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老化细胞。作者手稿；PMC 2012年3月14日提供。
以最终编辑形式发布为：
老化细胞。2007年4月；6(2): 257–260.
2007年2月7日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1474-9726.2007.00274.x
预防性维修识别码：PMC3303600型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院349146
PMID：17291294

衰老过程中主动脉血管平滑肌细胞多倍体增加以细胞衰老为标志

丹阳,1 唐纳德·麦克拉恩,1 郝阮,1 辛西娅·圣希莱尔,1 罗纳德·德皮尼奥,2 马修·琼斯,1和卡蒂亚·拉维德1
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关联数据

补充资料

总结

我们以前报道过多倍体主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）的频率是衰老的生物标志物。体细胞的细胞衰老是衰老的另一个标志，其特征是不能进行细胞分裂。在这里，我们研究了多倍体是否与细胞衰老的发展有关体内对年轻和年老的Brown Norway大鼠主动脉组织制备物的分析表明，衰老标记物如p16的表达INK4a公司衰老相关的β-半乳糖苷酶活性主要在老年组织中检测到。来自p16的VSMCINK4a公司敲除小鼠和对照小鼠的多倍体细胞水平相似。有趣的是，衰老标记在大多数（但不是全部）多倍体VSMC中表达。此外，与二倍体细胞相比，多倍体细胞的增殖能力有限。本研究首次证明体内多倍体VSMC具有衰老表型。

关键词：衰老、细胞衰老、多倍体、衰老相关β-半乳糖苷酶、血管平滑肌

多倍体比二倍体DNA含量高(独爪蜃等。, 2002). 在以前的研究中，我们发现在老布朗-挪威大鼠中，主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）大多数是多倍体(Jones&Ravid，2004年). 对培养细胞的研究表明多倍体可能与细胞衰老有关(西格尔等。, 1999;瓦格纳等。, 2001;乌里瓦娃等。, 2004). 然而，这一点从未得到证实体内关于衰老在早期生命中的细胞生理学意义，细胞周期阻滞和衰老是一种抗癌机制(坎皮西，2005年); 然而，在晚年，衰老细胞获得可能导致衰老和有害病理的基因表达/表型变化(帕蒂尔等。, 2005).

在目前的研究中，我们检验了多倍体主动脉VSMC发展衰老表型的论点体内.p16的发病率增加INK4a公司p21的表达和某些情况CIP1/WAF1级（p21）被认为是衰老的生物标志物(赫比格等。, 2004,2006). 来自年老的棕色挪威大鼠的主动脉以大量多倍体主动脉VSMC为标志，也表现为具有大细胞核的高频率细胞(图1A) (Jones&Ravid，2004年). 免疫组织化学显示p16INK4a公司在幼年Brown Norway大鼠的主动脉VSMC中几乎未检测到，而在老年大鼠的组织中经常发现(图1A和补充图S1). 从整个主动脉分散的单个VSMC也获得了类似的结果(补充图S2). 大约50-60%的多倍体细胞对p16呈阳性INK4a公司来自老年大鼠的主动脉和大约30%的p16INK4a公司-阳性细胞为二倍体(图1B)，表明p16INK4a公司单靠上调并不能充分诱导多倍体。感兴趣的，第16页INK4a公司平滑肌细胞过度表达不会抑制细胞增殖(坦纳等。, 2000). 与第16页相比INK4a公司在年轻和老年主动脉的VSMC中检测到低水平的p21，在二倍体和多倍体细胞中没有特殊分布(补充图S3A). 市售p21基因敲除小鼠的分析(邓等。, 1995)或p16INK4a公司敲除小鼠(锋利的等。, 2001)与对照组相比，主动脉VSMC倍体无变化(补充图S3B、C).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms349146f1.jpg

多倍体血管平滑肌细胞（VSMC）表达p16INK4a公司并失去复制潜力。（A） 用多聚甲醛固定年轻和年老的Brown Norway大鼠的主动脉组织切片，并按照补充材料。橙色箭头指向p16INK4a公司-阳性细胞（棕色染色定位于细胞核）和蓝色细胞定位于p16INK4a公司-阴性细胞。对照组采用抗IgG染色。所示为放大倍数为600倍的相位对照图像，代表每组三只大鼠。在冰冻切片中也进行了染色，显示出类似的结果（未显示）。（B） 填充条表示根据细胞核大小（用于组织切片）或4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（用于分离的VSMC）确定的多倍体细胞的百分比，空白条表示也属于p16的多倍体细胞的百分比INK4a公司-正，条纹条代表p16的百分比INK4a公司-多倍体阳性细胞。对每只大鼠的五张幻灯片进行分析，并对每个年龄组的两到三只大鼠进行检查。所示为平均百分比±标准偏差。（C） 从34个月大的主动脉中分离出VSMC，并通过流式细胞仪进行分类，以获得二倍体（2N）和≥4N的人群，如Jones&Ravid（2004）培养和监测相同数量的细胞，如永田等。(2005)所示为培养后第2天（下面板）和第7天细胞的相控显微镜图像。多倍体群体中有一小部分增殖，但这也与该池中受污染的二倍体细胞数量相对应（高达10%）。

细胞衰老的另一个特征是细胞无法重新进入细胞周期。流式细胞术分离的二倍体主动脉VSMC永田等。(2005)，容易附着在组织培养瓶上并增殖。相比之下，大多数多倍体主动脉VSMC仍然处于永久性生长停滞状态(图1C).

这种表型的一个传统接受的标记是衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性(Dimri&Campisi，1994年;迪姆里等., 1995). 最近的一项研究表明，这种活性在一定程度上与溶酶体β-半乳糖苷酶有关，尽管它是衰老细胞的标志，但并不需要它来衰老(李等。, 2006). 对主动脉切片和新鲜分离的主动脉VSMC的分析表明，SA-β-gal阳性细胞是多倍体，但并非所有多倍体VSMC都是SA-β-gal阳性细胞(图2和补充图S4). 在比较主动脉切片和分离细胞时，发现SA-β-gal阳性细胞的百分比较低，这可能是因为SA-β-gal染色较弱，而在组织中检测可能更具挑战性。有趣的是，大约70%的p16INK4a公司-34个月龄样本中阳性VSMC对SA-β-gal也呈阳性(补充图S5).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms349146f2.jpg

衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加见于老年大鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMC），主要见于多倍体细胞。（A） 在5µm冷冻切片的主动脉上进行SA-β-gal染色测定（蓝色；上图），并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染以显示细胞核（下图）（见补充材料). 上面板显示主动脉切片，用相控显微镜观察，下面板显示各自的细胞核，用DAPI染色（用奥林巴斯显微镜检查；×100物镜）。箭头指向SA-β-gal阳性细胞（上部面板）和相应的大细胞核（下部面板）。（B） 根据补充材料进行了量化。空条表示基于细胞核大小（对于组织切片）或DAPI染色（对于分离的VSMC）鉴定的多倍体细胞的百分比，填充条表示同样为SA-β-gal阳性的多倍体细胞的百分比。分析每只大鼠三到五张幻灯片，每个年龄组共检查两到三只大鼠。所示为平均百分比±标准偏差。

总之，我们的研究首次表明衰老标记物主要在多倍体细胞中检测到，但并非所有细胞中都检测到。我们认为倍性状态和其他信号会逐渐触发完整的衰老表型和潜在的血管病理学。

补充材料

补充的

单击此处查看。（840万，pdf格式）

致谢

这项工作得到了美国心脏协会（American Heart Association）资深研究员K.R.K.R.AG022623的资助。R.A.D.是美国癌症学会研究教授和埃里森医学基金会高级学者。

脚注

补充材料

以下实验程序和数据可作为本文的补充材料：

实验程序：衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色，免疫组织化学。

图S1抗p16抗体染色主动脉组织切片的免疫组织化学方法验证INK4a公司

图S2抗p16抗体染色的分离主动脉血管平滑肌细胞的免疫组织化学INK4a公司.

图S3（A） 主动脉切片抗p21的免疫组织化学。（B） 来源于p21敲除小鼠的VSMC的倍体分析。（C） p16衍生VSMC的倍性分析INK4a公司击倒老鼠。

图S4分离主动脉血管平滑肌细胞SA-β-gal活性测定。

图S5应用抗p16免疫组织化学方法检测主动脉VSMCINK4a公司和SA-β-半乳糖活性测定。

这些材料作为在线文章的一部分可从以下网站获得：http://www.blackwellsynergy.com/doi/abs/10.111/j.1474-9726.2007.00274.x

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