类风湿性关节炎患者外周血单核细胞中hRasGRP4转录物的异常剪接和该信号蛋白水平的降低

细胞分离

使用Ficoll-paque PLUS（瑞典乌普萨拉Amersham Biosciences）从健康个体或患者抽取的约10 ml外周血中采集PBMC。CD14号机组⁺使用微珠和磁性细胞分选分离单元（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）从产生的PBMC中纯化细胞。CD14、CD3和CD19微球通过负选择富集PBMC中的非单核细胞、非T细胞和非B细胞。这部分被认为含有未分化细胞，包括肥大细胞祖细胞[28]. 还使用RosetteSep人类T细胞浓缩鸡尾酒（StemCell Technology，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）从PBMC中纯化T细胞。对于CD14，获得的细胞的纯度通常大于85%⁺髓系细胞和>95%的CD3⁺T细胞，分别使用藻红蛋白标记的抗CD14抗体和抗CD3抗体（BD Biosciences）在FACS Calibur流式细胞仪（BD bioscience，San Jose，CA，USA）上进行评估。

RA患者中hRasGRP4转录水平的评估和新hRasGRP4转录物的分离

使用RNeasy Mini试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）从整个PBMC和分离的细胞中收集总RNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen）将获得的转录物转化为cDNA。然后用PCR方法扩增hRasGRP4 cDNA的编码区，该方法使用正向5’-AGCATGAACAGAAAGACAGATAAG-3’和反向5’-TGTCTTAGGAATCGGCTTGGA-3’引物，这些引物对应于GenBank登录号中注明的正常hRasGP4转录物中翻译起始和终止位点的核苷酸序列[NM:170604]分别是。经过热变性步骤后，后续PCR步骤的25个循环中的每一个都包括94℃下的15 s变性步骤、59℃下的30 s退火步骤和72℃下的1.5 min延伸步骤。编码看家蛋白人类甘油醛-3-磷酸脱氢酶（hGAPDH）的转录物在这些转录物分析中起控制作用。

采用实时定量PCR（qPCR）方法监测38名健康人、41名RA患者和36名其他风湿性疾病患者分馏细胞系和PBMC中hRasGRP4转录物的总体水平。在这些实验中，使用ABI Prism 7000序列检测系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）和针对hRasGRP4（Hs00364781m1）和hGAPDH（Hs00266705m1）的TaqMan MGB探针，将hRasGRP4转录物的水平标准化为hGAPDH转录物的浓度。我们在这些qPCR中选择了一组hRasGRP4特异性引物，用于识别位于外显子7和8之间的连接核苷酸序列。使用可比较的循环阈值（C_T型)ΔC的方法_T型是RNA样本中hRasGRP4转录物相对于hGAPDH转录物的水平。每个样本中hRasGRP4转录物表达的差异被定义为mRNA水平的折叠变化2^-ΔΔCT.

还使用从16名健康人、23名RA患者（18名接受治疗，5名未接受治疗）、，和20名其他自身免疫性疾病患者（5名SLE患者，5名干燥综合征患者，5名炎症性肌炎患者和5名系统性硬化症患者。在每一个实例中，将产生的hRasGRP4 cDNA亚克隆到pcDNA3.1 V5 His-TOPO（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中，并且使用ABI Prism 3130遗传分析仪（Applied Biosystems）对来自每个个体的五个任意选择的cDNA进行测序。

巨噬细胞和破骨细胞中hRasGRP4转录水平的评估

巨噬细胞从外周血CD14中分化出来⁺使用先前报道的技术在几种细胞因子存在下的细胞[29]. 简言之，巨噬细胞是通过培养CD14获得的⁺细胞在M-CSF（50 ng/ml）的存在下。在37°C的湿度室中培养7天后，收集分化细胞。破骨细胞在M-CSF（33 ng/ml）和RANK配体（66 ng/ml）的存在下分化（Lonza Walkersville，Inc.，Walkersvelle，MD，USA）。14天后，收集细胞。从每个细胞系收集RNA，并使用针对hRasGRP4和hGAPDH的TaqMan MGB探针检测两个细胞系的hRasGRP4表达。评估破骨细胞组织蛋白酶K（分化破骨细胞的特异标记之一）的表达，以确认其分化（探针ID:Hs00166156m1）（应用生物系统）[30]. 还检测了RasGRP1在PBMC和破骨细胞中的表达（探针ID:Hs00996734m1）（Applied Biosystems）。

使用抗肽方法获得识别hRasGRP4 N末端的抗体

针对新的14聚体合成肽MNRKDSKRKSHQEC产生兔抗hRasGRP4抗体，该肽对应于hRasGP4正常亚型的N末端。基本局部比对搜索工具（BLAST）的蛋白质搜索显示，在任何其他已知人类蛋白质中没有类似序列。使用该合成肽，产生并纯化兔抗hRasGRP4多克隆抗体，如前所述，用于产生兔抗hRasGRP1抗体[7]. 所生成的抗hRasGRP4抗体的特异性通过使用免疫印迹和免疫组织化学中用于免疫的相同肽的吸收试验得到证实，该肽使用上皮细胞系HEK-293（系CRL-1573；美国型培养物收藏）的裂解物进行免疫用表达载体转染，用C末端V5表位标签编码hRasGRP4（数据未显示）。

利用哺乳动物细胞系和无细胞转录-翻译实验制备重组hRasGRP4蛋白

编码hRasGRP4及其剪接变异体（变异体5和6）的表达结构被转染到通常缺乏hRasGRP4的上皮细胞系HEK-293中。将编码正常RasGRP4及其剪接变异体的cDNA亚克隆到pcDNA3.1 V5-His-TOPO（Invitrogen）中。我们制作了带有或不带有C端子V5标记的hRasGRP4构造。使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）进行转染。通过SDS-PAGE免疫印迹和免疫组织化学方法评估RasGRP4在蛋白水平的存在。根据制造商的说明，使用PROTEINscript II T7试剂盒（美国德克萨斯州奥斯汀Ambion）进行无细胞转录：翻译分析。对编码全长正常RasGRP4、剪接变体5和剪接变体6的结构进行系统测试，并通过免疫印迹法进行评估。

免疫组织化学

对PBMC-derived CD14进行免疫组织化学⁺髓系细胞和T细胞，以及表达hRasGRP4的HEK293细胞。未转染的HEK293细胞作为阴性对照。使用Shandon Cytospin 4细胞离心机（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）将每例共500000个细胞放置在玻璃载玻片上。hRasGRP4型⁺HEK293细胞在Lab-Tek II室滑片系统（美国纽约州罗切斯特Nalge Nunc International）上培养。将制备好的载玻片固定并用4%多聚甲醛和0.2%皂苷进行渗透（eBioscience，加州圣地亚哥，美国）。使用3%过氧化氢在无水甲醇中的溶液淬火内源过氧化物；用3%的BSA溶液在磷酸盐缓冲盐水中进行封闭。使用我们的兔抗hRasGRP4抗体（1μg/ml）或兔抗β-肌动蛋白抗血清（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）稀释至1:80，然后使用相关的生物素化抗体和过氧化物酶结合链霉亲和素（Nichirei Biosciences，Tokyo，Japan）进行免疫组织化学。无关的兔IgG作为我们抗hRasGRP4抗体的另一个阴性对照。使用我们的抗hRasGRP4抗体（1μg/ml）和合成hRasGRP4衍生肽（100 ng/ml）的混合物进行吸收染色程序。使用含有3,3'-二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）的0.6%过氧化氢（日本生物科学公司）溶液观察免疫反应。用苏木精进行核染色，并用光学显微镜检查染色细胞。

免疫印迹法

使用Lightning-link HRP偶联试剂盒（英国剑桥Innova Biosciences）将我们的抗hRasGRP4抗体与辣根过氧化物酶偶联后，CD14中hRasGRP4蛋白的水平⁺如前所述，使用免疫印迹方法评估外周血细胞[7]. 使用NIH支持的ImageJ软件测量免疫反应带的密度[31]. 抗磷酸P44/42丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）（Erk1/2）抗体和抗pan-P44/42 MAPK抗体购自Cell Signaling Technologies（马萨诸塞州贝弗利）。

CD14期间hRasGRP4转录水平⁺细胞发育为巨噬细胞和破骨细胞

hRasGRP4转录水平下降，而CD14⁺外周血细胞分化为巨噬细胞（附加文件1/图s1A）。破骨细胞中RasGRP4表达减少（附加文件1/图s1B，左侧面板），至少RasGRP1没有对此进行反击（数据未显示）。光镜下证实了多核破骨细胞的发育。组织蛋白酶K在这些细胞中的表达升高得到证实（附加文件1/图s1B，右面板）。

RA和其他自身免疫性疾病患者hRasGRP4转录物的定量评估

我们将PBMC中hRasGRP4转录物的正常水平指定为健康个体PBMC中的平均值±2 SD。41%的RA患者的hRasGRP4转录水平高于正常水平(P（P）<0.0001）（图​（图2）。2). 患有其他自身免疫性疾病（SLE）患者的PBMC中hRasGRP4转录水平也较高(P（P）=0.0009），多发性肌炎/皮肌炎(P（P）=0.02），系统性硬化(P（P）=0.006）和Sjögren综合征(P（P）= 0.0004). 因此，PBMC中hRasGRP4 mRNA数量增加似乎是识别自身免疫性疾病患者的有用标记。尽管有这些数据，我们的RA患者PBMC中hRasGRP4转录物的水平与所检查的临床特征（例如，年龄、疾病持续时间、DAS28、血沉（ESR）或血清基质金属蛋白酶3（MMP3））无关（数据未显示）。同样在健康个体中，RasGRP4的表达水平不受年龄的影响（数据未显示）。此外，hRasGRP4转录水平不受我们RA患者PBMC中单核细胞比率（以淋巴细胞和单核细胞总数表示）的影响（附加文件2/图s2）。因此，使用PBMC而不是纯化的单核细胞来评估hRasGRP4转录水平是可以接受的。

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图2

PBMC中hRasGRP4 mRNA水平的评估使用qPCR方法量化健康个体和患有类风湿关节炎（RA）和其他风湿性疾病（如SLE、Sjögren综合征（SS）、系统性硬化（SSc）和多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM））的患者外周血单个核细胞（PBMC）中hRasGRP4转录物的总体水平。所示为每个样本中hRasGRP4转录物的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（hGAPDH）校正水平的相对数量（RQ）。其中一名健康个体被分配来确定1的值。在所有健康个体和患者中，以一式三份的方式进行分析，平均值绘制在图中。转录水平的正常上限定义为健康对照组的平均转录水平+2SD。hRasGRP4转录水平高于正常上限的患者数量采用Fisher精确检验进行评估。

10个新hRasGRP4转录物的鉴定，这些转录物经历了前体转录物的缺陷剪接

对16名健康人和23名RA患者（包括5名未接受治疗的患者）的hRasGRP4 cDNA进行序列分析，发现hRasGRP4的12种亚型是由其前体转录物的选择性剪接引起的（图​（图3）。三). 四种先前确定的hRasGRP4亚型被指定为剪接变异体1至4[1]. 在我们的RA患者中发现的两种选择性剪接亚型对应于变异体1和2。然而，其他10种亚型（指定为变体5至14）之前没有描述过。这些新的剪接变体缺乏整个外显子9（剪接变体5，GenBank登录号：({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“FJ768677”，“term_id”：“225196345”}}FJ768677型)); 第9外显子的前207个核苷酸（剪接变异体6，GenBank登录号：({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“FJ768678”，“term_id”：“225196347”}}FJ768678型)); 外显子7（剪接变异体7，GenBank登录号：({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“FJ768679”，“term_id”：“225196349”}}FJ768679型)); 外显子7、8和9（剪接变异体8，GenBank登录号：({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“FJ768680”，“term_id”：“225196351”}}FJ768680型]); 外显子7和8（剪接变异体10，GenBank登录号：({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“FJ768682”，“term_id”：“225196355”}}FJ768682型)); 外显子6（剪接变异体11）；第12外显子5'端的12种核酸（剪接变异体13）。剪接变异体9（GenBank登录号：({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“FJ768681”，“term_id”：“225196353”}}峡湾768681)); 在剪接变体12中，来自内含子11的143个核苷酸没有被去除；内含子11中的143个核苷酸和内含子14中的95个核苷酸没有从剪接变异体14中删除。

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图3

PBMC中编码异常hRasGRP4亚型的新转录物顶部面板显示了hRasGRP4的外显子结构和相应的功能基序，包括Ras交换基序（REM）、CDC25-like GEF结构域（CDC25框）、钙结合EF-hands和二酰甘油结合C1结构域。下部面板中的拼接变异体5至14对应于我们RA患者中发现的10个新的hRasGRP4转录物。如果翻译，则显示每个表达亚型中的氨基酸（AA）数量。从16名健康人中分离并测序了80个hRasGRP4特异性cDNA。其中2、13、1、1和1个cDNA分别对应于剪接变异体1、5、6、7和8。该对照组中其余62个cDNA序列与正常全长hRasGRP4亚型相对应。分别从18名接受治疗的RA患者和5名未治疗的RA病人中分离并测序了90和25 hRasGRP4特异性cDNA。显示了这些患者中鉴定出的缺陷转录物的类型和数量。对20例其他自身免疫性疾病患者的100个hRasGRP4 cDNA进行测序，结果显示36个缺陷hRasGRP4转录物和64个正常hRasGRP4转录体。变体1、9、12和14具有提前翻译终止密码子（*）。内含子1为3.9 kb，这个约17.2 kb的人类基因中的许多其他内含子大于1 kb。由于用于识别和定量新亚型的PCR方法会遗漏包含内含子1的亚型，因此可能在含有一个或多个大内含子的PBMC中存在额外的剪接变体。

在我们的RA患者组中最常见的异常hRasGRP4转录本是剪接变异体5，它缺少整个外显子9。该外显子的缺失不会导致处理的转录物中的帧移位异常或过早翻译终止密码子，但会导致92个氨基酸的缺失，这些氨基酸对应于信号蛋白中CDC25样催化结构域的C末端一半[1]. 第二个最常见的亚型是变体6，它导致69个相同氨基酸的损失。剪接变异体9、12和14是变化更为严重的亚型，因为它们在每种情况下都会产生提前翻译终止密码子。hRasGRP4剪接变体和剪接变体6在RA患者PBMC中的克隆数更常见（表​（表1）。1). 20个克隆对应于我们RA患者的剪接变异体6，而不是来自少数表达该变异体多克隆的患者。剪接变异体6的分布是8例RA患者的一个克隆和6例RA患者中的两个克隆。我们的RA患者中，没有一名患者的序列克隆中的剪接变异体6超过一半。除了剪接变异体6外，其他自身免疫性疾病患者的PBMC中这些剪接变种的频率与健康人相比没有显著差异。剪接变异体6在正常人PBMC中几乎未检测到。在健康受试者中，RasGRP4剪接变异体的频率与年龄无关（数据未显示）。在RA患者中，剪接变异体6的存在与任何评估的临床特征（即年龄、疾病活动性、血清MMP3水平、疾病持续时间或治疗）无关（表​（表2）。2). 然而，这种特异性变异在男性RA患者中更为常见。实时qPCR评估的hRasGRP4转录物水平在具有剪接变异体6的个体中显著升高(P（P）=0.02，使用Mann-Whitney的U检验计算）。由于RasGRP4的异常剪接在RA患者中最为明显，因此我们在接下来的研究中重点关注RA患者中RasGRP3的表达。

PBMC和CD14中的hRasGRP4蛋白水平⁺健康人和RA患者外周血细胞的分离

我们许多RA患者PBMC中hRasGRP4蛋白的水平低于健康对照个体（图​（图4A）。4A级). 我们的免疫印迹分析几乎没有检测到与剪接变异体5或6相对应的异常大小的条带，除了患者1和2有可检测到的较小的条带。尽管我们的抗体仍有可能不识别交替剪接的亚型，但我们的抗hRasGRP4抗体和抗V5抗体清楚地识别了带有C末端V5标记的重组hRasGRP4剪接变体6（数据未显示）。我们的大多数RA患者从同时获得的样本中表达hRasGRP4转录物的异常亚型（表​（表3）。三). CD14中hRasGRP4蛋白的水平⁺RA患者的外周血细胞也低于健康人（图​（图4B4B类).

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图4

免疫印迹法检测hRasGRP4在外周血中的蛋白表达.A类RA患者和健康对照者外周血单个核细胞的免疫印迹。从类风湿性关节炎（RA）患者和健康对照的外周血单核细胞制备裂解物。对每个裂解物中约3μg的蛋白质进行SDS-PAGE。使用过氧化物酶偶联的抗hRasGRP4抗体和抗β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。在A组中评估了4名健康人和6名RA患者的PBMC。B类.循环CD14的免疫印迹⁺从五名健康对照组和六名RA患者中分离出的细胞。