美国生理学杂志胃肠道肝脏生理学。2012年2月；302（4）：G439–G446。
半乳糖凝集素-3在体内调节吞噬诱导的星状细胞活化和肝纤维化
,1 ,1 ,4 ,1 ,1 ,1 ,4 ,4 ,1 ,1 ,2 ,三 ,4和
1 丹尼尔·徐克强（Daniel K.Hsu）
4加利福尼亚州萨克拉门托加利福尼亚大学戴维斯医学中心皮肤科
Kornelia Baghy公司
内科，1胃肠病和肝病科，
Nobuko Serizawa公司
内科，1胃肠病和肝病科，
高田吉川
4加利福尼亚州萨克拉门托加利福尼亚大学戴维斯医学中心皮肤科
高田洋子
4加利福尼亚州萨克拉门托加利福尼亚大学戴维斯医学中心皮肤科
斯里德维·德瓦拉吉
2动脉粥样硬化与代谢研究实验室，
罗杰·亚当森
三加州大学萨克拉门托分校戴维斯分校人体生理学系；和
刘福通
4加利福尼亚州萨克拉门托加利福尼亚大学戴维斯医学中心皮肤科
内科，1胃肠病和肝病科，
2动脉粥样硬化与代谢研究实验室，
三加州大学萨克拉门托分校戴维斯分校人体生理学系；和
4加利福尼亚州萨克拉门托加利福尼亚大学戴维斯医学中心皮肤科
通讯作者。 2011年7月11日收到；2011年12月2日接受。
摘要
肝星状细胞（HSC）是肝脏的关键成纤维细胞，在吞噬凋亡的肝细胞后转分化为肌成纤维细胞。半乳糖凝集素-3是一种β-半乳糖苷结合凝集素，是吞噬过程的调节器。在本研究中，我们的目的是研究细胞外半乳糖凝集素-3调节HSC吞噬和激活的机制。通过吞噬作用和整合素结合试验评估galectin-3在原发性HSC吞噬中的作用。通过实时PCR和酶联免疫吸附试验研究半乳糖凝集素-3的表达，并对野生型和半乳糖凝素-3进行体内研究−/−老鼠。我们从galectin-3中发现HSC−/−小鼠的吞噬活性、转化生长因子-β1和前胶原α1（I）的表达降低。重组半乳糖凝集素-3逆转了这一缺陷，表明细胞外半乳糖凝集素-3是HSC激活所必需的。半乳糖凝集素-3促进αv（v）β三异二聚体依赖性结合，表明半乳糖凝集素-3通过交联整合素和增强凋亡细胞的栓系来调节HSC吞噬作用。阻断整合素αv（v）β三导致吞噬功能下降。Galectin-3在吞噬凋亡细胞的活性HSC中表达和释放，这是由核因子-κB信号介导的。胆道封闭（BDL）大鼠体内进一步证实了活性HSC中半乳糖凝集素-3的上调。半乳糖凝集素-3−/−BDL后，小鼠的纤维化程度显著降低，α-平滑肌肌动蛋白和前胶原α1（I）的表达降低。总之，细胞外半乳糖凝集素-3通过前馈机制介导HSC吞噬、激活以及随后的自分泌和旁分泌信号，在肝纤维化中发挥关键作用。
关键词：肝纤维化，整合素
半乳糖凝集素是β-半乳糖苷结合凝集素家族(1,三,20). 半乳糖凝集素-3（也称为MAC-2）是一种独特的30-kDa分子，具有嵌合结构(21). 已知其通过在巨噬细胞激活中的作用参与炎症过程的调节(23)，迁移(8,13)，和细胞存活(33). 半乳糖凝集素-3在调理红细胞的吞噬作用中也起着关键作用(29)巨噬细胞引起中性粒细胞凋亡(6). 半乳糖凝集素-3被认为在不同组织的纤维形成过程中发挥重要作用(10,11,24)主要通过其免疫调节作用。半乳糖凝集素-3既是胞外凝集素又是胞内凝集素；然而，这些形式发挥成纤维活性的各自机制尚不明确。
在我们之前的研究中，我们已经证明肝星状细胞（HSC）能够吞噬死亡肝细胞的凋亡小体（AB）(17,34). 凋亡细胞的吞噬导致表型改变，HSC转分化为肌成纤维细胞，产生I型胶原和转化生长因子（TGF）-β，并通过NADPH氧化酶2（NOX2）活化产生活性氧化物种(19). 吞噬作用还诱导肌成纤维细胞存活，进一步加剧了纤维原性损伤(18). 由于半乳糖凝集素-3结合是吞噬作用中的一个重要步骤，我们的目的是阐明半乳糖凝素-3在调节吞噬介导的HSC活化中的作用。在这里，我们已经证明细胞外半乳糖凝集素-3通过交联整合素α在AB栓系和吞噬中发挥重要作用v（v）β三以及随后激活HSC。AB的摄入也诱导了galectin-3的上调和HSC的分泌，提示HSC活化的一种新的自分泌途径。在体内，我们发现半乳糖凝集素-3的纤维化阶段降低−/−胆道结扎（BDL）后的小鼠，表明半乳糖凝集素-3是肝纤维化的重要调节因子。
材料和方法
动物。
半乳糖凝集素-3−/−如前所述，C57/B6背景的小鼠是通过基因靶向技术产生的(16). 作为对照，使用年龄和性别匹配的野生型（wt）同窝伴侣。根据Geerts等人(7)胶原酶和蛋白酶序贯原位灌注。在戊巴比妥麻醉（60 mg/kg ip）下对小鼠进行BDL。在两个位置结扎总胆管。手术后3周处死动物，并固定肝脏标本。对照组动物接受假手术。这些动物被安置在国家卫生研究所批准的设施中。所有程序均由加州大学戴维斯分校动物福利委员会审查和批准。
AB的产生和吞噬作用的评估。
AB是由羧基四甲基罗丹明琥珀酰酯（TAMRA；Invitrogen，Carlsbad，CA）标记的HepG2细胞经紫外线（UV）照射（100 mJ/cm）产生的2，142 s），如前所述(34). 紫外线照射48小时后收集AB，此时80%的细胞凋亡。为了研究吞噬作用，分离后原代HSC培养1天，然后将培养基改为无血清培养，培养16小时。在4°C下同步1–3分钟后，用AB处理细胞16小时。通过TAMRA标记检测细胞内AB。然后在每种情况下总共计算400个细胞，吞噬细胞数除以总计数得出吞噬率。
原代HSC的细胞培养和转染。
为了研究吞噬作用，如上所述，HSC在无血清培养基中培养16 h，然后用乳糖（50 mM，1 h）处理，然后在有或无重组半乳糖凝集素-3（1μM）的情况下暴露于AB。原发性HSC暴露于整合素α组合V（V）和β三在AB前评估抗体（10μg/ml；Millipore，Billerica，MA）和吞噬作用。为了研究半乳糖凝集素-3与整合素的结合，在室玻片中培养原代大鼠HSC，并用pBJ1整合素β3（Intβ3重量)或结合缺陷突变体（Intβ3D119A型)按照说明使用GeneJuice转染试剂（EMD Chemicals，Gibbstown，NJ）。转染效率为40%。
为了研究核因子（NF）-κB信号转导在吞噬介导的半乳糖凝集素-3表达中的作用，还分离了原代大鼠HSC，并用AB与NF-κB抑制剂咖啡酸苯乙酯（CAPE，1 ng/ml；Sigma-Aldrich）孵育24–48小时，用GeneJuice转染试剂将显性阴性IκB表达载体（DN-IκB）转染大鼠HSC。转染24小时后，将细胞暴露于AB中48小时，然后收获以研究mRNA表达。
细胞粘附试验。
我们使用了Eto等人修改的协议(5). 用重组人半乳糖凝集素-3包被96周酶联免疫吸附测定（ELISA）板，然后用1%聚乙烯吡咯烷酮（Sigma-Aldrich）封闭PBS重量和Intβ3119在无血清DMEM中分离和再悬浮；105将细胞/孔添加到微孔中，并在37°C下培养1 h。用DMEM冲洗去除未结合的细胞，并通过测量内源性磷酸酶活性对附着的细胞进行量化。简言之，100μl底物/裂解缓冲液（1%Triton X-100，6 mg/ml第页-将硝基苯磷酸和50 mM醋酸钠（pH 5.0）添加到微孔中。在37°C下培养45分钟后，用50μl 1 M NaOH停止反应。读取405 nm波长处代表细胞粘附强度的光密度。粘附细胞的磷酸酶活性与细胞输入总量的百分比用于表示细胞粘附。
定量RT-PCR。
使用RNA纯化试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）从细胞或组织中提取总RNA。使用基于随机六聚体方法的Superscript III试剂盒（用于qRT PCR的Supersscript III第一链合成超分子；Invitrogen）进行逆转录。对于实时PCR反应，所使用的引物序列列于.
表1。
| 引物序列 |
|---|
| 小鼠/大鼠Gal-3 | 向前：5′-GCCCTTGCCTGGAGGAGTCATG公司-3′ |
| 反向：5′-CATTGAAGCGGGGTTAAAGTGG-3′ |
| 小鼠胶原蛋白1A1 | 向前：5′-AGAGGCGAAGCAAGTCG公司-3′ |
| 反向：5′-GCAGGGCAATGTCTAGTTCC公司-3′ |
| 小鼠α-SMA | 向前：5′-TCAGCGCCTCCCAGTTCCT公司-3′ |
| 反向：5′-AAAAAAAA CCACGAGTAAAATCAA-3′ |
| 小鼠TGF-β | 向前：5′-CATGGAGCTGGTGAAACGG公司-3′ |
| 反向：5′-GCCTTAGTTTGGAGAGGATCTGG（GCCTTAG）-3′ |
| 小鼠β-肌动蛋白 | 向前：5′-ACGGCAGGTCATCACTATG公司-3′ |
| 反向：5′-ATACCAGAGGAAGGCTGGA公司-3′ |
| 鼠丛 | 向前：5′-AAGGAGGACCTCACCGAGAT公司-3′ |
| 反向：5′-CCCTCTAGGAAGGAGTGTG公司-3′ |
ELISA法。
在PBS中用亲和纯化的山羊抗鼠galectin-3捕获抗体对平板进行包被。用1%BSA/PBS洗涤和封闭后，添加重组galectin-3-和样品（HSC和Kupffer细胞暴露于AB的条件培养基）的适当稀释的标准品，并在4°C下培养过夜。在Tween 20/PBS中洗涤后，在室温下加入亲和纯化的兔抗鼠半乳糖凝集素-3 1小时，然后在洗涤后，施用辣根过氧化物酶缀合物抗狂犬病抗体（Invitrogen）。H（H）2O（运行）2以3,3′，5,5′-四甲基联苯胺为底物。添加停止试剂后，在450 nm波长下读取光密度。根据标准曲线计算培养基中的半乳糖凝集素-3浓度。
免疫染色和苦味酸染色。
用pBJ1Intβ3转染细胞重量或pBJ1 Intβ3119用4%多聚甲醛/PBS固定。用2%BSA/PBS封闭后，用单克隆整合素α孵育v（v）β三抗体（1:300；Millipore）和抗凝集素-3多克隆抗体（1:500；由刘福通博士提供）。清洗后，用适当的荧光二级抗体检测细胞。用共焦显微镜分析信号。
来自wt和半乳糖凝集素-3的40微米肝切片−/−BDL后小鼠用4%多聚甲醛固定。清洗和封闭后，用靶向galectin-3（1:200）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，1:200；Epitomics，加州伯林盖姆）的一级抗体培养组织。用适当的AlexaFluor-conjugated二级抗体（Invitrogen）进行探测后，用共焦显微镜检测荧光信号。
按照标准方案进行苦味酸染色。简言之，用多聚甲醛固定肝组织，将其切片并在室温下在苦艾红溶液中孵育，然后用0.5%（vol/vol）乙酸洗涤。通过NIH Image J软件对图像进行分析和量化。
电泳迁移率变化分析。
HSC被血清饥饿，并与AB孵育2 h。核提取物使用细胞溶质/核提取试剂盒（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）制备。NF-κB核转位用生物素3′-引物DNA标记试剂盒和光敏化学发光EMSA试剂盒（Thermo Scientific）通过电泳迁移率转移分析（EMSA）测定。简单地说，将核提取物与生物素标记的NF-κB寡核苷酸（5′-AGTTGAGGACTTTCCCAGGC-3′）混合在含有1 mg/ml聚（dI-dC）的缓冲液中。裂解液混合物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后电转移到尼龙膜上。然后交联膜，然后应用化学发光底物，并通过放射自显影术检测产生的化学发光。
羟脯氨酸测定。
将BDL和假手术小鼠的肝组织（400–500 mg）洗去酸后在6 N HCl中变性16 h，并在室温下用50 mM氯胺-T（Sigma-Aldrich）培养20 min。高氯酸（3.15 M；Sigma-Aldrich）和20%第页-依次添加二甲氨基苯甲醛（Sigma-Aldrich）。将样品在60°C下培养20分钟，并记录557 nm吸光度。用一系列已知浓度的羟脯氨酸溶液生成一条标准曲线，通过该曲线计算肝组织中羟脯氨酸的含量。数据表示为每克湿肝中羟脯氨酸的微克数。
统计分析。
所有数据至少代表三个实验，并表示为平均值±SE。使用与Dunnett检验相关的单向方差分析比较各组之间的差异。当P（P）< 0.05.
结果
半乳糖凝集素-3是HSC吞噬活性所必需的。由于半乳糖凝集素-3被证明在其他系统中调节吞噬作用，因此我们首先测试从半乳糖凝素-3分离的星状细胞的吞噬效率是否降低−/−老鼠。wt和半乳糖凝集素-3−/−HSC在无血清培养基中培养过夜，然后暴露于AB中16小时(). 半乳糖凝集素-3中AB的吞噬率已降至12.0±1.9%−/−HSC与重量HSC相比（26.3±3.7%，P（P）< 0.05). 当半乳糖凝集素-3−/−HSC与重组半乳糖凝集素-3一起孵育（33.0±1.1%，P（P）<0.0001），表明细胞外半乳糖凝集素-3参与了吞噬过程。为了证实吞噬作用的增加确实是由半乳糖凝集素3介导的，在半乳糖结合竞争对手乳糖存在或不存在的情况下培养HSC。乳糖暴露后，吞噬率显著降低（13.9±3.0%，P（P）<0.05）和半乳糖凝集素-3−/−HSC（14.5±3.6%，P（P）<0.01），表明细胞外galectin-3可能在吞噬细胞的栓系和吞噬中起作用。
半乳糖凝集素-3是肝星状细胞（HSC）通过促进整合素α吞噬凋亡小体（AB）所必需的v（v）β三-介导栓系。野生型（wt）和半乳糖凝集素-3−/−HSC与AB在无血清条件下，在有或无重组半乳糖凝集素-3（rGal3）（1μM）的情况下孵育16小时(A类). 在AB和rGal3之前施用乳糖（Lac，50 mM）。半乳糖凝集素-3显著降低AB的吞噬作用−/−HSC。用rGal3孵育细胞可逆转这种情况。半乳糖凝集素结合的竞争性抑制剂乳糖降低了rGal3处理细胞的吞噬率，表明细胞外半乳糖凝蛋白3是吞噬发生的必要条件。数据为平均值±SE；n个= 5. *P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及##P（P）< 0.0001. 用抗整合素α治疗原发性HSCv（v）和β三抗体（10μg/ml）或相同数量的IgG同型，然后AB持续16小时(B类). 整合素抗体显著抑制HSC吞噬活性。数据为平均值±SE，n个= 4, *P（P）< 0.01. 对转染pBJ1整合素β的原代HSC进行结合分析三（国际β3重量)或结合缺陷突变体（Intβ3D119A型)半乳糖凝集素-3与整合素结合的研究(C类). 半乳糖凝集素-3在Intβ3中的结合减弱D119A型-转染细胞，表明这对细胞在galectin-3介导的吞噬活性中很重要；n个= 3, **P（P）< 0.05. 免疫细胞化学和共聚焦显微镜分析galectin-3（红色）和整合素β三上述实验中的（绿色）信号(D类). 在Intβ3中可以看到信号的彩色化重量-转染HSC(一，箭头），而在Intβ3中D119A型-转染细胞未发现共定位(b条). 在未转染（NT）细胞中，未发现明显的共定位。(c（c）). 棒材=25μM。
众所周知，整合素通过促进栓系和诱导导致肌动蛋白重组和吞噬体形成的信号通路介导凋亡细胞的吞噬作用(4,32). 为了证明HSC吞噬作用受整合素调节，将原代HSC与整合素α孵育v（v）β三抗体(). 这种异二聚体被描述为诱导HSC活化和增殖(35)吞噬细胞吞噬凋亡细胞(4). 阻断整合素后，HSC的吞噬活性下降。因为已知galectin-3可以交联整合素，从而调节细胞粘附(25,26)接下来，我们测试了galectin-3是否与整合素α结合v（v）β三发生在HSC中。用Intβ3转染原代HSC重量或Intβ3第119天进行细胞粘附试验以评估与galectin-3的结合。我们发现Intβ3转染的细胞结合力降低D119A。(). 此外，免疫荧光研究和共聚焦显微镜证实，转染Intβ3的HSC重量与重组galectin-3接触后，信号在膜上共定位()然而，在Intβ3中D119A型-转染细胞后，未观察到这种共定位，信号的整体强度降低，表明完整的整合素αv（v）β三是结合半乳糖凝集素-3所必需的(). 这些发现表明细胞外半乳糖凝集素-3在结合和交联整合素α中发挥作用v（v）β三促进AB的吸收。
半乳糖凝集素-3中的星形胶质细胞活化−/−细胞减少。评估细胞外半乳糖凝集素-3是否介导HSC活化，wt或半乳糖凝集素-3−/−用AB培养细胞，加入或不加入重组半乳糖凝集素-3(). wt-HSC对AB的吞噬通过产生TGF-β1（2.8±0.5倍，P（P）<0.001）和前胶原α1（I）（2.6±0.6倍，P（P）<0.05），与我们之前的数据一致(34)而重组galectin-3单独不诱导活化。从半乳糖凝集素-3分离的HSC−/−然而，肝脏HSC的激活被减弱，TGF-β1 mRNA表达降低到1.3±0.1倍(P（P）<0.05）和前胶原α1（I）增加到1.0±0.2倍(P（P）<0.05），同时这些细胞的吞噬活性降低(). 半乳糖凝集素-3−/−HSC在暴露于AB前用重组半乳糖凝集素-3处理，我们发现TGF-β1和前胶原α1（I）的表达均增加（1.7±0.2倍，P（P）<0.05和1.4±0.5），尽管没有达到wt吞噬HSC的水平。这表明，细胞内和细胞外半乳糖凝集素-3在调节吞噬诱导的HSC活化中发挥作用。
半乳糖凝集素-3是吞噬诱导HSC活化所必需的。wt和半乳糖凝集素-3−/−HSC在无血清培养基中用AB处理。在wt-HSC中，前胶原α1（I）和转化生长因子（TGF）-β1的表达显著增加，而与rGal3孵育并没有诱导活化。半乳糖凝集素-3的促纤维化转录物没有增加−/−细胞。然而，在细胞与rGal3和AB孵育后，TGF-β和前胶原α1（I）的表达被诱导。βACT、β-肌动蛋白。数据为平均值±SE，n个= 4. *P（P）<0.05和#P（P）< 0.001.
半乳糖凝集素-3在活化的HSC中上调通过NF-κB介导的途径，因为在肝硬化中发现galectin-3表达增加(14)接下来，我们探索galectin-3是否在肌纤维母细胞转分化中被诱导，以及这是否是吞噬介导的。在NF-κB抑制剂CAPE存在或不存在的情况下培养HSC()，因为已知NF-κB调节galectin-3启动子(15,22). 吞噬后半乳糖凝集素-3上调5.3±0.9倍(P（P）<0.005），并且在存在CAPE的情况下，这被显著抑制（0.7±0.2倍，P（P）<0.005，与AB处理的细胞相比）。为了证实NF-κB活化在调节galectin-3表达中的作用，在吞噬前用DN-IκB转染HSC(). 半乳糖凝集素-3的表达显著降低（0.3±0.03倍，P（P）<0.005），与暴露于CAPE的细胞相似。在表达控制载体的细胞中，吞噬作用诱导半乳糖凝集素-3表达增加1.8±0.2倍(P（P）< 0.01). 为了证实NF-κB的激活，在有无CAPE的情况下对吞噬HSC进行EMSA(). κB在AB吞噬后被激活。总之，吞噬作用涉及NF-κB的激活后，galectin-3在HSC中上调。这表明galectin-3可能参与吞噬介导的纤维生成过程的前馈诱导。为了证实这些HSC在诱导后确实能分泌半乳糖凝集素-3，接下来我们进行了ELISA分析。
AB的吞噬通过核因子（NF）-κB导致半乳糖凝集素-3的诱导。用AB或AB加咖啡酸苯乙酯（CAPE，A类)或通过控制载体或显性阴性IκB表达载体（DN-IκB，B类). 实时PCR显示吞噬作用显著诱导半乳糖凝集素-3 mRNA，CAPE消除了这一现象(A类, #P（P）<0.005）或DN-IκB(B类，平均值±SE，n个= 3, **P（P）<0.01和#P（P）< 0.005). 电泳迁移率变化分析（EMSA）研究证实吞噬作用可诱导NF-κB活化，而CAPE可显著减弱这种活化(C类和D类，密度测定数据，控制表示无AB暴露）。Arbp，酸性核糖体磷酸蛋白P0。数据为平均值±SE，n个= 3. **P（P）< 0.01.
吞噬作用诱导HSC和Kupffer细胞分泌半乳糖凝集素-3，半乳糖凝素-3的表达和分泌与炎症和肾纤维化过程中巨噬细胞的功能密切相关(10); 然而，肌成纤维细胞是否能以自分泌或旁分泌的方式分泌并诱导活化尚不清楚。将无血清培养基中的原代HSC或Kupffer细胞暴露于AB，并进行ELISA。吞噬作用后，培养基中的半乳糖凝集素-3浓度显著增加(P（P）<0.0001）在HSC中()在库普弗细胞中().
AB吞噬作用促进HSC分泌galectin-3(A类)和Kupffer细胞(B类). 将原代大鼠HSC或Kupffer细胞与AB在无血清培养基中孵育48 h。收集培养基，并进行酶联免疫吸附试验（ELISA）以量化细胞释放的半乳糖凝集素-3。AB处理的HSC培养基中的半乳糖凝集素-3水平显著高于对照组（平均值±SE，n个= 3, ##P（P）<0.0001）和Kupffer细胞(*P（P）<0.05）。
在激活的HSC中，半乳糖凝集素-3在BDL期间上调。为了证实半乳糖凝素-3在活体活动HSC中确实上调，对大鼠进行了BDL，并从假手术和BDL动物中分离出HSC。半乳糖凝集素-3表达显著诱导（3.9±0.4倍，P（P）<0.05）在BDL动物分离的HSC中(). 免疫组织化学和共聚焦显微镜显示，在BDL小鼠肝脏中，α-SMA阳性肌成纤维细胞共同表达galectin-3(n个= 4,).
半乳糖凝集素-3在胆道封闭（BDL）动物的肝脏中上调。从BDL和假手术大鼠中分离出HSC(A类). BDL动物HSC中galectin-3的表达显著增加(*P（P）< 0.05). 使用抗半乳糖凝集素-3的免疫荧光和共焦显微镜研究(B类,一和d日)和抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体(B类,b条和e（电子）)α-SMA和半乳糖凝集素-3信号的显示共定位(B类,c（c）和（f），覆盖图像）。
半乳糖凝集素-3降低纤维化−/−BDL后的小鼠。为了诱导肝纤维化，对wt和galectin-3进行BDL−/−老鼠。wt和galectin-3之间的丙氨酸转氨酶和总胆红素水平没有显著差异−/−老鼠；然而，与假手术动物相比有显著差异(). Picrosius染色显示BDL galectin-3后3周−/−与野生动物相比，小鼠的纤维化程度显著降低(n个= 4,P（P）< 0.01,,A类和B类). 羟脯氨酸测定证实了这一点(P（P）< 0.05,). 纤维生成标记物α1（I）和α-SMA在BDL-galectin-3中的表达显著减弱−/−小鼠与野生动物的比较(). 此外，我们检测了TGF-β1和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1的表达，这两种蛋白在半乳糖凝集素-3中均显著降低−/−老鼠(). 此外，炎性活动标记物单核细胞趋化蛋白-1的表达也显著降低(). 这些数据支持半乳糖凝集素-3在肝纤维化形成中的重要作用。
表2。
半乳糖凝集素-3中的ALT和胆红素值没有显著变化−/−老鼠
| 重量
| 镀锌-3−/−
|
|---|
| 伪装 | 巴西存托凭证 | 伪装 | 巴西存托凭证 |
|---|
| ALT，单位：升 | 24.4 ± 4.3 | 346.5 ± 73.4* | 64.0 ± 2.0 | 408.0 ± 44.0* |
| 总胆红素，mg/dl | 0.66 ± 0.03 | 21.19 ± 6.00* | 3.67 ± 1.67 | 18.00 ± 3.95* |
半乳糖凝集素-3降低肝纤维化−/−老鼠。苦味酸染色显示在半乳糖凝集素-3中BDL后纤维化减轻−/−老鼠(A类). 半乳糖凝集素-3的纤维化面积显著降低−/−BDL后的小鼠（平均值±SE，5只小鼠中计算出5个不同的区域，P（P）< 0.05,B类). 通过羟脯氨酸测定评估肝脏中的胶原蛋白水平(C类). 在wt小鼠中，羟脯氨酸水平升高，而在galectin-3中−/−小鼠这一指标显著降低(P（P）< 0.05). 实时聚合酶链反应检测前胶原α1（I）和α-SMA的表达(D类). 在BDL后的wt小鼠中，两种转录物的表达都显著增加，而在galectin-3中−/−小鼠的增加明显减弱（平均值±SE，n个= 3, *P（P）<0.05和**P（P）< 0.01). 半乳糖凝集素-3中TGF-β1和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1的表达也显著降低−/−老鼠。数据为平均值±SE，N个= 3 (*P（P）< 0.05,E类). 半乳糖凝集素-3的炎症标志物肿瘤坏死因子（TNF）-α、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、白细胞介素（IL）-1β和白介素-6降低−/−BDL小鼠；然而，只有MCP-1的降低是显著的。数据为平均值±SE，n个= 3 (*P（P）< 0.05,F类).
讨论
在这项研究中，我们描述了一种解决半乳糖凝集素-3促纤维化作用的新机制。众所周知，这种凝集素传统上由中性粒细胞和巨噬细胞表达，并在吞噬细胞清除病原体（如肺炎链球菌(6)以及替代性巨噬细胞激活(23). 半乳糖凝集素-3也在肝脏活化的肌成纤维细胞中表达，细胞内半乳糖凝素-3被认为在Smad2/3非依赖性TGF-β信号传导和胶原生成中起作用(11). 然而，细胞外半乳糖凝集素-3调节纤维化的来源和机制尚未得到很好的描述。这些都是重要的研究领域，因为细胞外分泌的半乳糖凝集素-3对免疫调节有明显的作用(28,31)和细胞粘附(25)所有这些都是纤维生成过程中的关键事件。
HSC被描述为吞噬细胞，吞噬作用诱导其活化(34); 因此，很容易推测细胞外半乳糖凝集素-3是从受损的肝细胞中束缚和吞噬AB所必需的。事实上，我们已经证明，半乳糖凝集素-3中不存在AB的吞噬作用−/−HSC，但仅存在于重组半乳糖凝集素-3。为了研究半乳糖凝集素-3促进凋亡细胞吞噬的机制，我们研究了其与整合素的结合。整合素异二聚体αv（v）β三由HSC表达并与其激活和增殖相关(35)也被认为是吞噬作用的主要调节器(9). 我们的数据表明阻断整合素αv（v）β三确实抑制了HSC吞噬作用。半乳糖凝集素-3与整合素α的结合v（v）β三导致配体在表面聚集的通常被称为“半乳糖凝集素晶格”(27). 这可能会提高凋亡细胞与吞噬细胞的表面粘附和栓系效率。整合素参与对肌动蛋白重塑也是必要的，肌动蛋白重构是吞噬体形成和成熟所必需的(4). Rac 1 GTPase激活是整合素结合后肌动蛋白重构的重要步骤，事实上，我们在早期的研究中已经表明，在吞噬HSC时，Rac 1的GTPase活性被诱导(17). 在wt-HSC中，我们发现吞噬作用后诱导促纤维化转录物；然而，在半乳糖凝集素-3中未发现TGF-β或前胶原α1（I）的显著诱导−/−HSC与吞噬活性下降相对应。重组半乳糖凝集素-3仅部分逆转了这一点，表明细胞内半乳糖凝集素-3也在纤维化信号传导中发挥作用，正如Henderson等人提出的那样(11). 在该研究中，肝纤维化基于CCl4模型，其中肝细胞的毒性损伤、凋亡/坏死是起始事件。BDL是一种独特的纤维化模型，根据以往的研究，除HSC外，门脉肌成纤维细胞也起主要作用(2). 事实上，我们在门脉周围肌成纤维细胞中观察到强烈的半乳糖凝集素-3和α-平滑肌肌动蛋白结合。
在本研究中，我们还对半乳糖凝集素-3的细胞来源进行了详细分析，并研究了半乳糖凝素-3对HSC的自分泌激活。我们已经证明，galectin-3在BDL大鼠分离的HSC中上调。活性HSC中半乳糖凝集素-3的表达是由NF-κB介导的，半乳糖凝素-3是在吞噬作用后由活性HSC分泌的(). 众所周知，半乳糖凝集素以静止状态储存在细胞质中，但在组织损伤时，活化细胞可通过非经典途径积极分泌胞浆半乳糖凝素(1). 如我们所示，活化的HSC也会产生半乳糖凝集素-3，因此可能诱导HSC的自分泌和旁分泌激活，并进一步调节免疫反应，如诱导巨噬细胞趋化性及其替代激活(12,23). 事实上，我们发现半乳糖凝集素-3中炎症细胞因子的产生减少−/−BDL小鼠。根据最近的数据，半乳糖凝集素也被归类为损伤相关的候选分子模式(30)支持了它们调节先天性和适应性免疫反应的理论。
半乳糖凝集素-3在HSC激活中的作用。半乳糖凝集素-3诱导整合素介导的AB摄取，NF-κB活化，并增加半乳糖凝素-3的产生和分泌。因此，半乳糖凝集素-3可能通过前馈机制调节纤维化。
总之，在本研究中，我们已经显示了细胞外和细胞内半乳糖凝集素-3通过前馈机制调节肝纤维化过程中星状细胞吞噬和活化的新作用。半乳糖凝集素-3是慢性肝损伤时清除凋亡细胞所必需的，细胞外和细胞内半乳糖凝素-3都发挥重要作用。体内，半乳糖凝集素-3−/−小鼠的纤维生成反应减弱。基于这些发现，针对肝损伤和纤维化期间半乳糖凝集素-3的生成可能成为一种成功的治疗策略。
赠款
本研究得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所拨款DK-069765、DK-080715和DK-083283（新泽西特罗克）的支持。
致谢
S.Devaraj的当前地址：德克萨斯州儿童医院和贝勒医学院病理科。
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