将盐酸多西环素（Sigma）溶解于蒸馏水中，并通过0.2μm过滤器（Orange Scientific）过滤，以一定浓度（0、20、50、100和360μm）等分米)将苍蝇培养在混合了等量的所需浓度多西环素和速食苍蝇粉的培养基上（菲利普斯科学公司）。

生存分析

按照Crowther的描述进行生存分析等。(30). 简单地说，每个基因型的100只苍蝇被收集起来，分成10只苍蝇的试管，保存在25°C下，然后转移到含有0μ米, 20 μ米, 50 μ米，和100μ米强力霉素，每2-3天服用一次。每2-3天统计一次活蝇和失访蝇的数量。生存曲线采用Kaplan-Meier图和log-rank统计分析进行分析。

攀登试验

为了评估攀爬行为，10只苍蝇表达Aβ40、Aβ42肽和Gal4-elav公司^{155立方厘米}驾驶员被放置在一个高圆筒（25ml组织培养移液管）的底部，并允许攀爬30秒，然后按照前面所述确定顶部和底部的苍蝇数量(31). 计算了成虫羽化至第36天期间成虫的攀爬行为表现指数。实验重复了三次。

粗略的眼睛表型评估

对照组和北极Aβ42苍蝇与GMR-镀锌4苍蝇在发育中的眼睛中驱动转基因表达。苍蝇在发育过程中始终保持在25°C的温度下，食物中含有0至100μ米多西环素和子代保持在相同的温度。在羽化后的第1天和第5天，用干冰/乙醇将苍蝇冷冻，并使用配备尼康数码相机（370万像素）的尼康SMW-U光学显微镜记录其复眼的结构。用相同的显微镜设置拍摄苍蝇眼睛的照片。ImageJ用于估计每只眼睛的面积。为了量化小眼，我们确定了眼睛的一个特定部位，在那里我们可以很容易地计数小眼，然后估计其面积。将小眼的数量除以所选区域，并将其呈现出来。每只眼睛的面积和小眼的数量表示为对照苍蝇眼睛的大小之比，并对每种情况下总共四只眼睛进行了分析。

硫黄素T结合测定和透射电镜

通过Th-T结合试验测定Aβ42肽的聚集。Aβ在50μ时溶解米50米米Tris HCl（pH 7.5），并在37°C下与100μ米和360μ米强力霉素在不同时间点（0天和5天）使用。激发光谱记录在Horiba荧光分光光度计上，温度为25°C，30μ米50 m内的Th T（Fluka）米pH9.0的甘氨酸/NaOH缓冲液，在1ml的测定体积中。通过绘制450nm处的荧光强度，即Th-T结合形成的特征激发最大值，显示了结果。实验至少重复了三次。

为了通过TEM进行可视化，将等分样品（10μl）吸附在200米铜格栅支撑的辉光碳涂层配置膜上，并用1%（w/v）乙酸铀酰进行负染。用60 kV的蔡司显微镜（EM10C型）观察网格。实验重复三次。

动态光散射（DLS）测量

在633 nm的动态光散射仪器（Zetasizer Nano ZS，Malvern仪器）上测量在有或无强力霉素的情况下生成的物种的大小。所有测量均在25°C下进行，检测角度为173°。50μ米50 m内的Aβ42米将Tris HCl（pH7.5）与100μ米或360μ米对多西环素（在蒸馏水中制备）和不同时间点（0天和5天）的粒径进行分析。使用Malvern DTS软件的多窄模算法对相关函数进行分析，得到粒度分布的强度。实验重复了三次。

细胞培养和Caspase 3测定

SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞系）在6孔板中增殖，并在95%（v/v）湿化空气和5%（v/v）CO中保持在37°C₂培养基由Dulbecco的最小必需培养基和添加1%（w/v）非必需氨基酸（Invitrogen）的火腿F12（1:1）组成，2 m米 我-谷氨酰胺、10%（v/v）FBS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Lonza）。按照制造商的说明，使用CaspACE荧光96-well平板分析系统（Sigma）测量caspase 3的激活。简单地说，10μ米单独或在10μ米将多西环素（在蒸馏水中）在37°C下加入80%的融合细胞中，在无FBS的培养基中培养5天，然后再培养24小时。这些是在不含Aβ的情况下与细胞孵育的多西环素，并在加入细胞之前将多西环素刺入预聚集的Aβ。随后对每个孔进行胰蛋白酶化，并在100μl低渗裂解缓冲液（Sigma）中对细胞颗粒进行裂解。然后重复使用每种细胞裂解液40μl，以测定caspase 3的活化。剩余的细胞裂解物用于用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒测量总细胞蛋白质浓度，该试剂盒使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。显示的数据是重复数据的平均值，实验进行了三次。

多西环素不影响Aβ42苍蝇的寿命

在神经系统中表达Aβ的苍蝇和对照苍蝇暴露于培养基中的一系列强力霉素浓度（0、20、50和100μ米)在整个成长期和成年期。

尽管对照组和Aβ40苍蝇的中位生存期为78天，相比之下，表达Aβ42的苍蝇死亡更快，中位寿命为47天(图2,n个= 100,第页< 0.001). 在一定浓度范围内添加强力霉素对上述任何飞行线路的寿命都没有影响。此外，药物治疗对表达GFP的独立苍蝇系的寿命没有影响(图2).

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图2。

多西环素不会影响Aβ42苍蝇的寿命。对照组的中位生存期（天）(浅灰色柱)，Aβ40(黑色立柱)、GFP(深灰色柱)和Aβ42(选中的列)苍蝇在25°C下培养并转移到含有0μ米, 20 μ米, 50 μ米，和100μ米每2-3天服用一次强力霉素。与对照组、Aβ40和GFP苍蝇相比，Aβ42苍蝇的寿命显著缩短。然而，强力霉素给药并未影响任何分析表型的寿命。***，第页与对照组、Aβ40和GFP苍蝇相比<0.001。

多西环素缓解Aβ42表达的苍蝇的运动障碍

根据定义，寿命缩短是我们模型系统中可以测量到的最新表型，因此我们转向运动分析，以检测早期AD相关神经元功能障碍。具体而言，我们进行了攀爬试验，以确定多西环素是否可以延缓与Aβ42表达相关的与年龄相关的运动能力加速下降。

对照组苍蝇和表达Aβ40和GFP的苍蝇的攀爬行为表现出预期的与年龄相关的逐渐减少（性能指数从第5天的85%下降到第22天的70%，到第36天的30%，图3和补充图S1). 相比之下，表达Aβ42的苍蝇表现出更早、更快的运动能力下降（表现指数从第5天的85%下降到第15天的20%，到第26天之后为零，图3和补充图S1). 用不同浓度的强力霉素处理对照果蝇和表达Aβ40和GFP的果蝇对其任何年龄段的爬升能力都没有影响(图3和补充图S1). 相反，多西环素挽救了表达Aβ42的苍蝇的运动能力，在第15天将其爬升指数提高到40%，以获得最低的药物浓度（20μ米). 这种效果与药物浓度有关，在50μ米强力霉素，在该浓度下，在第15天时，Aβ诱导的运动活动减少得到完全缓解(图3). 此后，神经保护作用一直维持到第19天(补充图S1).

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图3。

多西环素改善Aβ42苍蝇的运动性能。第5天对照组、Aβ40、GFP和Aβ42苍蝇的性能指数（爬升%）(浅灰色条)和15(黑色条). 第5天后观察到的Aβ42苍蝇的运动障碍被50μ米强力霉素治疗。***，第页与第5天的相同浓度相比<0.001；###，第页< 0.001; ##,第页与浓度0μ相比<0.01米为期15天；&，第页与浓度20μ相比<0.01米为期15天。

多西环素部分挽救Aβ肽粗视表型

D.黑腹果蝇有一个复眼，包含大约800个小眼。小蜂的正常规则排列可能会因携带有毒转基因而受到干扰GMR-镀锌4(35,36). Aβ42在果蝇属如前所述，29°C下的视网膜组织产生轻微的粗糙眼表型，同时伴有眼睛尺寸的缩小(30). 虽然强度较小，但在25°C时也观察到这种表型。Arctic Aβ42的表达导致更显著的表型(30)并允许我们筛选100μ米强力霉素或单独使用载体。

对照组苍蝇在添加或不添加强力霉素的情况下，眼睛的大小没有随时间变化(图4A类,上部面板、和B类). 相比之下，强力霉素部分缓解了北极Aβ42诱导的第0天和第5天苍蝇眼睛尺寸减小(图4A类,下部面板、和B类).

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图4。

多西环素部分缓解了北极Aβ42表达引起的粗糙眼表型。 A类光学显微镜下的眼睛表型分析显示北极Aβ42苍蝇的眼睛尺寸缩小和小眼畸形(下部面板)与对照果蝇相比(上部面板)服用或不服用强力霉素。B类，对照组和北极Aβ42苍蝇（未经治疗和使用强力霉素100μ米，显示该药物能够促进部分恢复。**，第页与0μ相比<0.01米在第0天；###，第页<0.001与0μ相比米第5天；++，第页与100μ相比<0.01米第0天。C类，未经治疗和使用强力霉素100μ米在第0天和第5天，表明该药物能够促进羽化时观察到的不规则性的部分恢复，第页<0.001与0μ相比米第0天和第5天；##，第页与100μ相比<0.01米第0天。

关于小眼不规则性，对照苍蝇表现出温和的表型(图4C类)表明Gal4本身在眼睛发育过程中具有轻微毒性。在第0天用强力霉素治疗后，Aβ42表达的苍蝇中观察到的更明显的不规则性部分被挽救(图4A类,左下面板、和C类). 在第5天，尽管观察到了一种趋势，但在经过治疗和未经治疗的北极Aβ42苍蝇之间没有观察到显著差异(图4A类,右下面板、和C类)，表明Aβ的积累克服了强力霉素的能力，以保护其免受肽的有害影响。

多西环素减少Aβ42肽体外聚集

通过Th T荧光评估强力霉素对Aβ42聚集的影响，这是一种专门报告β-片状结构存在的方法(37,38)，在两个时间点。第0天，50μ米Aβ42单独或与100μ米和360μ米强力霉素，未能显示Th T荧光信号(图5A类). 然而，在第5天，Aβ42肽显示荧光强度增加，当肽与100μ米和360μ米药物的(图5A类). 我们排除了强力霉素和Th T通过额外的对照（星号在里面图5A类)在那里，我们让肽在没有强力霉素的情况下聚合完成，然后用360μ米就在Th T荧光测量之前。

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图5。

多西环素阻碍Aβ42肽的构象进展。 A类，50μ的Th-T结合分析米合成Aβ42单独培养或与不同浓度的多西环素（0、100和360μ米)，显示药物降低Aβ42淀粉样蛋白生成潜能的能力。多西环素在360μ米至荧光测量前的Aβ42(360*).***，第页<0.001与0μ相比米和360*μ米为期5天；##，第页与100μ相比<0.01米为期5天。B类Aβ42单独或在100μ米和360μ米强力霉素0(上部面板)和5(下部面板)天，表明该药物能够以剂量依赖的方式抑制Aβ纤维生成。比例尺=200纳米。C类，仅Aβ42的DLS分析(顶部面板)或与100个(中央面板)和360μ米(底部面板)强力霉素在0(左侧面板)和5天(右侧面板)，表明该药物能够减小Aβ形成颗粒的大小。

当使用TEM观察相同的Aβ样品时，对照反应在第0天显示出小而圆的Aβ低聚物(图5B类,左上面板)而在第5天，长的、不分枝的、直径为10-nm的纤维是最主要的物种。此时未检测到低聚物、聚集体或其他中间物种(图5B类,左下面板). Aβ与100μ米与单独使用Aβ相比，多西环素5天可生成更薄、更短的纤维，但未发现小聚集体或低聚物(图5B类,底部中间面板). 该药物的作用具有剂量依赖性。将其浓度增加到360μ米导致形成类似于潜伏期开始时发现的小结构。原纤维的存在很少，检测到的少数原纤维也比对照制剂中发现的原纤维更薄、更短(图5B类,右下面板).

当使用DLS进一步研究相同的肽制剂时(图5C类)我们观察到，随着时间的推移，粒径（半径-r，nm）的进展因是否存在多西环素而不同。最初，Aβ呈现为半径为10–100 nm的物种的异质制剂。在37°C下放置5天后，样品由半径约为2000 nm的均匀物种组成(图5C类，第0天和第5天的比较）。存在100μ米强力霉素作用5天可产生较小的聚集物，范围为1200–1900 nm(图5C类,中央右侧面板). 360μ处理的Aβ肽米强力霉素也持续5天，显著减少了生成物种的数量(图5C类,右下面板)从而产生了两个种群，稀有物种分布在8-20nm范围内，而更丰富的种群分布在150-840nm范围内。