肌萎缩侧索硬化症C9ORF72扩张的临床病理特征

用C9ORF72六核苷酸扩增法测定ALS患者的临床表型

发现携带C9ORF72型以系统的方式对扩展进行审查，以确定疾病表型的细节，包括性别、发病年龄、病程、疾病变异、家族史细节和是否存在认知障碍。值得注意的是，该队列中的患者只有在发现临床问题时才进行正式的认知评估，而在疾病过程中没有进行常规的系列神经心理学评估。因此，由于前瞻性神经心理学研究表明，ALS患者额叶功能障碍的发病率较高，因此该队列中记录的额叶功能障碍发病率可能被低估(普坎等., 2011).

重复引物聚合酶链反应筛选C9ORF72六核苷酸重复序列

基因组DNA（100 ng）使用引物和以下描述的方法进行扩增伦顿等（2011年）轻微调整底漆配比：正向：反向：锚=8:1:8。详细方法见补充材料在ABI3730毛细管分析仪（生命技术公司应用生物系统公司）上使用60s注射时间分析碎片。使用Peak Scanner Software（Applied Biosystems，Life Technologies Corporation）分析碎片数据。

神经病理学评估

在征得近亲同意的情况下，将大脑和脊髓组织捐赠给谢菲尔德脑组织库进行研究。本项目中的捐赠程序和组织使用得到了研究伦理委员会的批准。在22例脑组织库病例中，有19例患者的组织可用于详细的病理学评估，其中己二核苷酸扩增为C9ORF72型。这些病例与多达96例病例进行了比较（见下文和表3)ALS病例，对C9ORF72型扩张和三个神经正常对照。在一些病例中，一个大脑半球、一半中脑和脑干、一部分小脑和不同水平的脊髓段在尸检时迅速冷冻在液氮中，并储存在−80°C。中枢神经系统的其余部分是福尔马林固定的。对于其他病例，只有一部分小脑被冷冻，整个大脑和脊髓被福尔马林固定。将选定的块体（包括腰、胸、颈脊髓、髓质、中脑、海马、额叶、颞叶和运动新皮质）加工成石蜡。

除了用酊剂进行常规神经组织学检查外，还对p62/固存体1、TAR DNA-结合蛋白43（TDP-43）、FUS、OPTN、CD68和C9ORF72进行了免疫组织化学检查(补充表1)在那里可以得到石蜡组织。后一种抗体是商用的（Santa Cruz Biotechnology Inc.），是根据其在蛋白质印迹上标记的分子量为C9ORF72的蛋白质而选择的（数据未显示）。对所有有六核苷酸扩张的病例、三例无扩张的散发性ALS病例和三名神经健康对照进行免疫组织化学检查。

为了描述谢菲尔德脑组织库中ALS患者的病理分布，评估了p62阳性病理的程度。在所有评估区域中，检查单个6-µm切片，并半定量评估感兴趣区域中的神经元细胞质内含物数量为0-4（低）、5-9（中）或10或更多（高）。所评估的感兴趣区域是位于中颈和腰椎水平的脊髓前角；延髓舌下核、迷走神经背核和模糊核；海马、额叶皮质和运动皮质的齿状颗粒细胞层和CA4亚区。在皮层区域，在10个区域（×25目标）对神经元细胞质内含物进行定量。

此外，在TDP-43和OPTN免疫染色的切片上，使用相同的半定量方案评估海马CA4亚区神经元胞质内含物的数量。

伴有C9ORF72病理扩张的ALS患者的临床特征

年病理性扩张病例的临床特征C9ORF72型总结于表1平均发病年龄为57.3岁（范围27-74岁）。其中，60%的患者有肢体起病，31%的患者有延髓起病；6%的患者出现多灶性疾病，一名患者出现痴呆，一名病人的发病时间未知。这些患者从症状开始的平均病程为30.5个月（范围为7-60个月）；在撰写本文时，有三名患者还活着，其中一名患者的生存信息尚不可用。

患者的临床特征C9ORF72型将扩展与筛选队列的其余部分进行比较(表2). 这个C9ORF公司72名患者的发病年龄明显低于非患者-C9ORF72型例（平均发病年龄57.3岁，SD 8.9岁，平均60.1岁，SD 12.3岁；P（P） = 0.03，干膜厚度=494，t吨 = 2.20），但与整体家族性ALS队列无显著差异(P（P） = 0.43，d.f.=107，t吨 = 0.78). 同样，患有C9ORF72型扩张期的疾病持续时间明显短于非扩张期-C9ORF72型例[平均病程30.5（13.3个月），平均病程36.3（28.5个月）；P（P） = 0.01，干膜厚度=397，t吨 = 2.44]但与整体家族性ALS队列无显著差异(P（P） = 0.32，d.f.=100，t吨 = 1.00). 散发性ALS患者亚组C9ORF72型扩张与家族性ALS患者的不同之处在于，他们的发病年龄明显更高[散发性ALS的平均发病年龄为59.5岁（SD 7.0岁），家族性ALS的发病年龄为54.3岁（SD 10.4岁），P（P） = 0.03，d.f.=59，t吨 = 2.21]，但与筛查队列总体发病年龄无差异。散发性ALS患者和家族性ALS扩张患者的病程无差异[散发性ALS-平均病程（SD）28.6（12.0个月），家族性ALS--平均病程33.3（14.8个月），P（P） = 0.21，d.f.=56，t吨 = 1.26].

在我们的患者队列中C9ORF72型扩展，5/27（19%）家族性ALS病例和5/35（14%）散发性ALS患者有FTD的临床和神经心理测试证据。另有12例患者的一级或二级亲属有痴呆家族史，其中6例有家族性ALS，6例有散发性ALS。总的来说，22/62（35%）的扩张患者要么被诊断患有痴呆症，要么有一级或二级亲属的痴呆家族史。在这个队列中，在没有临床明显认知问题的情况下，没有进行常规神经心理学评估，因此没有评估亚临床认知功能障碍。

一些患者携带了己二核苷酸扩增C9ORF72型被诊断患有其他非痴呆性神经或神经肌肉疾病，特别是神经退行性疾病，或有其家族史：四名患者有帕金森氏病家族史，一名患者有经尸检证实的帕金森氏症合并诊断；因此，4/62（6.5%）的患者要么被诊断为帕金森氏病，要么有帕金森氏症家族史。两名患者有脱髓鞘疾病的证据，另一名患者有多发性硬化家族史；因此，3/62（5%）的患者有脱髓鞘疾病的诊断或家族史。其他值得注意的发现包括一名有ALS家族史、Charcot–Marie–Tooth病和痴呆症的患者；一名患者患有早发性白内障，该白内障也发生在他的母亲身上；一名患者有亨廷顿氏病家族史，另一名患者的兄弟被诊断为肌营养不良而死亡。

患者C9ORF72型扩张术后37/62例（60%）出现肢体起病，19/62例出现延髓起病（31%）(表2). 这些比例与没有C9ORF公司72膨胀（分别为56%和25%）。性别比例没有显著差异(P（P） = 0.09，d.f.=1，χ² = 2.85）或发病部位(P（P） = 0.74，d.f.=1，χ² = 0.10），尽管家族性ALS扩张患者中女性占优势（男性与女性之比=1:1.7），但这在扩张型散发性ALS患者（男性：女性=1.1:1）或整个筛查队列（男性：雌性=1.3:1）中并不存在。

继承模式

六核苷酸扩增C9ORF72型在我们来自英格兰北部的队列中，ALS家族病例占很大比例（43%），其中许多家族表现出明显的常染色体显性遗传。高发病率C9ORF72型明显散发病例中的重复扩张是一个重要的观察结果。它可能代表具有可变外显率的真正遗传致病基因型，也可能代表新突变的高比率，这与C9ORF72型基因可能天生不稳定(伦顿等., 2011). 我们队列中的一个家庭证明了不完全外显率可能发生，在该家庭中，指数病例及其母舅舅（均为ALS患者）和指数病例的母亲（无病至老年）都存在外显率的增加(图3). 值得注意的是，对于一部分明显散发的病例，有神经疾病家族史；这些病例中有一些可能是未被认识或未被发现的家族性疾病。特别是，一些亲属患有痴呆症的患者实际上可能患有家族性ALS/FTD。有趣的是，关于发病年龄和性别比例，而不是疾病长度，散发性ALS患者C9ORF72型扩张与家族性ALS患者不同。具有突变的家族性ALS病例发病年龄越早，可能表明发生了遗传预期，尽管这在本研究中无法得到证实，因为病理重复序列的精确长度尚未确定。

值得注意的是，我们现在在42/63（67%）的家族队列中发现了一种致病性变化。在两种情况下C9ORF72型发现与另一个已知的与ALS相关的假定突变共存。我们大多数先前发现突变的患者都没有扩张，这支持了这些变化的独立发病机制。1例患者（37号患者）出现扩张，患者体内的p.Ala321Val发生变化TARDBP公司TARDBP C末端区域突变的发病机制已经明确(斯里达兰等., 2008;柯比等., 2010)值得注意的是，我们队列中描述变化的其余患者TARDBP公司没有携带C9ORF72型扩展。有趣的是，该患者的发病年龄相对较年轻（37岁），可能与这两种基因变化对疾病发病机制的协同作用一致。然而，该患者的疾病持续时间相对较长，为58个月。由于TARDBP公司以及的扩展C9ORF72型都与神经元胞质TDP-43内含物有关，可以想象，它们可能以非加性方式影响同一途径。不幸的是，本案没有验尸材料。

一例未报告的家族性ALS伴p.Glu322Lys病例OPTN公司替换还显示C9ORF72型扩展。尽管这种替代在撒哈拉以南非洲样本中被报道为多态性(线路接口单元等., 2008)来自同一地理区域的375名神经系统正常的白种人对照组中没有该基因。该患者患有球型ALS，发病年龄50岁，病程29个月。

痴呆

ALS和FTD之间的关联已得到充分确立(普坎等., 2007). 然而，之前的一项人群研究报告称，ALS患者亲属的痴呆发生率（5%）仅略高于对照组(胡斯曼等., 2011)只有一级亲属。ALS被认为是各种疾病机制的共同终点(费拉约洛等., 2011)可能只有其中一些机制会导致相关的痴呆症。因此，疾病异质性可能意味着本研究中一些患者的相关性更强，而其他患者的相关性缺乏则掩盖了这一点。在我们的患者队列中C9ORF72型35%的患者被诊断为痴呆或有痴呆家族史。我们认为由六核苷酸重复扩增引起的ALS亚型C9ORF72型在临床上与痴呆症有显著关联。我们对所有运动外神经病理学的发现有力地支持了这一建议C9ORF72型尸检时检查的扩张病例，同时发现正常重复长度为C9ORF72型这一假设将得到ALS患者一生中常规认知测试的进一步支持，并与死后神经病理学相关。TDP-43蛋白病ALS、伴有FTLD的ALS和纯FTLD-TDP通常被视为两种临床疾病的连续体(Lillo和Hodges，2009年)和病理水平(麦肯齐和费尔德曼，2005年;盖瑟等., 2009). 这就提出了一个问题，即TDP-43蛋白病患者在该谱上的哪些部位会在病理学上表现出疾病，以及他们将如何在临床上表现出来。我们的数据表明C9ORF72型对临床表型和病理谱有很大影响。重复扩增具有这种作用的确切机制需要阐明，比较有和没有重复扩增的FTLD-TDP病例大脑中的病理分布显然是有意义的。

其他神经疾病

几名携带己核苷酸扩增的患者C9ORF72型被诊断患有其他神经系统疾病，特别是神经退行性疾病，或有家族史。尸检证实的ALS和多发性硬化症病例说明了这一点。先前的研究表明，ALS的临床谱可能比最初认识的更广。特别是VCP公司该基因似乎会导致包涵体肌炎、FTD和佩吉特病等临床症状(约翰逊等., 2010). 据报道，ALS与青光眼共存的患者中OPTN公司尽管作者继续认为这可能是巧合(丸山等., 2010). 对我们队列的分析表明C9ORF72型虽然我们尚未证明扩张与非ALS神经疾病的分离，但也可能产生广泛的临床表型。

之前在关岛进行的一项人口研究描述了帕金森氏病和ALS在个人和家庭中的共存(柳原幸男等., 1983). 然而，其他调查一种以上神经退行性疾病共存的人群研究结果并不一致。最近一项基于人群的研究表明，ALS患者亲属中帕金森病的发病率与对照组无显著差异(胡斯曼等., 2011). 然而，值得注意的是，在我们的六核苷酸重复序列患者中，亲属帕金森病的发病率（6.5%）远高于Huisman研究中的疾病或对照人群（0.9%）。我们的一位患者C9ORF72型扩张被诊断为帕金森氏病和ALS。他的帕金森氏病发生于38岁的相对早期，但在其他方面具有典型的临床表现，对左旋多巴治疗反应良好；他47岁时植入了一个脑深部刺激器。尸检后，他有帕金森氏病和ALS的神经病理学特征，包括黑质细胞丢失和6/6 Braak级α-向心葡萄糖蛋白病理学，黑质和新皮质区均有大量染色。

以前曾报道过多发性硬化症和ALS共存（Hader等., 2008; 伊斯梅尔等.，手稿正在审查中）和ALS患者后代多发性硬化的发病率也有报道(赫明基等., 2009). ALS患者与C9ORF72型我们队列中的扩张和多发性硬化症与这些报告一致，并增加了ALS和多发硬化症之间的关联可能与该基因型有关的可能性。一名携带亨廷顿氏病患者父亲的亨廷顿病诊断C9ORF72型鉴于亨廷顿氏病也与异常重复序列有关，这种扩展尤其有趣。也许是一个共同的潜在机制导致了从头开始核苷酸重复序列在这两个个体中的出现。

神经病理学特征

定性而言，与六核苷酸重复扩增相关的神经病理学特征C9ORF72型是典型的ALS，在上下运动神经元和胶质细胞中有泛素化、TDP-43和OPTN阳性神经元和胶质细胞质内含物。这与布尼娜小体和锥体束退化有关。令人惊讶的是，锥体细胞病理学与海马体和额叶新皮质的扩张有关，而在ALS患者中，如果没有重复扩张，这种病理学很少出现。这种分化在海马齿状回颗粒细胞中不太明显，通常认为这种结构是TDP-43蛋白病最敏感的运动外结构之一(麦肯齐和费尔德曼，2003年;塔克达等., 2009). 根据以下方案，所见的运动外病理学最好描述为B型麦肯齐等. (2011).

根据运动外（主要是海马和额颞叶新皮质）的神经病理学病变，ALS病例被分为两个亚组(西平等., 2008). 本报告中的数据表明C9ORF72型代表了这种病理二分法的主要分子基础。

从我们从一个大型ALS尸检病理队列中获得的数据来看，发现运动外新皮质病理，特别是海马CA4亚区的泛素化神经元胞质内含物，是一个相对可靠的指标，表明在ALS大鼠脑组织中存在六核苷酸重复扩增C9ORF72型鉴于这些变化可以在尸检时相对容易地检测到，这种神经病理学特征可用于指导重复扩增的基因调查，从而为基因咨询和进一步研究提供信息。有趣的是，在一些患有SOD1标准突变(因斯等., 1998)该报告为ALS基因型的神经病理学预测因子添加了另一个重要因素。值得注意的是，在海马体中，p62免疫组化显示的大多数神经元胞质包涵体病理在TDP-43免疫组化上并不明显。事实上，对于CA4亚区（病理学对重复扩张最具特异性），OPTN是比TDP-43更敏感的标记物，尽管两者都不如p62敏感。这就提出了一个重大问题，即如果不是TDP-43，那么在大多数神经元中，什么样的蛋白质会形成泛素化损伤。

C9ORF72蛋白的免疫组织化学显示，灰质结构的整个神经膜上有多个微小的标记点，在神经元过程中出现突触标记。在海马体中，这一点在表现出病理学特征的区域最为明显，该病理学特征是六核苷酸重复扩增。另外还有胶质细胞的标记，其中许多似乎是少突胶质细胞，轴突周围对应于髓鞘的某些区域。这些构成了初步观察结果，C9ORF72表达的精确性质需要更详细的表征，包括更精细的定位研究，以便开始了解C9ORF 72蛋白在中枢神经系统中的功能。

我们感谢谢菲尔德和纽卡斯尔运动神经元疾病护理研究中心的所有ALS/MND患者及其家人，他们通过捐赠生物样本为研究做出了慷慨贡献。