结果
BDNF和前BDNF抗体显示出类似的染色模式
用8周龄动物制备的海马切片与单克隆BDNF抗体Mab#9（抗BDNF；)或具有识别BDNF前体蛋白（抗-pro-BDNF）的多克隆抗体；). 来自年龄匹配小鼠的组织被改造为从神经元中删除BDNF(cbdnf ko公司;Rauskolb等人，2010年)用作负CON(). 此外，敲除鼠系的片段表达Bdnf-Myc公司(;松本等人，2008年)与Myc抗体（抗Myc）孵育，野生型（WT）组织用作CON(). 这三种不相关的抗体产生了惊人相似的染色模式(). 尤其是，BDNF-、前BDNF-和Myc-免疫活性（IR）在苔藓纤维投射途径的细胞体和轴突末端中分布最为显著，而组成CA1区的各层仅轻度染色，尤其是在隔海马中。
α-BDNF、α-Myc和α-pro-BDNF抗体都产生类似的染色模式。（A） BDNF前体pro-BDNF和两种裂解产物pro-peptide和BDNF的示意图。（B） 用抗BDNF抗体染色的WT海马切片的低倍视图。请注意DG门和CA3的SL中的强染色，每个都包含苔藓纤维的轴突末端。（C和D）的DG（C）和CA3区域（D）的高倍视图cbdnf ko公司海马体用抗BDNF染色。注意所有细胞层和神经膜层均无免疫反应信号。GCL，颗粒细胞层；H、 门；IML，内分子层；PCL，锥体细胞层。（E）Bdnf-Myc公司用Myc抗体染色的海马显示出与BDNF抗体相似的染色模式。（F和G）注意用Myc抗体处理的WT切片的相应DG（F）和CA3区域（G）没有染色。（H） 多克隆前BDNF抗体产生与抗BDNF相似的模式。（I和J）相同的抗体在海马切片中不会产生免疫反应信号cbdnf ko公司动物。（B、E和H）箭头表示苔藓纤维突起的末端鳞茎，描绘CA3和CA1。注意WT和Bdnf-Myc公司部分。棒材：（B、E和H）500µm；（C、F和I）100µm；（D、G和J）50µm。
在神经元亚群中检测到BDNF-IR
对齿状回（DG）的BDNF-IR进行低倍镜检查，发现锥体上下叶中存在免疫阳性颗粒细胞亚群(). BDNF-IR在标记细胞中强度不同，染色集中在染色体顶端(，插图）。抗原-BDNF染色仅限于含有BDNF-IR的颗粒细胞的同一亚群()，染色体前BDNF–IR也集中在顶点(，插图）。此外，含有颗粒细胞苔藓纤维侧支轴突的肺门区被强烈染色(). 在CA3区，锥体神经元的一个子集也显示BDNF-IR()和pro-BDNF–IR(). 用抗Myc和抗-前BDNF标记的切片，以及针对高尔基体基质蛋白GM130的抗体的高分辨率检查，显示了整个细胞体和初始树突段的Myc-IR()而pro-BDNF–IR显示出相似的分布，尽管更具点状(). 与GM130-IR比较显示，前BDNF阳性点状物与高尔基体密切相关(). 与此一致，抗原-BDNF免疫金标记将该蛋白定位于CA3体细胞高尔基复合体(). 在CA1中，在颞海马部分的少量锥体神经元中也检测到BDNF和前BDNF协同表达（未发表的数据）。
在主要神经元亚群中检测BDNF-IR和前BDNF-IR。（A–C）DG的低功率共焦叠加。相同的颗粒细胞亚群（箭头）共存于BDNF-IR（A）和前BDNF-IR（B）。插图中方框区域被放大，显示单个BDNF-阳性（A）和前BDNF-正（B）颗粒细胞，用DAPI（蓝色）复染，标记集中在不同簇（箭头）的细胞顶端，BDNF和前BDNF信号部分重叠（C，插图）。GCL，颗粒细胞层；H、 门；IML，内分子层。（C） 合并后的图像显示了两个信号的重叠。（D–F）CA3区的共焦叠加，显示了锥体细胞体亚群中的BDNF-IR（D）和pro-BDNF–IR（E）（箭头）。Nuclei标有DAPI。SL中突出的红外波段对应于苔藓纤维突起的末端部分。PCL，锥体细胞层。（F） 请注意叠加图像中红色和绿色信号的均匀重叠。（G–J）单个CA3神经元的高分辨率共焦叠加，标记有针对Myc（G）、pro-BDNF（H）和GM130（I）的抗体。请注意，延伸至顶端树突（箭头）的Myc-IR（G）和pro-BDNF–IR（H）与高尔基复合体密切对应（J，合并图像）。箭头标记来自细胞体的初始树突状片段。（K） 电子显微照片显示由抗-BDNF原免疫金标记的CA3神经元的高尔基复合体（箭头所示）。成簇的金颗粒聚集在高尔基体的蓄水池周围。棒材：（A–F）100µm；（G–J）10µm；（K） 500纳米；（A–C，插图）5µm。
在突触前终末检测到BDNF-IR和pro-BDNF-IR
颗粒细胞产生苔藓纤维轴突，其靶点包括CA3神经元近端树突上的复杂棘。苔藓纤维穿过并终止于透明层（SL），其特征是具有显著的特化末端，称为苔藓光纤束（MFB）。因此，在SL中观察到较强的BDNF-IR和pro-BDNF-IR(和). 使用高分辨率共焦显微镜，发现BDNF-IR和pro-BDNF–IR都与MFB的同一子集共定位().
BDNF-IR突触前定位。（A–C）SL的高分辨率光学切片，显示同一MFB子集中的Myc-IR（A）和pro-BDNF–IR（B）（箭头）。（C） 注意覆盖图中红色和绿色点的显著共定位。（D和F）合并用Myc和SYP（D）或Myc和VGLUT-1（F）抗体标记的SL图像。（E和G）虽然BDNF阳性点子与SYP-和VGLUT-1阳性点子密切相关，但高倍镜下的仔细观察显示这两个标记物（箭头）分离，证实BDNF在突触前表达，但不在突触小泡中表达。（H–M）伴随有针对Myc和Met-enk的抗体。在共表达Myc-IR（H）和Met-enk–IR（I）的颗粒细胞的小亚群中，点刺类似地分布在整个细胞中，但几乎没有重叠（J）。星号表示原子核的位置。类似地，SL中一小部分MFB（箭头）共表达Myc-IR（K）和Met-enk–IR（L）；然而，在合并的图像（M）中，Myc-和Met-enk-IR点不重叠。（N–P）SL的高分辨率光学切片，显示Myc-IR（N）和CCK-IR（O）在苔藓纤维末端的表达。单星号标记CCK-IR配置文件，双星号标记Myc-IR配置文件。（P） 合并后的图像表明苔藓纤维投影中两种肽完全分离。（Q） CA1区域SR的高分辨率共焦图像BDNF-Myc公司鼠标。用抗Myc抗体标记显示BDNF在细轴突中的定位（Q-S中的细箭头）。（R） 用synpo抗体进行Colabeling可揭示树突棘的相对位置。（S） 抗Myc和抗ynpo标记切片的重叠显示了BDNF的突触前定位，BDNF-IR和synpo阳性棘之间紧密并列（Q-S中的白色圆圈和填充箭头）。棒材：（A–C、E、G和K–S）5µm；（D） 30微米；（F） 50微米；（H–J）10µm。
然后应用其他标记物来鉴定含有BDNF-IR的囊泡类型，并将BDNF与已知由颗粒细胞顺行运输的其他肽的分布进行比较。正如所料，BDNF-IR没有与突触囊泡标记物突触素（SYP；)或VGLUT-1(). 然后，我们测试了与甲-脑啡肽（Met-enk）的可能共定位，这是一种阿片肽，也来源于较大的前体蛋白，并储存在致密核心囊泡（DCV；Cheng等人，1995年). 在一小部分颗粒细胞及其轴突中，在整个细胞体和初始树突段中检测到Met-enk–IR(). 尽管Met-enk阳性颗粒细胞总是共表达BDNF-IR()，这两个前驱体衍生分子的免疫反应信号保持分离，表明它们不在同一分泌囊泡中共存(). 胆囊收缩素（CCK）也得出了类似的结论，CCK是一种沿着小鼠腹侧海马苔藓纤维投射途径运输的神经肽(Gall等人，1986年). 抗CCK和-BDNF的双重标记显示这两种肽在MFB中完全分离().
CA1区也观察到突触前BDNF标记，在放射层（SR），用抗BDNF标签的薄静脉曲张突起()和抗原-BDNF（未描述）稀疏分布于整个神经膜，可能对应于源自BDNF阳性CA3神经元的突触前Schaffer侧支轴突。重要的是，BDNF-IR与突触后标记突触蛋白（synpo；).
BDNF和前BDNF抗体标记突触前终末的分泌囊泡
用BDNF和前BDNF抗体进行免疫金标记后，在2000倍放大的条件下检查SL的超薄切片。MFB是根据其典型的形态学特征进行鉴定的，即突触小泡密度高、与CA3复合棘的大量突触接触、非突触粘连斑在树枝状轴和相对较大的表面积。用抗BDNF标记的MFB配置文件的子集()、anti-Myc（未描述）或anti-pro-BDNF()含有明显的金颗粒聚集体；在10000倍放大下，这些金团簇被发现与电子致密膜包裹的大囊泡有关。虽然囊泡有时被金颗粒掩盖，但偶然的颗粒分布偶尔会显示出一个电子密度高的核(，插图）。在MFB配置文件内cbdnf ko公司切片中，金颗粒从未与任何类型的细胞器明确相关(). 为了评估MFB剖面图中免疫金颗粒的密度，在抗BDNF和抗-pro-BDNF标记组织中对金簇和单个金颗粒进行量化，并在合并WT的切片之间进行比较/Bdnf-Myc公司小鼠和cbdnf ko公司老鼠。抗-BDNF标记的MFB剖面显示平均密度为2.67±0.35簇/µm2WT中/Bdnf-Myc公司动物与0.38±0.12簇/µm相比2（P＜0.005）英寸cbdnf ko公司配置文件(). 此外，单个金颗粒密度在cbdnf ko公司MFB轮廓，5.63±0.94晶粒/微米2与21.99±2.57晶粒/微米相比2WT中/Bdnf-Myc公司（P<0.005）；). 同样，前BDNF免疫金标记显示平均密度为2.01±0.43簇/µm2和27.44±8.21个单颗粒/µm2在WT的MFB配置文件中/Bdnf-Myc公司动物，而相比之下，来自cbdnf ko公司动物集群显著减少（0.14±0.10/µm2; P<0.05；)和单颗粒（5.82±2.06/µm2; P<0.05；)密度。
MFB中BDNF的超微结构定位和前BDNF免疫金标记。（A） 用抗BDNF免疫金预先标记的WT SL超薄切片的电子显微照片。许多金簇（箭头）与布顿内的大型分泌囊泡有关（见插图）。sp，树突棘。（B–D）一种抗-pro-BDNF标记的WT MFB，包含簇标记的分泌囊泡（箭头所示）。插图展示了一个标记的大DCV。在来源于cbdnf ko公司小鼠，证实WT切片中信号的特异性。（E和F）WT与cbdnf ko公司MFB。来自WT和BDNF-Myc公司老鼠(n个=5，对于抗BDNF和n个=4（对于抗-pro-BDNF），金簇（E）和单金颗粒（F）的密度显著高于来自cbdnf ko公司老鼠(n个= 3). *, P<0.05；**，P<0.005。误差线代表SEM。误差线：（A–D）500 nm；（A和B，插图）50 nm。
虽然BDNF免疫金标记主要集中在突触前终末，但在SL的无髓轴突段也偶尔观察到标记的小泡()在偶然的截面上可以看到，这会产生巨大的MFB().
终末前轴突中BDNF和前BDNF免疫金标记。（A） 在用抗BDNF抗体处理的切片中，在无髓鞘苔藓纤维轴突中观察到标记的囊泡（箭头和插图）。（B） 电子显微照片显示苔藓纤维终接成一个隆起（虚线轮廓）。箭头指向一个带有抗-pro-BDNF标记的囊泡（参见插图），该囊泡可能正在到达终点。ax，轴突；sp，树突棘。（C） CA1中SR突触前末端的抗-BDNF标记。观察到大型银增强金簇（箭头）。at，轴突末端。（D） 切片的抗-BDNF染色cbdnf ko公司产生了非特异性背景标记。棒材：（A–D）500 nm；（A和B，插图）100 nm。
此外，还对SR（CA1）的超薄切片进行了检测，标记有抗BDNF和抗原-BDNF免疫金，如预期的那样，在小轴突末端观察到了大的簇标记分泌囊泡(). 根据SR的近端-远端水平，这些罕见的标记Bouton可能对应于Schaffer侧支终末或内鼻终末。在cbdnf ko公司截面().
树突中未检测到BDNF-IR和pro-BDNF-IR
接下来，我们通过分析抗Myc和抗微管相关蛋白-2（MAP-2）双重标记的切片，检查BDNF在树突中的可能定位。在BDNF阳性颗粒细胞和CA3神经元中，Myc-IR仅延伸至最初的树突状片段，在SL中没有共同定位的证据(). 另一种方法是用Arc/Arg3.1抗体标记切片，Arc/Arg是突触活动增强时体细胞和树突中上调的一种即时早期基因产物(Lyford等人，1995年). 共聚焦扫描显示，大多数标记有BDNF-IR和前BDNF-IR的颗粒细胞也表达Arc/Arg3.1-IR(). 尽管Arc/Arg3.1-IR在细胞体和树突状乔木中都可见，但BDNF-IR和前BDNF–IR的强共表达仅限于细胞体().
BDNF-IR不延伸到近端树突以外。（A） CA3区的Myc-IR显示锥体细胞层（PCL）的免疫反应性神经元胞体（星号）和SL的Myc-阳性MFB剖面。（B）抗MAP-2染色显示CA3区锥体细胞树突的分布。（C） 合并后的图像证实Myc-IR优先局限于锥体细胞层的细胞体和SL突触前终末。（A–C）箭头表示近端顶端树突的Myc-IR有限。（D–F）用BDNF（D）、BDNF前体（E）和Arc/Arg3.1（F）抗体标记的DG的高分辨率共聚焦堆栈。填充的箭头标记为Arc/Arg3.1-阳性、BDNF-阴性细胞，而打开的箭头显示为BDNF-阳性、Arc/Arg 3.1-阴性细胞。GCL，颗粒细胞层；H、 门；IML，内分子层。（G） 合并后的图像显示，大多数表达BDNF-IR和前BDNF–IR的颗粒细胞也显示Arc/Arg3.1-IR。（H–M）树突中的非特异性BDNF和前BDNF免疫金标记（den）。在用BDNF（H）或前BDNF的（K）抗体标记的WT切片中，金颗粒分布在树突中，但没有标记任何特定的细胞器。在cbdnf ko公司用相同抗体标记的切片，BDNF（I）和BDNF前体（L）抗体的金颗粒分布与WT树突相似。枝晶中金颗粒密度的量化显示，混合WT之间没有差异/Bdnf-Myc公司与cbdnf ko公司用BDNF（J）或BDNF前体（M）抗体标记的组织。误差线代表SEM。误差线：（A–G）30µm；（H、I、K和L）500纳米。
在预先标记有抗BDNF或抗前BDNF免疫金的超薄切片中，金颗粒稀疏分布在树突轮廓内(). 当对轮廓进行彻底检查以确定是否存在特定标记的小泡或内体时，未发现任何小泡或内胚体的染色程度高于在树突中观察到的背景水平cbdnf ko公司截面(). 抗BDNF标记片段的金颗粒定量()平均密度为3.56±0.45粒/微米2在WT中/Bdnf-Myc公司小鼠对4.72±0.91粒/微米2在里面cbdnf ko公司小鼠（P=0.81）。同样，在抗前BDNF染色的切片中，WT的平均密度是可比较的/Bdnf-Myc公司小鼠（4.69±1.09粒/微米2)和cbdnf ko公司小鼠（4.08±2.02粒/微米2; P=0.31；).
BDNF-IR和前BDNF-IR在中国的本地化英国标准协会突变体
接下来，我们检查了缺乏突触前蛋白巴松蛋白的小鼠的海马，因为这些突变体会发展为发作性全身性癫痫(Altrock等人，2003年)大脑皮层和海马增大(Angenstein等人，2007年). 在癫痫发作的同时，BDNF蛋白水平显著高于CON同窝成年鼠的水平（参见;Heyden等人，2011年). 鉴于巴松(英国标准协会)突变体显示了BDNF-IR和前BDNF–IR的典型分布模式，观察到染色强度急剧增加，主要局限于神经膜（与CON相比具有英国标准协会在里面). 相反，颗粒细胞体英国标准协会突变体没有显示抗BDNF的增加()或抗-pro-BDNF()染色强度，尽管与CON组织相比，标记的细胞比例要高得多。分子层中的颗粒细胞树突在英国标准协会突变体，而在CA3区域，BDNF-IR显著增加()和pro-BDNF–IR()仅限于SL。仔细检查发现MFB轮廓中有强烈的突触前标记()与突触后标记synpo缺乏共定位证实了这一点()和MAP-2()分别是。
BDNF染色升高英国标准协会突变体。（A–D）CON组织的代表性图像，显示DG（A）和CA3区域（C）中的抗BDNF标记，以及DG（B）和CA2（D）中的反-pro-BDNF–Mab5H8标记。GCL，颗粒细胞层；H、 门；IML，内分子层；PCL，锥体细胞层。总体分布和染色强度与WT和Bdnf-Myc公司动物（E–H）在英国标准协会DG（E和F）门以及SL（G和H）门的突变片段BDNF-和pro-BDNF-Mab5H8-IR显著增加。请注意，相关细胞层，即GCL（E和F）和CA3的锥体细胞层（G和H）的染色缺乏成比例的增加。（I和J）GCL的高倍镜检查显示，尽管标记较弱，但仍有大量BDNF阳性（I）和前BDNF–Mab5H8-阳性（J）颗粒细胞，标记局限于细胞体，内分子层中未检测到树突状染色。（K和L）在SL中英国标准协会突变体的标记谱密度增加，BDNF-IR（K）和pro-BDNF-IR-Mab5H8（L）分别与突触后标记synpo（绿色；K）和MAP-2（红色；L）几乎没有重叠。棒材：（A–H）100µm；（I和J）30µm；（K和L）15µm。
BDNF及其前肽和前BDNF的生化检测。用抗原-BDNF抗血清或BDNF抗体以及WB和所示抗体对海马裂解物（500µg）进行IP。（A） 在WT（第一车道）中检测到前BDNF及其前肽，但在WT中未检测到cbdnf ko公司样本（第二条车道）。在IP和/或WB（未描述）中使用前BDNF抗体AN-03获得类似结果。HIP，海马；IB，免疫印迹；非糖。，非糖基化；rec.，重组。（B） 注意，前肽与前BDNF的比率与BDNF和前BDNF-的比率相似(n个= 3). 误差条表示三个测量样品的SEM。（C） 海马裂解物的IP/WB分析英国标准协会与CON组织（左、右、第一道）相比，突变体显示BDNF和pro-BDNF（左、第二道）以及pro-peptide和pro-BDNF（右、第二车道）的水平相对相似（约为三倍）的增加。重组BDNF前肽和抗裂解前BDNF被用作分子质量标记。
增强BDNF染色英国标准协会突变体不仅局限于颗粒细胞-CA3投射途径。在CA1区域，BDNF-IR通常只能在高倍率下检测到（比较具有和)在SR和lacunosum–molecular层（SL-M；图S1，A–C)与已知的内嗅皮层纤维的藏匿区域相对应(阿马拉和拉瓦内克斯，2006年). 重要的是，这些增加的信号共定位（图S1 D），显示与synpo-IR（图S1E）或胶质纤维酸性蛋白（GFAP）-IR（图S1F）没有重叠，它们分别标记树突棘和反应性星形胶质细胞。这表明内嗅神经元也可能是CA1神经元的BDNF突触前来源。
WT和WT的免疫金标记切片英国标准协会然后在2000倍放大镜下检查突变体。与CON动物相比()，在来自英国标准协会突变体()突触膜上聚集簇状物。通过量化证实了这一点，抗BDNF标记的MFB含有明显更高密度的金簇（1.7±0.3簇/µm2;)和颗粒（14.4±2.5颗粒/µm2;)与CON相比（0.8±0.01簇/µm2P<0.05和6.9±0.5格令/微米2分别P<0.05）。类似地，来自英国标准协会突变体还显示出较高的金簇密度（2.02±0.27簇/微米2;)和颗粒（17.2±2.8颗粒/µm2;)与CON曲线相比（0.96±0.04簇/µm2P<0.005和10.1±0.9晶粒/微米2分别P<0.05）；平均簇密度相对较低的增加是由于英国标准协会突变体。
MFB中BDNF阳性DCV密度较高英国标准协会突变动物。（A和B）用BDNF（A）或BDNF原（B）免疫金预先标记的CON切片中MFB的电子显微照片。偶尔在末端的子集中观察到金簇标记的分泌囊泡（箭头）。sp，树突棘。（C和D）在MFB中英国标准协会突变体中，无论是BDNF（C）还是前BDNF（D）免疫金，簇标记囊泡（箭头）和单个金颗粒的数量都有所增加。den，树突。（E和F）这已通过量化证实。误差条代表SEM。误差条，500 nm。
还比较了两者在枝晶中的金晶粒分布和密度英国标准协会突变体()和CON组织(). 再次仔细检查树突状轮廓，寻找标记小泡的证据，但在两组的组织中均未发现任何标记小泡。密度测量显示背景值英国标准协会突变小鼠与CON小鼠中观察到的小鼠相似，都是在标记有抗BDNF（5.4±0.4格令/微米）的组织中2对于英国标准协会突变体与5.7±0.5粒/µm2对于CON；P=0.66；，左侧）和抗-pro-BDNF（5.1±0.1 grains/µm2对于英国标准协会突变vs.6.3±0.3格令/微米2对于CON；P=0.12；，右侧）。在细胞外间隙或非神经元细胞类型（如星形胶质细胞）中未检测到标记密度增加。
BDNF不是针对树突的英国标准协会突变体。（A–E）CON（A和C）中SL的枝晶（den）与英国标准协会突变组织（B和D）显示，无论是BDNF免疫金（E，左）还是前BDNF抗体金（E（右）），金颗粒密度都没有差异。还应注意CON和英国标准协会突变动物。误差条代表SEM。误差条，500 nm。
背景免疫金标签的验证
为了确定背景金标记是否均匀分布在不同的亚细胞隔室中，我们将定量金颗粒分析扩展到了SL中的树突状棘剖面和有髓轴突剖面，因为它们没有集群标记的细胞器。对覆盖在这些剖面上的单个金颗粒的定量分析表明，背景金标记的密度取决于亚细胞室的类型(). WT/Myc与cbdnf ko公司或WT与英国标准协会突变组织。因此，WT小鼠的脊椎和有髓轴突的抗BDNF和抗-pro-BDNF免疫金标记不高于cbdnf ko公司组织，也不包含专门标记的细胞器。
表1。
| 抗-BDNF免疫金 | 抗-pro-BDNF免疫金 |
| 亚细胞轮廓 | WT/Myc公司 | cbdnf ko公司 | 反对的论点 | 英国标准协会 | WT/Myc公司 | cbdnf ko公司 | 反对的论点 | 英国标准协会 |
| n=3 | n=3 | n=4 | n=4 | n=3 | n=3 | n=4 | n=4 |
| 枝晶岩一 | 3.6 ± 0.5 | 4.7 ± 0.9 | 6.9 ± 0.9 | 6.6 ± 0.7 | 4.7 ± 1.6 | 4.1 ± 1.5 | 6.3 ± 0.3 | 5.1 ± 0.1 |
| 脊椎 | 19.3 ± 2.1 | 18.4 ± 3.8 | 15.0 ± 1.4 | 13.1 ± 0.9 | 18.2 ± 1.2 | 20.3 ± 4.5 | 13.8 ± 0.6 | 14.3 ± 1.6 |
| 髓鞘化轴突 | 9.6 ± 1.8 | 11.6 ± 0.7 | 8.3 ± 0.5 | 8.1 ± 1.2 | 12.2 ± 0.8 | 10.7 ± 0.7 | 8.5 ± 1.1 | 10.1 ± 1.5 |
BDNF前肽的生化检测和定量
然后使用WT和突变小鼠的海马裂解物确定免疫化学实验中BDNF抗体识别的分子的身份(cbdnf ko公司和英国标准协会). 免疫沉淀物通过Western blotting（WB）进行分析，并用BDNF多克隆抗体N-20或单克隆抗体5H8进行探测，该抗体识别BDNF前体中的一个表位(). 这些实验表明，不仅存在前BDNF（～32 kD），而且还存在更丰富的前肽（～17 kD；; 另请参见). 两种信号在来自cbdnf ko公司动物(). 相应信号强度的量化显示，前肽与前BDNF的比值为～10.3±2.0(n个= 3;)类似于BDNF对前BDNF的作用（11±2.0；n个= 3;). 海马裂解物的类似分析英国标准协会突变体证实在突变组织中BDNF、其前肽和前BDNF各增加约三倍(). 这些结果还表明，BDNF和前肽与前BDNF的各自比率与在WT动物中观察到的相似。值得注意的是，只有在转移膜戊二醛固定后，才能一致检测BDNF前肽（见材料和方法）。此外，在所使用的裂解液和培养条件下，在提取程序开始时添加到裂解液中的重组原-BDNF（500 pg）没有可测量的蛋白水解(图S2). 添加重组前BDNF的回收率为102.2±5.8%(n个= 4).
讨论
我们的研究表明，在成人海马中，BDNF及其裂解前肽储存在兴奋性神经元突触前末端的大DCV中。WT和英国标准协会突变小鼠BDNF及其前肽的储存量大致相等，在海马裂解物中的含量是前BDNF的10倍。再加上树突或棘中缺乏任何可检测的BDNF染色，我们的研究结果为BDNF在完整中枢神经系统中的顺行作用模式提供了直接支持。它们还为最近的发现提供了形态学基础，表明内源性BDNF的释放解释了在CA3神经元树突突触位点观察到的一些快速钙瞬变(Lang等人，2007年).
材料和方法
免疫染色组织的制备
老鼠(n个=WT为7，n个=7Bdnf-Myc公司,n个=4，用于cbdnf ko公司、和n个=7英国标准协会突变体）经心灌注0.9%NaCl，然后在pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲液（PB）中混合4%PFA、0.1%戊二醛和0.3%苦味酸。取出大脑并用0.1M PB中的4%PFA后固定1小时，然后在0.1M PB中彻底洗涤。在振动仪（Leica）上切割海马体的冠状切片（50µm），并收集在0.1 m PB中。沿着海马隔颞轴的切片被进一步处理，用于免疫荧光标记或预埋免疫金标记。
免疫染色抗体
用小鼠抗BDNF单克隆抗体Mab#9（抗BDNF-；Kolbeck等人，1999年)针对BDNF的成熟域（参见). 该抗体还识别未分离形式的BDNF，即前BDNF(;松本等人，2008年).BDNF-Myc公司用山羊多克隆c-Myc抗体（抗Myc；SC-789；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）检测。使用针对BDNF蛋白前体的兔多克隆抗体（抗-Pro-BDNF；#ANT-006，批次AN-03；Alomone Labs）检测Pro-BDNF（参见). 为了确定用抗原-BDNF获得的信号是否也可以用其他抗BDNF前体的抗体观察到，我们测试了一种商业上可买到的小鼠单克隆前BDNF抗体（抗原-BDNF–Mab5H8；SC-65514；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。该抗体产生的染色模式（如图图例所示）与多克隆抗-pro-BDNF的结果相当。用针对囊泡谷氨酸转运体1（抗-VGLUT-1；#135511；Synaptic Systems）的小鼠单克隆抗体和针对SYP（抗SYP；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）的兔多克隆抗体检测突触前成分；对于突触后标记，针对MAP-2（抗MAP-2；#M2320；Sigma-Aldrich）的小鼠单克隆抗体、针对脊椎器蛋白synpo（抗synpo；#S9567；Sigma-Aldrich）的兔多克隆抗体和针对活性相关细胞骨架蛋白的豚鼠多克隆抗体（抗Arc/Arg3.1；#156005；Synaptic Systems）使用了。针对130-kD高尔基基质蛋白（抗GM130）的小鼠单克隆抗体用于检测高尔基复合体（#610822；BD）。为了标记苔藓纤维投射物内的神经肽，使用了兔抗Met-enk（抗Met-erk；Millipore）和CCK（抗CCK；#P06307；Millipore）的多克隆抗体。用抗GFAP的豚鼠多克隆抗体血清检测星形胶质细胞（抗GFAP；#031223；Advanced ImmunoChemical Inc.）。
免疫荧光
由于抗Myc抗体的初步染色实验在WT小鼠的切片中产生了高水平的非特异性染色，因此将Myc抗体溶液与WT切片预孵育，然后使用该溶液对WT小鼠切片进行染色Bdnf-Myc公司和WT小鼠。除了第一个封闭步骤外，所有抗体的染色方案都是相同的，并且始终使用pH值为7.4的TBS来清洗切片。为了用多克隆抗体染色，用20%的正常驴血清在TBS中封闭切片1h；为了用单克隆抗体染色，在TBS中用3%的M.O.M（鼠对鼠阻断血清；Vector Laboratories）封闭切片1小时。将初级抗体在3%BSA、2%正常驴血清和0.2%Triton X-100的TBS溶液中稀释，得到以下最终浓度/稀释液：10µg/ml抗BDNF，0.4µg/ml抗Myc、1.33µg/m1抗pro-BDNF、3.3µg/ml抗-VGLUT-1、4µg/m抗SYP、0.9µg/m2抗GM130、2µg/mlAnti-Arc/Arg3.1、4μg/ml抗MAP-2、1:2000抗synpo、3µg/ml抗Met-enk、1:2000抗CCK和1:1000抗GFAP。切片在4°C的温度下在一种或多种主要抗体中培养至少一晚。对于荧光信号检测，使用了以下Alexa Fluor共轭二级抗体：驴抗兔-488或-555、驴抗山羊-555或-488、驴抗鼠-555或-647和驴抗豚鼠-Cy5（均购自Millipore）。将贴有标签的部分安装在玻璃载玻片上，盖上荧光安装介质（Dako）。
共焦显微镜
在倒置显微镜（Axiover 200；卡尔蔡司）上观察免疫标记海马的载玻片切片，倒置显微镜配备有平面Apochro 20×（0.75 NA）或63×（油差干涉对比度；1.4 NA）物镜，并连接到由LSM 4.2 Meta软件（卡尔蔡斯）驱动的光谱共焦激光系统（LSM 510；卡尔蔡斯）。在室温下使用488、543和633 nm激光线扫描组织，分别检测Alexa荧光团488、555和647，并使用连续线扫描（四个平均值）捕获光学切片（z切片）的高分辨率图像。在每个光学截面的x、y和z平面上定性评估两个或三个荧光团的颜色化。在图图例中所示的位置生成共焦z系列（堆栈）的最大投影图像。在Photoshop CS（版本8.0.1；Adobe）中，使用级别或对比度/亮度功能对图像对比度和强度进行了最小调整。使用CorelDRAW 12软件（Corel Corporation）对图像进行排列和注释。
免疫金EM
免疫金预标记。
来自WT的灌流固定海马的50µm振动切片，Bdnf-Myc公司,cbdnf ko公司、和英国标准协会突变小鼠在50 mM TBS（pH 7.4）中彻底清洗，并浸入低温保护溶液中2小时（0.05 M PB中25%蔗糖和10%甘油），然后在液氮冷却的异戊烷中速冻。在立即解冻并在0.1 M PB中清洗后，将切片在封闭溶液中培养1小时（3%M.O.M.在TBS中用于抗BDNF染色，20%正常山羊血清在TBS内用于抗前BDNF和抗Myc染色），然后在4°C的3%BSA/TBS溶液中培养一到三个晚上，该溶液含有20µg/ml抗BDNF，1.33µg/ml抗-pro-BDNF（AN-03）或0.4µg/ml抗Myc抗体。在TBS中彻底洗涤后，将切片在含有1.4nm金缀合的山羊抗小鼠、山羊抗兔或兔抗山羊IgG的3%BSA/TBS溶液中于4°C孵育过夜。切片在TBS中冲洗，然后在1%戊二醛溶液中固定10分钟。使用银增强试剂盒（HQ银；纳米探针）放大组织结合的金颗粒。然后将切片在0.5%OsO溶液中渗透40分钟4在0.1 M PB中添加6.86%蔗糖。
嵌入。
渗透后，在0.1 M PB中清洗切片，然后使用50%乙醇（EtOH）。然后将组织在70%EtOH中的1%乙酸铀酰中培养35分钟，然后进行10分钟的脱水步骤，以增加EtOH的等级。在环氧丙烷中清洗后，将组织嵌入Durcupan（Fluka）中。将选定海马区（DG、CA3和CA1）的超薄切片（60 nm）切割并安装在formvar镀镍网格上。切片在电子显微镜（LEO 906E；卡尔蔡司）中观察和检查。
免疫金染色定量
WT黄金标记部分，Bdnf-Myc公司,cbdnf ko公司、和英国标准协会首先在电子显微镜中以6000至12000倍的放大倍数对突变动物进行检查，然后使用双速电荷耦合器件相机（TRS SharpEye；Troendle）和分析采集软件（Soft Imaging System；Olympus）拍摄CA3 SL中包含标记结构的区域。MFB根据其明确的形态进行明确识别（见结果中的标准）。如果MFB中的细胞器与至少四个金颗粒相关（在本研究中描述为簇），则认为该细胞器已被标记。然后选择含有标记细胞器的MFB进行定量分析，其中手动计算每个波顿剖面的簇数，并使用cell^P软件（软成像系统）同时测量每个剖面的面积和周长。然后，将每根布顿的簇数重新表示为密度测量值（即每µm的簇数2MFB）。虽然在cbdnf ko公司切片显示与任何特定细胞器都没有关联，它们仍然包含在计数中。除了聚类量化之外，WT中MFB中单个金颗粒的各自数量，Bdnf-Myc公司,cbdnf ko公司、和英国标准协会突变组织也被测定，并最终表示为密度测量值（即每µm颗粒数2MFB）。
为了量化树突轮廓中的金标记，对组织的初步定性分析显示，完全缺乏簇标记的细胞器，包括大型分泌囊泡和内体。因此，为了比较不同动物组树突中的金颗粒密度，计算每个树突轮廓中的单个金颗粒数量，并将其表示为对应轮廓的面积（即每µm的颗粒数量2).
最后，为了确定背景金颗粒标记是否均匀分布在不同的亚细胞隔室中，将定量金颗粒分析扩展到SL中的另外两个隔室，即树突棘剖面和有髓轴突剖面。这两个隔室的选择是基于同样没有集群标记的细胞器。
免疫沉淀（IP）和WB
从8周龄的WT上解剖海马，cbdnf ko公司、和英国标准协会突变小鼠，然后称重并储存在−80°C下。加入10vol/wt的放射免疫沉淀测定缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1%Triton X-100和0.2%脱氧胆酸钠）。为了防止蛋白质水解，将新制备的蛋白酶抑制剂，包括蛋白酶抑制剂混合物（Roche）、10µM 1,10-菲咯啉一水合物、10 mM 6-氨基己酸和10µg/ml抑肽酶添加到缓冲液中。对组织进行超声波处理，对匀浆进行离心，并收集上清液。使用BDNF单克隆抗体Mab#9或针对BDNF前肽制备的兔多克隆抗体对500µg总蛋白进行IP(Koshimizu等人，2009年)根据制造商的说明，在含有蛋白质G琼脂糖（罗氏）的情况下。印迹后，在室温下用0.5%戊二醛将蛋白质固定在膜上30分钟，并用多克隆兔抗BDNF N20（sc-546；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）或单克隆小鼠抗原-BDNF Mab5H8（1:200）进行探测，使用IP Western试剂盒（GenScript）消除蛋白质G的非特异性信号。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行信号强度测量。重组野生型和抗切割前BDNF(Fayard等人，2005年)以及小鼠BDNF前肽在转染了质粒巨细胞病毒载体中克隆的相应cDNA的COS7细胞中产生。然后根据已知数量的纯化BDNF前肽测定这些蛋白质的浓度大肠杆菌(Koshimizu等人，2009年). COS7衍生的抗劈裂pro-BDNF用作分子质量标记，而WT-pro-BDNF用于组织裂解物的回收实验（图S2）
统计分析
所有值均表示为平均值±SEM。对于BDNF和前BDNF免疫金定量，每WT 10-20 MFB和30-40树突，Bdnf-Myc公司,cbdnf ko公司、和英国标准协会对突变小鼠进行分析，并计算每只动物的平均值。集团指（合并WT/BDNF-Myc公司与。cbdnf ko公司WT与。英国标准协会变种）使用双面学生的t吨测试。P<0.05的概率被认为具有统计学意义。
