1.简介
MicroRNAs（miRNAs）是1993年首次描述的20–22个核苷酸长的非编码RNA[1]. MiRNAs在包括发育、免疫、细胞周期控制、代谢、病毒或细菌疾病、干细胞分化和肿瘤发生在内的多种细胞过程中发挥着中心作用[2——4]. 一般来说，miRNAs是从细胞核中的RNA聚合酶II或III转录而来，然后转运到细胞质中，在细胞质中被加工成成熟的miRNA[4]. 成熟的miRNAs可以通过结合mRNA的3′或5′非翻译（UTR）区域来靶向数百个基因[4]. 新的证据表明，miRNAs不仅靶向mRNAs，而且能够调节转录和甲基化过程[5——7]. 此外，成熟miRNA的义链（miRNA）不仅调节基因功能，而且反义链（星形；*）在miRNA调节网络中起着重要作用[8]. 然而，反义链（星形）的生物学意义在很大程度上尚不清楚，但正逐渐引起人们的关注。在短时间内，miRNA的研究因其在几乎所有生物途径中的微调作用而受到极大关注。此外，疾病特异性组织miRNA特征已在各种病因中得到鉴定，如肝细胞癌（HCC）、丙型肝炎病毒（HCV）、乙型肝炎病毒（HBV）、心脏病、神经炎、风湿性关节炎（RA）和各种癌症[三，9——14]. 在本文中，我们强调了miRNAs在酒精性肝病中的新作用。
1.1. 先天性免疫应答中的MiRNA
先天免疫是宿主抵御外来病原体的第一道防线，也是对自身受损（内源性危险信号）的反应。Toll样受体（TLRs）是研究最广泛的危险信号传感器。MiRNAs与各种免疫反应有关，被认为是这些过程的重要调节器[15]. 参与免疫应答的miRNAs的数量在不断增加，其中miR-155、-146a、-125b、-132、-9、-212和-181是主要的参与者，在[16，17]. ALD中炎症相关的miRNAs值得关注，因为先天免疫系统的激活是酒精性脂肪性肝炎的标志。
2.酒精性肝病中的MiRNA
2.1. 酒精性肝病（ALD）
酒精性肝病（ALD）是一个全球性的健康相关问题，严重影响肝脏相关死亡率。炎症加剧和脂肪堆积是ALD的特征。ALD的进展涉及复杂的信号分子网络，在某些情况下慢性酒精滥用会导致肝硬化[18]. 酒精本身或其代谢物（乙醛）作用于多种信号通路，导致肠道通透性增加和活性氧生成增加[19，20]. 肠道通透性增加与细菌和细菌产物移位到肠腔有关，从而导致肠内稳态失衡[20]. 脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，在肝脏中通过实质细胞和非实质细胞解毒[21，22]. 据信，循环中LPS增加会破坏肝脏的稳态，导致库普弗细胞（KC；肝巨噬细胞）激活。激活后，KC产生TNF-α，然后诱导其他信号级联的激活来放大炎症。TNFα诱导的炎症在酒精性肝炎中更为普遍[23]. LPS/TLR4轴在ALD中的作用已得到重视，因为在ALD小鼠模型中，TLR4 KO小鼠已被证明可以保护肝脏免受损伤[24].
2.2。酒精喂养小鼠肝脏的MiRNA谱分析
酒精已被证明可以调节包括肝脏和大脑在内的各种器官的表观遗传因子，最近对此进行了综述[25]. 由于酒精具有表观遗传效应，可以想象酒精可能以miRNAs为靶点来调节基因功能。迄今为止，关于miRNAs在ALD中的作用的研究很少。此前，我们的实验室通过微阵列分析证明了一些miRNAs在酒精喂养小鼠肝脏中的差异表达[26]. 小鼠酒精喂养4周后，发现MiR-27b、MiR-214、MiR-199a-3p、MiR-182、MiR-183、miR200a和MiR-322下调，而MiR-705和MiR-1224上调[26]. 然而，这些miRNAs在ALD中的生理相关性尚未确定。
2.3. miRNA在酒精诱导肠道通透性中的作用
众所周知，酒精及其代谢物可增加肠道通透性[27]. 过去，各种信号分子和转录因子被报道参与了酒精介导的肠道通透性。最近，miR-212被确定为一种新的参与者，与酒精诱导的肠道通透性有关，其靶向一种主要的紧密连接蛋白Zonula occludens 1（ZO-1）[28]. ZO-1在调节肠道通透性方面起着重要作用。在ALD患者结肠活检标本和酒精处理的CaCO-2细胞中均观察到miR-212的诱导和ZO-1蛋白的减少[28].
最近，miR-29a和miR-122a被报道调节肠膜通透性。MiR-29a调节肠易激综合征（IBS）患者的肠膜通透性[29]. 在IBS患者的血液微泡、小肠和结肠组织中发现miR-29a的表达增加。MiR-29a以谷氨酰胺合成酶基因（GLUL）为靶点，GLUL反过来调节肠膜通透性[29]. MiR-122a被发现靶向Caco-2细胞和小鼠肠细胞中的occludin（一种跨膜紧密连接蛋白），因此在调节肠道通透性方面发挥重要作用[30]. 这些miRNAs在酒精诱导的肠道通透性中的潜在作用尚待确定。
2.4. miRNA在酒精介导的氧化应激中的潜在作用
循环内毒素的增加不仅在ALD中起着关键作用，而且活性氧（ROS和氧化应激）生成的增加也有助于ALD的发病机制[20，27]. 与此相一致，据报道NADPH氧化酶是ALD中氧化剂的主要来源，而缺乏该氧化酶的小鼠（p47phox−/−)可防止早期酒精性肝损伤[31]. 一般来说，miRNAs在氧化应激介导的病因中的潜在作用正在显现。与此一致，据报道，miR-27a*、miR-27b*、miR-29b*、miR-24-2*和miR-21*在H2哦2-RAW 264.7巨噬细胞诱导的氧化应激[32]. 此外，miR-27b*的过度表达抑制了LPS诱导的NF活化-κB类[32]. 这些数据表明，巨噬细胞功能可以通过调节NF通过氧化应激反应miRNAs调节-κB通路[32]. 有趣的是，在这项研究中，只有成熟miRNA的星形形式被发现在H2哦2-诱导的氧化应激。据我们所知，没有研究表明miRNAs直接参与酒精诱导的氧化应激。
研究表明，酒精可以下调大鼠肝窦内皮细胞（LSECs）和人内皮细胞中miR-199的表达[33]. miR-199的降低与内皮素-1（ET-1）和低氧诱导因子-1的mRNA表达增加有关α（HIF-1α) [33]. 作者得出结论，酒精诱导的ET-1可能导致肝硬化患者的炎症反应。
2.5. miRNA-155在酒精性肝病Kupffer细胞活化中的作用
我们实验室和其他实验室先前的研究表明，体内和体外酒精模型中TNF-α增加[34，35]. 此外，酒精性肝炎患者的TNFα增加[23]. 此前，酒精已被证明可以调节RAW 264.7巨噬细胞和KC中TNFαmRNA的稳定性[35]. 此外，miRNAs在转录后和翻译水平上调节基因表达[三，5，6]. 最近，我们发现长时间饮酒会诱导RAW264.7巨噬细胞和KC中的miR-155[34]. 然而，miR-146a和-125b的表达没有变化，它们也参与免疫反应。这一观察表明，酒精特别针对miR-155[34]. 我们进一步表明miR-155的表达与TNF-α水平相关。在功能上，miR-155调节TNF-αmRNA的稳定性，从而有助于增加酗酒小鼠KC中的TNF-β。TNF-α在转录和转录后水平上都受到严格调控。TNF-α的转录后调控包括mRNA稳定性、多聚腺苷化和翻译起始，其靶向3UTR中富含腺嘌呤和尿苷（AU-）的元素（AREs）[36]. HuR、三四脯氨酸（TTP）和TIA-1等反作用因子与TNF-α的3UTR结合，并通过稳定或破坏其转录物来调节其表达[36]. 有趣的是，慢性酒精通过HuR蛋白增加TNFαmRNA的稳定性[35，37，38]. 我们的结果表明，miR-155增强了TNF-α转录物的稳定性，这似乎表明miR-155的作用可能是通过靶向HuR或其他反作用因子发挥的。因此，我们的研究直接或间接暗示了miR-155在TNF-α调节中的作用。鉴于一个miRNA可以调节一条通路的多个基因；miR-155可能调节直接或间接参与TNF-α调节的其他基因。
2.6. 酒精喂养小鼠肝脏中miRNA的诱导
如前所述，我们在酒精暴露的RAW264.7巨噬细胞和酒精喂养动物的KC中发现miR-155的诱导作用[34]. 在这里，我们检测了其他miRNA的肝脏表达，包括miR-132、-125b和-146a，它们也调节各种免疫反应。MiR-132在神经炎症中起作用[39]还调节先天性抗病毒免疫，靶向p300转录辅激活因子[40]. 然而，miR-132在醇介导TLR反应中的作用尚待阐明；因此，在本研究中，我们确定了酒精对miR-132的影响。MiR-146a与内毒素耐受性有关，它调节IRAK-1和TRAF-6，并作为TLR4信号的负调控因子[41]而miR-125b限制RAW 264.7巨噬细胞中TNFα的生成[42].
在测试的miRNAs中，我们发现在酗酒小鼠的肝脏中显著诱导miR-132(). 正如预期的那样，在饮酒小鼠的肝脏中也观察到miR-155的显著增加()该结果与我们之前的报告一致[21]. 与此相反，miR-125b和-146a的表达没有明显变化(). 研究中使用的小鼠按照马萨诸塞大学医学院动物使用和护理委员会批准的动物协议进行饲养和护理。
饮酒小鼠肝脏中miR-155和miR-132的表达增加。C57BL/6八周龄雌性小鼠(n个=6/组），喂食含5%乙醇（乙醇饲料）或等热量液体饲料（双喂）的Lieber-Decarli饲料4周。4周后，分离肝脏，然后将其储存在RNA中（Qiagen），以便在−80°C下进行RNA分析。使用miRNeasy试剂盒（Qiagen）分离肝脏总RNA，并通过TaqMan miRNA分析（Applied Biosystems）进行miRNAs定量。将数据标准化为SnoRNA202（内源性对照），并显示为成对喂养对照组的倍数变化。数据表示平均值±S.E.M.使用T检验（双尾）确定统计显著性。
2.7. 酒精喂养小鼠肝细胞miR-155的增加
由于miR-155在炎症中的关键作用，大多数研究都集中于其在免疫细胞中的作用，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和T细胞（在[16，17，41]). 据报道，miR-155在多种炎症相关疾病中的诱导作用，如RA、神经或自身免疫炎症和各种癌症[43——46]. miRNA的细胞特异性效应的概念正在出现，而显示免疫相关miRNA在肝细胞中作用的报告很少。最近的研究表明，肝细胞对LPS诱导的TLR信号有反应，并表达功能性NOD1和2受体[47]. 因此，接下来，我们研究了酒精对肝细胞中miRNA表达的影响，肝细胞是主要的肝细胞群体。
从喂食Lieber-DeCalri饮食的小鼠中分离出肝细胞，该饮食含有5%乙醇（乙醇-饲料）或等热量饮食（双份喂食），为期4周[34]. 采用我们小组先前描述的方法进行肝细胞分离[24]. 使用miRNeasy试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并按照前面所述进行miRNA分析[34]. 简单地说，使用了TaqMan miRNA分析（Applied Biosystems），并使用snoRNA202作为内部控制，以使样品之间的技术差异正常化。计算与配对喂养小鼠相比的折叠变化。
有趣的是，与配对喂养的小鼠相比，我们发现饮酒小鼠肝细胞中miR-155的表达增加(). 据我们所知，这是首次报道酒精喂养后肝细胞中miR-155诱导的研究。在酒精喂养的小鼠肝细胞中，miR-146a的表达没有观察到明显变化，miR-132的表达增加很小(). 相反，喂食酒精后发现肝细胞中miR-125b的表达下调(). 酒精诱导的miR-155在肝细胞中的生理相关性正在进行研究。
miR-155在酒精喂养小鼠肝细胞中的诱导作用。从小鼠中分离出肝细胞(n个=5-6）。简单地说，对肝脏进行灌注，然后进行消化。低速离心后收集实质细胞（肝细胞），清洗，然后将其置于6孔胶原涂层板（BD-Biosciences）上。3h后，去除漂浮细胞，用PBS洗涤粘附细胞两次，并在齐阿唑（齐阿根）中溶解。分离总RNA，并通过TaqMan miRNA分析（Applied Biosystems）定量miRNA表达。将数据归一化为SnoRNA202（内源性对照），并显示为配对对照组的折叠变化。数据代表平均值±S.E.M.使用非参数Mann-Whitney检验确定统计显著性。
在饮食诱导的（甲基缺乏饮食）非酒精性肝炎中，miR-155增加与C/EBP水平降低相关-β和SOCS1蛋白[48]. 小鼠原代肝细胞中miR-155的体外过度表达导致C/EBP水平降低-β和SOCS1蛋白[48]. 两个C/EBP-β和SOCS1是肿瘤抑制剂[49]在肝细胞癌和肝母细胞瘤中经常下调[50]. C/EBP的相关性-β并且SOCS1可以转化为ALD，这是因为SOCS1不仅起到肿瘤抑制剂的作用，而且是LPS信号传导的负调控因子，而长期饮酒会导致炎症细胞因子的产生增加。此外，SOCS1也是细胞氧化应激的重要介质[51].
C/EBP公司-β调节几个参与氧化应激调节的肝脏基因，如过氧化氢酶和蛋氨酸腺苷转移酶1a[52，53]. 由于氧化应激在ALD的发病机制中起着至关重要的作用，有理由认为，在酗酒小鼠肝细胞中观察到的miR-155增加可能通过调节参与氧化应激途径的基因而导致氧化应激增加。然而，还需要进一步的研究来证明ALD中的这种推测。
最近，miR-155已被证明在人类肝癌细胞HepG2抗HBV感染的抗病毒免疫中发挥作用[54]. miR-155的过度表达导致SOCS1降低，从而增强STAT1和3的磷酸化[54]. 在人肝癌细胞中异位表达miR-155后，观察到一些干扰素诱导抗病毒基因的表达增加[54]. 结论是，miR-155通过靶向SOCS1发挥JAK/STAT信号的正调控作用，从而增加一些干扰素诱导的抗病毒基因的表达，如ISG15和MxA[54].
在这项研究中，我们还发现酒精喂养小鼠肝细胞中miR-125b减少(). 据报道，肝癌中miR-125b的下调与胎盘生长因子（PIGF）增加有关[55]. 然而，ALD中miR-125b下调的生理相关性尚待探讨。
2.8. 酒精喂养小鼠枯否细胞中miR-155和miR-132的增加
接下来，我们检测了饮酒小鼠KCs中miRNAs的表达。如前所述，KC被隔离[34]. 我们的研究重点是miR-155和miR-132，因为这些miRNA在酒精喂养后的肝脏中表达增加(). 有趣的是，我们不仅观察到miR-155显著增加，这与我们之前的报告一致[34]，但也能诱导酗酒小鼠KCs中的miR-132().
酒精喂养小鼠库普弗细胞中miR-155和-132的上调。从配对喂养或酒精喂养小鼠中分离出Kupffer细胞(n个=12–14/组，将两只小鼠的细胞合并）。细胞被镀上，孵育2小时后去除非粘附细胞。将新鲜培养基添加到粘附物中，并将其放置一夜。第二天，用PBS清洗细胞并用齐阿唑（齐阿根）溶解。如上所述，使用miRNeasy试剂盒分离的总RNA定量miRNA。数据表示平均值±S.E.M.使用T检验（双尾）确定统计显著性。
在酒精喂养的小鼠中诱导miR-132是一个有趣的现象，因为这种miRNA在先天免疫中的作用并没有得到太多的重视。最近，miR-132被证明在先天性病毒反应中发挥作用，靶向p300，一种转录辅激活因子[40]. 长期饮酒容易使人感染（细菌和病毒），饮酒后miR-132的诱导非常有趣。我们还发现，在酒精喂养小鼠的肝细胞中miR-132适度增加。miR-132在酒精介导免疫反应中的生理相关性目前正在研究中。
总之，我们的结果表明，酒精喂养后肝脏不同细胞群中miR-155的增加。我们在酒精喂养小鼠肝细胞中观察到的miR-155的诱导很可能涉及LPS和氧化应激信号通路，因此有助于ALD的进展。
