室性心律失常导致的心源性猝死是全球心脏病死亡的主要原因，也是一个尚未解决的重大公共卫生问题。心脏性猝死的发病率在后天性和遗传性心脏病中都表现出昼夜变化1，2在一般人群中，心脏性猝死的发生率在早上上升的几个小时内急剧增加，第二个高峰在晚上很明显1在特定的遗传性疾病中，如Brugada综合征，致命的室性心律失常通常发生在睡眠中2获得性和遗传性心脏病中增加室性心律失常易感性的一个常见机制是心肌复极异常6临床上，表面心电图（ECG）上有三种常见的心肌复极改变。首先，复极延长见于后天性（如心力衰竭）5和先天性疾病（如长QT综合征）三其次，短QT综合征的复极缩短4第三，早期复极是Brugada综合征的心电图特征8有趣的是，所有三种复极改变都增加了室性心律失常的易感性6尽管对控制心肌复极的离子通道的生物物理和结构特征进行了严格的研究，但室性心律失常发生日变化的分子基础仍然未知。
生物体内以24小时周期振荡的生物过程被认为是昼夜节律。这种细胞自主节律由无休止的负转录-翻译反馈回路协调，通常称为生物钟9心血管系统中的几个生理参数，如心率、血压、血管张力、QT间期和心室有效不应期，均呈日变化10-13最近的研究还确定了生物钟在调节心脏代谢、生长和损伤反应中的直接作用14先前的研究也报道了复极离子通道和离子电流（I到)表现出日变化15然而，昼夜节律和心律失常发生之间的潜在联系尚不清楚。我们偶然观察到Krüppel-like因子15(Klf15）显示心脏内生昼夜节律()。基因表达微阵列在缺钙小鼠心脏中的表达Klf15型使我们确定了KChIP2，即复极瞬时外向钾电流（I到)作为心脏中这一因素的假定靶点。这些观察结果使我们推测昼夜节律时钟是否通过Klf15型可能调节复极的节律变化并改变心律失常的易感性。
Klf15型表达、ECG QTc间期和复极离子通道的表达呈现内源性昼夜节律（a）Klf15型在持续黑暗（DD）中（每个时间点n=4）的小鼠WT心脏中，表达表现出内源性昼夜节律变化（CT–昼夜节律时间）。（b） BMAL1 ChIP开启Klf15型启动子显示BMAL1与Klf15型WT心脏中的启动子（每组n=3）。（c） 清醒小鼠的心电图QTc间期在恒定黑暗条件下表现出内源性昼夜节律变化（n=4）。（d） 在CT 0和CT 12持续黑暗36小时后，清醒小鼠的代表性心电图（CT-昼夜节律时间）。（e，f）在持续黑暗36小时后每四小时测量一次WT心脏Kv4.2和KChIP2转录本的内源性昼夜变化（n=4个时间点）。数据表示为平均值±SEM。
首先，我们探索了昼夜节律钟调节细胞节律表达的机制Klf15型在心里。基因启动子区−5kb的检测Klf15型揭示了四个典型的“E-box”区域，即时钟及其异二聚体BMAL1公司，是参与生物钟的重要转录因子(补充图1a插图）。与这一发现一致，Klf15型-CLOCK/BMAL1异二聚体以剂量依赖性方式激活荧光素酶（−5kb）(补充图1a)。为了证实这种相互作用，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP），并确定了BMAL1与Klf15型WT心脏中的启动子，但不在BMAL1公司-空心()。根据上述观察Klf15型在中被中断BMAL1公司-null和每2次/每1次-空心(补充图1b)。因此，我们的数据强烈表明，昼夜节律钟直接调节Klf15型在心里。
接下来，为了确定心肌复极和离子通道表达是否表现出“真实的”（内源性）昼夜节律，即在缺乏外部线索（如光线）的情况下振荡，将野生型（WT）小鼠置于恒定黑暗中36小时（DD）此后24小时内，每2小时测量一次基于遥测的ECG间期。在这些条件下，心率和校正为心率的QT间期（QTc）都是有节律的，并表现出真正的内源性昼夜节律()。接下来，为了检查复极离子通道的表达是否具有内源性昼夜节律，将小鼠置于持续黑暗中36小时，并在24小时内每4小时收获一次心脏。瞬时外向钾电流（I）α亚单位的表达到)即Kv4.2()和调节性β亚单位，即KChIP2()表现出内源性昼夜节律，心脏昼夜钟的组成部分也是如此(补充图2)。相反，小鼠心室中另外两种主要复极电流Kv1.5（超快速延迟整流钾电流的α亚单位）和Kir2.1（内向整流钾电流α亚单位(补充图3)。此外，我们观察到Bmal1、Klf15培养的新生大鼠心室肌细胞血清休克后的KChIP2(补充图4)。总之，这些数据表明，心肌复极和一些复极离子通道的表达表现出内源性昼夜节律。
接下来，阐明Klf15型在调节复极的节律变化时，我们使用互补性体内小鼠功能丧失和获得途径。对于功能丧失Klf15型-使用了空鼠标16; 对于功能丧失，心脏特异性Klf15型转基因(Klf15型-开发了由减毒α-肌球蛋白重链（α-MHC）启动子驱动的Tg）小鼠(补充图5)。首先，我们检测Kv4.2或KChIP2的节律表达在Klf15型-缺陷状态。Kv4.2表达在Klf15型-与WT对照组相比，ZT6表达减少，ZT22表达增加的空白小鼠()。KChIP2表达在Klf15型-在所有时间点持续减少小鼠数量(&补充图6a)。接下来，我们检查了Kv4.2或KChIP2是否作为Klf15型在心里。腺病毒过度表达Klf15型在新生大鼠心室肌细胞中强烈诱导KChIP2，但对Kv4.2表达无影响(补充图6b)。重要的是，在Klf15型-在Tg心脏中，观察到KChIP2的表达增加了两倍，但对Kv4.2的表达没有影响()。对KChIP2启动子区域的检测显示了许多一致的Krüppel结合位点，即C（A/T）CCC(补充图7a)。KChIP2-荧光素酶的活性是由全长KLF15诱导的，而不是由缺乏锌指DNA结合域的突变体诱导的(补充图7b)。识别特定Klf15型生成了KChIP2启动子的结合位点、缺失结构，转录活性映射到近端555个碱基(补充图7a)。该区域内一个Krüppel结合位点的突变（Δ1）足以导致全长KChIP2启动子的活性完全丧失(补充图7c)。KLF15标记的染色质免疫沉淀Klf15型-Tg心脏证实KLF15在内源性KChIP2启动子上富集()。重要的是，核心时钟机械的几个组件的振荡在Klf15型-缺陷状态(补充图8)。此外，时钟基因的表达水平Klf15型-Tg心脏与ZT6时的对照组相似(补充图8)。这表明内源性时钟依赖于Klf15型协调KChIP2表达的节奏变化。与此观察一致Klf15型(补充图1b)和KChIP2(补充图9)在Bmal1型-null和每2次/每1次-使鼠标无效。这些数据支持KChIP2是Klf15型在心里。
Klf15型调节心脏中KChIP2的表达（a） 在WT小鼠中，Kv4.2 mRNA表达呈现昼夜节律，但在Klf15型-零心——心律异常，在ZT6（ZT-Zeitgeber时间）表达减少，在ZT22表达增加（每组每个时间点n=4）。（b） KChIP2 mRNA表达在Klf15型-缺陷小鼠，在所有时间点均显著减少（每组每个时间点n=4）。（c） KChIP2蛋白表达在12小时内没有变化Klf15型-空心。（d，e）Klf15型-Tg小鼠心脏表达较高水平的KChIP2 mRNA和蛋白。（f） 用Flag抗体进行染色质免疫沉淀，说明Flag-KLF15在KChIP2启动子上的富集（每组3个）。数据表示为平均值±SEM，*p<0.05。
我们接下来检查了Klf15型-KChIP2的依赖性调节可能是心肌复极昼夜节律性变化的原因。有趣的是，基于遥测心电图的分析表明，在这两种情况下，QTc间期的节律变化确实被消除了Klf15型-null和Klf15型-Tg小鼠()。在Klf15型缺陷状态下，心电图QTc间期在暗相延长，未能振荡()。尽管与WT患者的心率相似，但还是出现了这种情况(补充图11)。相比之下Klf15型-Tg小鼠QT间期持续较短，无昼夜节律变化()。同样，尽管与WT（非Tg）对照组相比心率差异很小，但还是发生了这种情况(补充图11)。接下来，我们在分离的心肌细胞中检测瞬时外向电流（I到快速)复极的依赖性变化是上述心电图变化的原因Klf15型-null和Klf15型-Tg小鼠。在Klf15型-无小鼠，I显著降低到快速密度()动作电位持续时间延长（APD）()。相反，Klf15型-Tg小鼠的I显著增加到快速密度()APD急剧缩短()。在Klf15型-Tg小鼠除QT间期短外，我们还观察到ST段改变，提示早期复极，与Brugada综合征的心电图表现类似8(，箭头）。总之，我们的数据表明Klf15型-小鼠心脏节律性KChIP2表达的依赖性转录调节在心室复极的节律性变化中起着核心作用。
Klf15型缺乏或过度调节复极的节律变化（a，b）WT代表性心电图vs。Klf15型-零，WT（非Tg）vs。Klf15型-ZT2和ZT14处的Tg。注意ST段异常Klf15型-Tg小鼠（箭头）（c）WT小鼠的QTc间期表现为24小时节律，这种节律在黑暗期随着QTc延长而消失Klf15型-无小鼠（n=4 WT和n=4Klf15型-null）。（d）Klf15型-与WT（非Tg）对照组相比，Tg小鼠表现出持续短QT间期，无昼夜节律变化（n=3 WT，n=4Klf15型-Tg）。（e，f）所有研究组的典型外向电流记录和外向电流快速分量振幅的汇总数据（I到快速)在60mV下测量，平均衰减时间为45±5ms（WT，n=10；Klf15-null，n=13；WT（非Tg），n=14；和Klf15-Tg，n=19）。（g，h）所有研究组的代表性心室动作电位（WT，n=10；Klf15-null，n=13；WT（非Tg），n=14；和Klf15-Tg，n=19））。数据表示为平均值±SEM，*p<0.05。
接下来，我们研究了复极过度延长或缩短是否会改变心律失常易感性和存活率。Klf15型-在心电图遥测上，null小鼠没有表现出自发心律失常，因此我们利用心内程序化电刺激检查心律失常敏感性。与WT小鼠相比，在Klf15型-无鼠标()。重要的是，Klf15型-心电图遥测显示Tg小鼠出现自发性室性心律失常()到4个月大时死亡约35%（年死亡3/8）Klf15型-WT非Tg对照组的Tg与0/8死亡，数据未显示）。作为Klf15型-null小鼠没有明显的心室功能障碍、凋亡或纤维化迹象16，17在基础状态下，心律失常易感性的增强可能主要是由复极异常引起的。总之，我们的研究表明Klf15型损害心脏复极的时间变化，并大大增加心律失常的易感性。
Klf15型不足或过量会增加室性心律失常的易感性（a） WT和Klf15型-使鼠标无效。室性心动过速的发生如图所示：Klf15型-空小鼠，并提供了总结数据（*p<0.05）。（b） 年自发性室性心律失常的发生Klf15型-Tg小鼠，并提供了总结数据（*p<0.05）。
虽然我们发现KChIP2的昼夜节律由Klf15型确立了昼夜节律可能有助于心律失常发生的原则，我们注意到Klf15型对Kv4.2表达的影响最小，Kv4.2也表现出昼夜节律()。然而，Kv4.2的表达在Bmal1-空和每2次/每1次-空心暗示生物钟的直接调节(补充图12)。与此观察一致Bmal1型-由于瞬间外向钾电流快速成分几乎完全消除，空白小鼠表现出明显的动作电位延长(补充图13)。这增加了其他因素（可能是昼夜节律钟的组成部分或尚未确定的转录调控因子）也可能影响电生理参数和心律失常发生的时间变化的可能性。未来关于心脏特异性时钟成分缺失的研究将有必要确认离子通道节律是否是细胞自主的，以及它们在调节心脏电生理中的作用。
总之，我们的研究提供了内源性昼夜节律和心脏电不稳定之间的第一个机制联系，而心脏电不稳定性通常与人类心源性猝死有关(补充图14)。具体而言，我们证明Klf15型-KChIP2的依赖性节律转录调节小鼠复极的持续时间和模式以及心律失常的易感性。由于获得性和遗传性心脏病中心脏性猝死的发生遵循明显的昼夜模式1，2这些观察为迄今为止尚未认识到的心脏电不稳定触发因素提供了新的见解。然而，与在很大程度上依赖于I的小鼠复极形成对比到人的复极是通过多种复极离子电流的复杂相互作用发生的。因此，需要进行更多的研究，以全面了解昼夜节律钟和人类心脏电生理特性之间的联系。尽管如此，这些数据可能为未来通过行为或药理手段调节昼夜节律时钟来预防或治疗心律失常的努力提供了一个机制基础。
