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酒精临床实验研究。作者手稿；可在2013年5月1日的PMC中获得。
以最终编辑形式发布为：
酒精临床实验研究，2012年5月；36(5): 759–767.
2011年12月5日在线发布。 数字对象标识：2011年10月11日/j.1530-0277.2011.01681.x
预防性维修识别码：项目经理3297709
尼姆斯：NIHMS334236
PMID：22141421

早期生长反应-1促进急性乙醇摄入后脂肪变性的发展

Terrence M.Donohue，Jr.小。，博士。，1,2,三，4,5,7 娜塔莉亚·奥斯纳医学博士、博士。，1,2,5 凯西·S·特拉姆布利，文学学士。，1,2,5 纳什·惠特克，B.秒。，1,2 保罗·汤姆斯，博士。，1,2,5 桑德拉·托德罗医学硕士。，1,5和约翰·戴维斯，博士。1,5,6
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

先前的研究表明，转录因子早期生长反应-1（Egr-1）参与慢性乙醇摄入后脂肪变性（脂肪肝）的发展。在这里，我们确定了Egr-1参与急性乙醇给药小鼠脂肪肝发育的程度。

方法

在急性研究中，我们通过胃管用乙醇或磷酸盐缓冲盐水（PBS）治疗野生型和Egr-1无效小鼠。在治疗后的不同时间，我们采集血清和肝脏，并量化内毒素、肝损伤指数、脂肪变性和肝Egr-1含量。在慢性研究中，各组小鼠被喂食含有乙醇或异热量麦芽糖糊精的液体饮食7-8周。

结果

与对照组相比，急性乙醇处理的小鼠在治疗30分钟后开始出现血清内毒素快速、短暂升高。灌胃后一小时，乙醇处理小鼠的肝脏显示出Egr-1 mRNA和蛋白质的显著升高。灌胃后3小时，乙醇处理的小鼠肝脏甘油三酯增加，脂质过氧化也增加。对Egr-1基因缺失小鼠进行急性乙醇治疗后，没有发现Egr-1表达，但这些动物的甘油三酯仍然升高，尽管明显低于乙醇喂养的野生型同窝鼠。尽管显示脂肪肝减少，但乙醇处理的Egr-1无效小鼠表现出更大的肝损伤。慢性乙醇喂养后，脂肪变性和肝脏肿大明显，但没有内毒素升高的迹象。乙醇喂养小鼠的Egr-1水平与配对喂养对照小鼠的Egr-1水平相同。

结论

急性乙醇给药诱导小鼠肝脏中Egr-1的合成。然而，尽管转录因子显著增加，但其在急性乙醇治疗后脂肪变性发展中的作用较小，尽管很显著。我们认为，急性乙醇后Egr-1的升高是对酒精代谢和内毒素水平升高引发的狂饮所致急性肝损伤的肝脏保护性适应。

关键词：酒精性肝损伤、脂肪肝、氧化应激、转录因子、谷胱甘肽

简介

在90%的问题饮酒者中，持续大量饮酒会导致脂肪肝（脂肪变性）的发展（O'Shea等人）。目前的证据表明，脂肪肝、过多的身体脂肪或两者都会加剧肝脏疾病的进展。最近的一项前瞻性研究表明，体重指数（BMI）为30或以上、每周饮酒150克的女性，与每周饮酒70克以下、体重指数相同的女性相比，肝硬化风险增加了五倍(刘等人，2010). 动物实验同样表明，肥胖大鼠急性乙醇摄入导致的肝脏损伤比瘦大鼠更严重(Carmiel-Haggai等人，2003年).

在人类中，酗酒比慢性酒精中毒更常见，尤其是在青少年晚期和20出头的男性中(Mathurin和Deltenre，2009年；Waszkiewicz等人，2009年). 急性饮酒是美国大学校园中日益严重的健康问题(韦克斯勒等人，1995年；Wechsler等人，1995年b). 越来越多的证据表明，酗酒导致的肝脏改变的机制与慢性酒精摄入后不同(Bardag-Gorce等人，2009年；Donohue等人，1998年).

过量饮酒会导致脂肪肝，部分原因是NADH的形成增强+乙醇和乙醛氧化生成(Lieber和DeCarli，1991年). 较高水平的NADH+通过线粒体抑制脂肪酸氧化，并为脂肪酸合成提供更多还原的辅酶。乙醇代谢也加速转录活性形式的成熟秒甾醇第页调节电子元素b条编结第页蛋白质1c（SREBP-1c），与编码脂质生物合成酶基因的启动子元件结合，从而促进脂肪酸合成(多诺霍，2007；你和克拉布，2004年；You等人，2002年).

虽然它可以促进脂肪生成，但乙醇代谢通过降低活性水平加剧脂肪肝第页磨牙症公共关系寡头一活化核第页接收器-阿尔法（PPAR-α），调节编码脂肪酸氧化酶的基因表达(多诺霍，2007；加利等人，2001年). 有令人信服的证据表明，细胞色素P450 2E1（CYP2E1）由于是由慢性乙醇摄入诱导的，因此会产生更多的活性代谢物，有助于抑制PPAR-α(Lu等人，2008).

早期生长反应-1（Egr-1）是长期饮酒后乙醇诱导脂肪变性发展的另一个关键成分(McMullen等人，2005年). 在乙醇喂养的Egr-1基因缺失小鼠中，脂肪肝几乎无法辨认，血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平不变。相比之下，乙醇喂养的野生型小鼠表现出强健的脂肪肝，血清TNF-α升高(McMullen等人，2005年). Egr-1促进脂肪变性的确切机制尚不完全清楚。转录因子与应激相关基因的启动子位点结合，包括编码（TNF-α）(Yao等人，1997年). 后一项发现是相关的，因为TNF-α被认为是脂肪生成的，因为它可以促进SREBP-1的成熟(劳勒等人，1998年).

酗酒导致的肝损伤研究不如慢性酗酒引起的肝损伤好，但仍然存在重大健康风险。在这里，我们试图确定Egr-1在小鼠急性乙醇摄入后脂肪肝发育中的作用。我们推测，酒精中毒剂量的治疗会增强肝脏Egr-1的表达，从而导致脂肪肝。我们的研究结果表明，乙醇灌胃后Egr-1水平确实升高，此后脂肪肝发展迅速。然而，狂饮后脂肪变性并不完全依赖于Egr-1诱导，但转录因子的增强表达有助于乙醇诱导的脂肪肝。

材料和方法

抗体试剂

我们从Cell Signaling Technology Inc.（马萨诸塞州丹弗斯）或Santa Cruz Biotechnology（加利福尼亚州圣克鲁斯）购买了针对Egr-1和SREBP-1c（H-160）的多克隆抗体。我们从Sigma Chemical Co.（密苏里州圣路易斯）或Thermo-Fisher Scientific（伊利诺伊州芝加哥）获得了抗β-肌动蛋白。

动物

弗吉尼亚州内布拉斯加州-爱荷华州西部医疗保健系统机构动物护理和使用委员会批准了动物协议。我们遵循美国国立卫生研究院出版的《实验动物使用和护理指南》。在这些研究中，我们使用雌性C57Bl/6小鼠（3至9个月大；马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所或缅因州巴尔港杰克逊实验室）。为了产生Egr-null小鼠，杂合（Egr-1+/负极)从Taconic Farms Inc（纽约州哈德逊）获得的小鼠进行杂交。从这些杂交后代的断奶幼崽身上剪下的尾巴用来分离DNA，以确定每只动物的Egr-1基因型。Egr-1 cDNA是使用先前已发表序列的引物扩增的(McMullen等人，2005年).

动物治疗

在急性酒精治疗之前和之后，所有小鼠都可以自由享用普瑞纳周饮食和自来水。将无水乙醇稀释至50%（v/v），放入双浓度（2X）磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并用3.8 cm不锈钢灌胃针（纽约州纽海德公园波普尔父子公司）通过胃管给清醒小鼠灌胃，单次标准剂量为每公斤体重6克（每20克小鼠0.304 ml 50%乙醇）附在一毫升注射器上。对照小鼠接受相同体积的每千克体重的单一强度（1X）PBS。

我们通过配对喂食控制和我们之前描述的含乙醇液体饮食，对不同组的雌性C57Bl/6小鼠进行了六周的慢性乙醇摄入(Donohue等人，2007年).

安乐死前，用戊巴比妥（50 mg/kg体重）麻醉所有小鼠，切断腋窝血管后采集血液，并通过离心制备血清。在通过放血和肺气肿进行安乐死后，切除肝脏，在冰冷的PBS中冲洗，吸干，称重并在冰上冷却。肝脏切片在含有0.25 M蔗糖的50 mM Tris-HCl（pH 7.4）中均质，然后按照我们的描述，对每个匀浆的一部分进行亚细胞分离(Donohue等人，1994年). 按照详细说明分别制备肝细胞核部分(McMullen等人，2005年).

血清分析

用顶空色谱法测定血清乙醇水平(Donohue等人，2007年奥马哈VAMC临床实验室使用体外自动分析仪（新泽西州新不伦瑞克州约翰逊和约翰逊）定量血清中的丙氨酸转氨酶（ALT）活性。使用来自Lonza（马里兰州Walkersville）的鲎变形细胞裂解试剂盒（QCL-1000）测量内毒素。大肠杆菌以内毒素为标准。

谷胱甘肽定量

通过添加10%（w/v）三氯乙酸使肝匀浆脱蛋白并离心。通过酶回收技术，对上清液部分进行处理，以测量谷胱甘肽的还原（GSH）和二硫化物（GSSG）形式(格里菲斯，1980).

酶活性

蛋白酶体糜蛋白酶样活性如前所述进行了测量(Osna等人，2008年)以粗肝匀浆为酶源。如前所述，使用相同的制剂测定CYP2E1活性(Chen和Cederbaum，1998年).

肝甘油三酯

对预先称重的冷冻肝脏切片进行总脂质提取（Folch，1957）。过滤后的有机提取物通过真空离心进行干燥，每个干燥粉末在65℃皂化o个C在86.3%（v/v）乙醇和0.73 N KOH的混合物中。使用Thermo DMA试剂（Thermo Electron Inc，Middletown，VA；类别号TR22203）定量甘油三酯。结果按照甘油三酯毫克数计算，并按每克肝脏归一化。

脂质过氧化

使用先前出版的程序，用粗肝匀浆测定脂质过氧化物作为硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）(布特库斯和罗斯，1972年). 使用丙二醛（MDA）作为标准，结果报告为MDA当量。

Egr-1和其他蛋白质的定量

肝核蛋白在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行变性SDS-PAGE，并在硝化纤维素膜上进行电印迹。随后在4o个C过夜，然后用适当的二级抗体洗涤并在室温下孵育，每种抗体都与辣根过氧化物酶结合。在膜暴露于增强化学发光（ECL）底物（Pierce，Rockford，IL）后，在x射线胶片上检测到免疫反应蛋白带。使用Bio-Rad（Hercules，CA）的Quantity One软件量化条带强度，并将其归一化为β-肌动蛋白条带的强度，作为负载控制。

RNA分离和qRT-PCR

使用Trizol试剂（Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA）或Pure Link RNA迷你试剂盒（Invitrogen公司，Frederick，MD）从肝脏切片中分离出总RNA（每个约50-100 mg）。在一步qPCR扩增分析中，每个反应混合物使用一ug RNA（加州福斯特市Applied Biosystems公司）。或者，使用两步程序，其中使用qScript™cDNA Supermix（Quanta，BioSciences Inc.Gaithersburg MD）将100ng RNA逆转录为cDNA。在第二步中，使用Perfecta™qPCR FastMix™（Quanta BioSeciences，Inc）和荧光标记的DNA引物（Taq-Man基因表达系统，Applied Biosysems，Inc）扩增cDNA。它们在7500 qRT-PCR型热循环器（Applied Biosystems，Inc）中培养。每个RNA转录物的相对数量通过其阈值周期（Ct吨)减去参考cDNA（18S核糖体RNA）。数据表示为乙醇喂养动物相对于相应未处理（即PBS处理）对照组的转录物数量（RQ）。

统计分析

数据表示为平均值±平均标准误差（SEM）。通过Student t检验确定两组之间的显著性比较。概率值≤0.05被认为具有统计学意义。

结果

乙醇对谷胱甘肽消耗、脂质过氧化、Egr-1诱导和脂肪变性的剂量依赖性影响

我们试图确定导致肝甘油三酯（脂肪变性）显著升高、氧化应激以及Egr-1水平变化的乙醇剂量。为此，我们给小鼠灌胃乙醇，剂量范围为0（PBS处理的对照组）至6克/kg体重，然后在处理后12小时对动物实施安乐死。结果汇总于表1灌胃12小时后，用2克、4克和6克乙醇处理的小鼠的血清乙醇浓度分别为0、1 mM和6 mM。与对照组相比，每公斤体重6克乙醇导致肝脏GSH下降50%，脂质过氧化物增加4倍。相同的乙醇剂量导致肝脏Egr-1蛋白首次显著增加，在Western blots上检测为80kDa免疫反应蛋白带。与对照组相比，Egr-1的增加伴随着肝甘油三酯的三倍升高。因此，在本文报告的所有后续实验中，我们使用6 g/kg体重作为标准乙醇剂量，并将其与PBS灌胃的小鼠进行比较。由于担心乙醇和对照组之间的热量相等，我们在一些实验中包括了葡萄糖灌胃的对照组动物（剂量与乙醇等量）并将其与PBS灌胃的药物进行比较。我们注意到PBS和葡萄糖在这里测量的任何参数中都没有显著差异（数据未显示）。

表1

用不同剂量乙醇灌胃小鼠肝脏中的谷胱甘肽、脂质过氧化物、Egr-1含量和甘油三酯
乙醇剂量
（g/kg体重）		0246
谷胱甘肽
（GSH）（毫摩尔/
mg蛋白质）		15 ± 2一15 ± 4一18 ± 1一8 ± 2b条
脂质过氧化物
（毫摩尔MDA/g
肝脏）		321 ± 70一386 ± 72一655±60b条1359 ± 150c（c）
Egr-1/肌动蛋白比率0.44 ± 0.1一0.39±0.03一0.77 ± 0.12ab公司0.86 ± 0.07b条
甘油三酯
（mg/g肝脏）		12 ± 1一14 ± 1.5一36 ± 8b条38 ± 6b条

注意:在用指定剂量的乙醇灌胃C57Bl/6小鼠12小时后测量参数。数据是每乙醇剂量4至11只小鼠的平均值（±SEM）。上标字母不同的数据之间存在显著差异。带有相同字母的上标的数据彼此之间没有显著差异。

饮酒后血清乙醇、内毒素和丙氨酸氨基转移酶

给药标准乙醇剂量30分钟后，血清乙醇水平为108±10 mM（497±46 mg/dL）。灌胃15分钟和30分钟后出现的较高乙醇水平与小鼠的共济失调和扶正反射困难有关，灌胃后持续1至2小时。这些类似于人类在狂饮后的行为特征。灌胃后1小时，血清乙醇浓度迅速降至35.7±0.5 mM（143±2.3 mg/dL），12小时后降至6.7±1mM（31±4.6 mg/dL(图1A). 在12小时期间，平均清除率为8.4μmoles/hr/ml血清(Lu等人，2008)可以检测到乙醇。乙醇治疗30分钟后，我们检测到血清内毒素升高了2.3倍，灌胃后3小时内仍保持升高(图1B). 灌胃6小时后，乙醇处理小鼠的血清ALT活性比对照组高出三倍，肝脏损伤明显(图1C).

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血清乙醇（面板A)、血清内毒素（面板B），和血清ALT（面板C）在单次标准剂量乙醇（6克/千克体重）或PBS后的指定时间。所提供的数据是每个时间点每组2至10只动物的平均值（±SEM）。注意:在里面图1B，对照动物（n=5）的数据来自于灌胃后30分钟和3小时服用PBS的动物的血清。带有不同字母的数据表明它们之间存在显著差异。具有相同字母的数据没有显著差异。

肝脏改变的时间进程

乙醇灌胃后1小时，Egr-1 mRNA(图2A)和蛋白质(图2B)与PBS治疗的对照组相比，Egr-1分别增加了近20倍和5倍，这表明Egr-1是一种对乙醇注射反应迅速的早期基因产物。单次乙醇灌胃后，Egr-1蛋白在治疗12小时后保持升高，24小时后恢复到对照水平(图2B). 灌胃三小时后，我们检测到肝甘油三酯升高了两倍。脂肪肝在乙醇后持续24小时，此时甘油三酯比PBS对照组高5倍(图2C). 与之前的调查结果一致(Zhou等人，2003年)，我们的组织学分析显示乙醇处理小鼠的肝脏中只有微泡脂滴（数据未显示）。灌胃三小时后，我们还检测到乙醇灌胃小鼠肝脏中首次出现氧化应激迹象，根据肝脏GSH下降1.6倍判断(图2D). GSH在治疗后6小时和12小时仍显著低于对照组。其减少并不反映其向二硫形式转化的增强，因为在灌胃后6小时，对照小鼠的GSSG水平（2.4±0.2 nmole/mg蛋白质）是乙醇处理动物的1.7倍（1.4±0.2 nmol/mg蛋白质：P=0.002）。与三小时后甘油三酯的初始升高相一致(图2C)，我们注意到过氧化脂质增加了1.4倍，这种情况在乙醇治疗24小时后持续存在(图2E).

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Egr-1 mRNA水平（面板A）Egr-1蛋白水平（面板B），肝甘油三酯（面板C）还原型谷胱甘肽（面板D），和脂质过氧化物（面板E）在单次标准剂量乙醇（6克/千克体重）或PBS后的指定时间。提供的数据是每组4到24只动物每个时间点的平均值（±SEM）。符号的含义与图1.注：在图2A中，未显示控制值（每个值的任意值为1），但暗示有符号“a”。因此，图2A中所示的值以符号“b”或“c”开头，如图所示。图2B中的插入面板是PBS灌胃对照（C）或乙醇灌胃（E）C57Bl/6小鼠肝细胞核组分中Egr-1（80 KDa）和肌动蛋白（42 KDa）的典型western blot。

CYP2E1与肝脏蛋白酶体活性

急性乙醇灌胃后，CYP2E1活性在任何时候都没有变化，这表明酗酒不会像慢性酒精喂养后那样增加酶活性(Donohue等人，2007年). 急性处理对照小鼠（17±2.5 nmoles/min/mg蛋白质）肝脏中蛋白酶体糜蛋白酶样活性与乙醇处理小鼠相当。乙醇灌胃12小时后（15±2.0 nmoles/min/mg蛋白质；P=0.52，N=17/组）。在乙醇处理后的任何其他时间，酶活性均未检测到显著变化（数据未显示）。这些发现表明，急性乙醇处理后Egr-1蛋白的升高并不是由于蛋白酶体活性下降导致其稳定所致，因为转录因子被蛋白酶体降解(Bae等人，2002年；Walsh和Shupnik，2009年).

Egr-1中的脂肪变性无效的老鼠

为了评估急性乙醇治疗后Egr-1对脂肪肝的作用，我们测试了暴饮是否会导致缺乏Egr-1表达的小鼠脂肪变性。乙醇灌胃12小时后，Egr-1中的血清乙醇水平几乎相等无效的小鼠（7.0±1.3 mM）和野生型窝友（5.5±0.8 mM；P=0.37），表明缺乏Egr-1表达并不影响乙醇代谢。有趣的是，乙醇灌胃Egr-1无效的动物的血清ALT水平几乎是相同处理的Egr的两倍+室友(图3A). 后一个观察结果相当显著，因为我们之前在C57Bl/6小鼠治疗12小时后未观察到ALT升高(图1C)这表明C57Bl/6小鼠与我们繁殖群体中的小鼠在乙醇敏感性方面存在先天差异。乙醇处理Egr中的脂质过氧化物无效的和野生型室友是平等的(图3 B)乙醇诱导的两组动物肝脏中GSH水平的下降基本相同（数据未显示）。正如预期的那样，在对照组和乙醇处理的Egr-1基因敲除小鼠中均未检测到Egr-1蛋白，而乙醇喂养的野生型同窝小鼠的肝细胞核组分的肝Egr-1含量高于相应的对照组(图3C). 虽然后面这些实验中的野生型小鼠具有混合性别和合子性，但我们没有发现它们的Egr-1诱导程度在雄性和雌性之间（P=0.68）或杂合子和纯合子Egr-1阳性动物之间存在差异（P=0.83）。然而，乙醇处理野生型小鼠的甘油三酯水平比相应的Egr-1高30%无效的动物，表明Egr-1表达的缺失部分消除了脂肪变性，并证明Egr-1对急性乙醇摄入后脂肪肝的形成有重要作用(图3D).

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血清ALT活性（面板A），脂质过氧化物（面板B），净Egr-1水平（面板C），和肝甘油三酯（面板D），在野生型和Egr-1阴性小鼠中，单次标准剂量乙醇（6克/千克体重）后12小时，所提供的数据是每组4至16只动物的平均值（±SEM）。注意:数据输入面板C通过从相应野生型或Egr-1无效乙醇处理小鼠中减去PBS处理动物中检测到的背景密度进行校正。数据表示为免疫反应性Egr-1蛋白带的净强度，并归一化为β-肌动蛋白的净强度。符号的含义与图1.

慢性乙醇喂养后的肝脏Egr-1

为了确定慢性乙醇摄入后Egr-1的表达是否与狂饮后一样发生改变，我们对小鼠进行了慢性乙醇摄入。在39至60天的配对喂养后，对照组和乙醇喂养组小鼠的内毒素水平相等（数据未显示）。然而，乙醇喂养小鼠的肝甘油三酯水平是对照组的三倍(图4A). 乙醇喂养小鼠的脂肪肝与CYP2E1活性增加1.6倍有关(图4B)，这反过来又与蛋白酶体糜蛋白酶样活性下降1.2倍有关(图4C). 然而，乙醇喂养小鼠肝脏蛋白酶体催化活性的降低并未影响Egr-1的核水平，这在两组动物中是相同的(图4D).

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肝甘油三酯（面板A），CYP2E1比活性（面板B），蛋白酶体糜蛋白酶样比活性（面板C）和Egr-1蛋白质含量（面板D）慢性乙醇喂养大鼠及其配对喂养对照组在39至60天后的肝脏中。数据表示为每组4-6只小鼠的平均值（±SEM）。符号的含义与图1.

讨论

持续饮用酒精饮料会导致肝损伤，随着持续饮酒，肝损伤可能会发展为越来越严重的组织损伤，导致大约20%的问题酒精使用者出现肝衰竭。90%的酗酒者会出现脂肪肝，这是肝脏损伤的最早迹象。脂肪变性之后是肝脏炎症，导致脂肪性肝炎和肝细胞死亡，随着炎症加剧，肝星状细胞转化为胶原分泌细胞，从而引发纤维化。后者的进展会彻底改变肝脏结构，严重损害其生理功能，导致肝衰竭。因此，从酗酒或长期饮酒（或两者结合）开始，肝脏调节因子水平的变化，包括SREBP-1c和PPAR-α，会影响脂质合成代谢和分解代谢的变化，从而导致脂肪变性。在越来越多的这些因素中，Egr-1是一个相对较新的补充，因为它在细胞应激反应中起着重要作用(Pritchard和Nagy，2005年)，Egr-1可能与上述转录因子相互作用，影响乙醇给药后的基因表达。

本文提供的数据表明，幼稚的C57Bl/6小鼠在灌胃乙醇6小时后迅速将酒精清除到亚致醉水平（9mM）(图1A). 相比之下，在长期饮酒后，小鼠在安乐死的早晨表现出约60 mM的血清乙醇水平(Donohue等人，2007年). 尽管两种喂食方案存在明显差异，但用乙醇单次灌胃会导致肝脏甘油三酯快速而持续地增加，这在数量上与慢性乙醇喂食后的观察结果相当（比较图2C到图4A). 主要区别在于，酗酒导致微泡脂肪肝，而慢性酒精喂养后大泡脂肪变性占主导地位（Curry-McCoy等人，2010；Donohue等人，2007年). 急性乙醇治疗诱导脂肪肝，未诱导CYP2E1。然而，CYP2E1可能参与乙醇的快速清除，并产生改变脂质代谢的氧化剂。对大鼠的研究表明，乙醇诱导CYP2E1的程度与脂肪变性程度有关(Jarvelainen等人，2000年)提示CYP2E1升高参与慢性酒精摄入后大囊性脂肪变性的发展。

在肠道内，酒精破坏了肠上皮的结构完整性，使肠源性内毒素进入门脉循环。在那里，它与门脉周围肝细胞和Kupffer细胞上的toll样受体4（TLR4）接触，从而引发炎症反应（Bode等人，1987；Zhou等人，2003年). 在这里，酒精狂饮迅速增加了循环内毒素，在治疗三小时后内毒素水平仍然升高(图2B). 周等还证明，乙醇诱导的内毒素升高会导致显著的氧化应激，如用N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理，NAC是一种恢复肝谷胱甘肽（GSH）的药物，可阻止脂肪变性、脂质过氧化和TNF-α的生成(Zhou等人，2003年). 灌胃后三小时谷胱甘肽的下降(图3D)与这个概念是一致的。乙醇诱导的谷胱甘肽耗竭并非由其转化为谷胱甘苷引起，而是可能由其与乙醛和/或ADH和CYP2E1生成的活性氧化剂反应而引起。我们之前表明，谷胱甘肽是一种乙醛陷阱（Donohue等人，1983a；Donohue等人，1983db）。我们还观察到，甘油三酯和脂质过氧化物的首次显著升高与谷胱甘肽的消耗同时发生(图2C和2D)表明脂肪肝的形成维持了脂质过氧化，氧化应激的“爆发”可能是随后的肝毒性反应的原因，即血清ALT的“激增”(图1C). 因此，导致狂饮后肝损伤的事件顺序是脂肪变性和氧化应激的集合。

本研究的主要目的是确定Egr-1表达对急性乙醇给药的反应。乙醇灌胃后Egr-1 mRNA及其蛋白的诱导模式相似(图2A和2B)表明乙醇处理通过提高其mRNA水平加快了Egr-1的合成。这种诱导机制与急性乙醇给药后SREBP-1c及其mRNA的诱导机制相似（Yin等人，2007）。有令人信服的证据表明，来自乙醇氧化的代谢衍生乙醛是SREBP-1c诱导所必需的(You等人，2002年). 我们同样提出，肝脏乙醇氧化产生可能参与Egr-1诱导的反应性物种。这一点得到了乙醇清除率的快速提高以及我们未发表的重组肝癌细胞研究数据的支持（Thomes，未发表）。血清内毒素的短暂升高也可能(图1B)触发或增强Egr-1诱导，如McMullen等。证明内毒素（LPS）注射可迅速增加肝脏Egr-1 mRNA和蛋白质水平，并且这种反应可通过先前的慢性乙醇喂养而增强(McMullen等人，2005年). 他们还报告称，在LPS治疗之前，对照组和乙醇喂养组小鼠的Egr-1 mRNA和蛋白质水平相等。我们的慢性研究结果与他们的一致，因为对照组和乙醇喂养组小鼠的Egr-1蛋白水平相等(图4D). 这里所见的循环内毒素缺乏增加与他们的发现不一致，但它支持内毒素增强肝脏Egr-1表达的观点。

尽管乙醇诱导的Egr-1表达增加先于甘油三酯积累，但转录因子对脂肪肝的发育并不重要。乙醇保护的Egr-1基因敲除小鼠仍表现出脂肪变性。然而，这种变化的幅度比野生型室友低30%(图3D). 这些发现表明，Egr-1不仅有助于脂肪肝的发展，而且其他因素，包括乙醇代谢的迅速增加（Bradford和Rusyn，2005）和SREBP-1c的诱导也参与了酗酒后脂肪变性的发展。

虽然急性乙醇后脂肪变性显著减轻，但Egr基因敲除小鼠的脂质过氧化物水平与野生型小鼠相当(图3B). 有趣的是，Egr-1的肝脏损伤无效的动物比野生型窝友和PBS处理的Egr-1高无效的小鼠的血清ALT水平几乎与野生型乙醇处理小鼠的相同(图3A). 这些发现表明，Egr-1基因敲除的动物体内ALT水平本质上较高，表明Egr-1可能保护肝脏免受乙醇毒性的影响。我们不知道这种保护的机制，但我们认为，因为Egr-1调节细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达(Hou等人，1994年)敲除动物中Egr-1表达的缺失可能会增加肠道对内毒素的通透性。另一种解释是，由于乙醇治疗后Egr-1表达缺失导致肝甘油三酯减少30%，因此Egr-1可能调节编码甘油三酸酯形成的基因。人们认为，甘油三酯通过将潜在的无细胞毒性脂肪酸酯化为甘油三酸酯而具有“保护”功能(Lu等人，2008). 普里查德等为Egr-1的保护功能提供了进一步证据。与野生型动物相比，Egr-1基因敲除小鼠在急性四氯化碳治疗后表现出更大的肝脏损伤（Pritchard等人，2010年）。尽管乙醇和CCl的效力4差异很大，这些发现的相似性需要进一步研究，以确定Egr-1在预防乙醇诱导的肝损伤中是否至关重要。因此，如图所示，在乙醇诱导的急性肝损伤期间，Egr-1在细胞应激反应中迅速合成，似乎可以保护肝脏。虽然我们不知道Egr-1基因敲除小鼠急性乙醇摄入后脂肪变性减弱的确切机制，但Egr-1表达的缺失可能会阻止编码脂肪酶基因的最大诱导。

总之，我们的研究结果表明，急性中毒剂量的酒精摄入会导致氧化应激、脂肪变性和肝损伤的短暂变化。急性乙醇摄入诱导了Egr-1，但转录因子与其他因子共同参与了脂肪肝的诱导。我们的研究结果提供了强有力的证据，表明狂饮后脂质代谢的变化与持续大量饮酒后发生的变化是不同的。他们强调了进一步研究的必要性，以确定急性乙醇给药后发生的脂肪变性是否参与肝损伤，或者实际上可能由于Egr-1的表达而具有保护作用。

确认

我们很高兴地感谢Ronda L.White和Tiana V.Curry-Mcoy博士在本次调查中的贡献。

资源、设施和赠款支持

这里提供的数据是退伍军人事务部、退伍军人健康管理局、研发办公室的退伍军人事务部内布拉斯加-爱荷华州西部医疗保健系统的资源支持和设施使用的工作结果。该项目的财政支持由国家酒精滥用和酗酒研究所的1-R01-AA16546号拨款以及内布拉斯加州大学医学中心内科消化与肝病科的机构资金提供

该项目的财政支持由国家酒精滥用和酗酒研究所的1-R01-AA16546号拨款以及内布拉斯加州大学医学中心内科消化与肝病科的机构资金提供。

脚注

免责声明：本文的内容并不代表退伍军人事务部或美国政府的观点。

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