压力诱导肌源性张力及20-HETE在脑血流自动调节中的作用

摘要

逐步增加在隔离和插管的大脑动脉中，跨壁压力引起一系列信号事件，最终导致动脉段的逐步收缩。这些动脉肌信号事件包括膜去极化、外向钾减少⁺电流，向内钙增加²⁺电流（通过L型Ca²⁺通道），PKC移位和磷酸化，肌醇1,4,5-三磷酸和二酰甘油升高，所有这些都与动脉肌的激活有关，并允许动脉直径跟踪血压的变化，从而保持血流相对恒定(三,5,19,25,27–31,44). 介导这些事件的信号通路涉及强效血管收缩剂20-羟基二十碳四烯酸（20-HETE）的产生(15,21,23,26,34). 尽管动脉压波动很大，但这些信号反应仍能保持血流恒定。这种维持血流的原因既可以从生理学上解释，也可以从目的论上解释。由于密闭空间中不可压缩流体的物理性质，头骨不允许血管体积或流量发生变化。容积分布的可用空间是血管空间变化和保护微循环免受血压变化影响所必需的(2,18). 同样，血管内剪切力的变化会改变血管直径，从而改变肌生成能力和总血管内容量(45,46). 剪切作用被认为仅限于内皮因子产生的作用，而压力作用同时作用于内皮细胞和动脉肌细胞，对收缩和扩张产生影响(19,22,44,46). 20世纪早期，人们描述了动脉压力变化引起的肌生成力(三)，直到1984年(19)我们观察到，与当时在张力记录肌电图仪连接的导线上安装环段的标准做法相比，增加血管内压力会使血管壁去极化，通过引起离子电导系统的变化改变对血管活性物质的敏感性(6). 描述于图1是腔内压力连续增加对脑动脉插管准备的影响，导致压力依赖性膜去极化和管腔直径减小。

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图1。

我：在不同透壁压力下拍摄的猫大脑动脉节段的一系列显微照片。每张照片中的水平虚线位于容器壁的内部边界。每张照片左角的数字给出了膜电位(电子_米)在拍摄显微照片时记录在动脉中。二：细胞内的实际图表记录电子_米在4种不同跨壁压力[10 mmHg]下，从孤立脑动脉的肌细胞记录(A类)，100毫米汞柱(B类)，140毫米汞柱(C)和170毫米汞柱(D类)]. 随后，跨壁压力的增加导致了内径的显著压力依赖性下降以及与尖峰产生相关的膜去极化(19).

从膜结合磷脂池中释放花生四烯酸和生成花生四烯酸类衍生中间体：通过作用于钾控制脑小动脉张力⁺和Ca²⁺频道

不同类型脂肪酶的刺激可以催化水解裂解并从膜磷脂的sin-2位置释放花生四烯酸（AA）(23,44,52,53). 这种酶促释放的AA可以代谢为前列腺素、白三烯，如本文主要讨论的，还可以代谢为细胞色素P（P）-450（日历年）(40,41,50)-催化代谢产物(7,16,23,42,47). 血管CYP单加氧酶（CYP-ω-羟化酶和CYP-环氧合酶）（分别将AA代谢为20-HETE和环氧碳三烯酸（EET））以及使EET失活的可溶性环氧化物水解酶的发现，获得了众多的交流和奖项(9,12,14–16,21,47). 1994年，Harder等人的实验室首次在完整的脑动脉中鉴定和检测到AA 20-HETE的主要CYP 4A-ω-羟化酶代谢产物(图2B类) (21)后在分离的脑动脉肌细胞中证实了其特异性生成(16) (图2A类). 20-HETE被发现是迄今为止最有效的血管收缩剂之一。据报道，AA（包括20-HETE）的CYP代谢物的生理作用是通过修改离子通道功能实现的(9,14,16,17,21). 20-HETE被发现抑制大电导钙的活性²⁺-激活的K⁺通道（K_钙)增加钙的流入²⁺通过激活脑动脉L型钙²⁺通道(16,21,31). 在20世纪80年代末和90年代初，我们发现20-HETE的产生介导了肌源性反应，这是目前的一项重大发现(21,26,34). 研究发现，20-HETE对去极化和提高细胞内Ca具有深远的作用²⁺通过其对动脉K的作用在血管壁中_钙和L型钙²⁺通道(图3和4二) (16,21,31).

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图2。

脑动脉肌中20-羟基二十碳三烯酸（20-HETE）形成的分析。我：反相高效液相色谱法显示CYP 4Aω-羟化酶代谢[¹⁴C] 花生四烯酸([¹⁴C] AA）至20-HETE在分离的脑动脉肌细胞中的表达[对照(A类)，标准(B类)和17-十八烯酸（17-ODYA；C)]. CPM，每分钟计数；EET，环氧碳三烯酸。二：通过气相色谱-质谱鉴定20-HETE。请参阅参考资料中的详细信息。16和21.

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图3。

单通道大电导率Ca²⁺-激活的K⁺（K）_钙)电流(我_K（K）钙)使用4.7 mM K在斑电位0 mV下从脑动脉肌细胞记录⁺沐浴液和145 mM K⁺在记录吸管溶液中。A类：与对照组相比，用细胞色素治疗P（P）-450 4A（CYP 4A）ω-羟化酶抑制剂17-ODYA（20μM）诱导单通道活性增加(中间的)随后添加1 nM 20-HETE抑制(底部). C、 封闭；O、 打开。B类：事件数量和信道开放状态概率（NP）的变化_o个)用17-ODYA或20-HETE处理后，分别诱导217 pS K的活化和抑制_钙单通道电流*P（P）< 0.05;n个=5至6个单元格(21).

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图4。

我：1μM 20-HETE对细胞内钙的影响²⁺肾动脉分离的动脉平滑肌细胞水平。条形图描述了8个单独实验中分离的动脉肌细胞对20-HETE（1μM）的平均反应*P（P）与对照值相比<0.05(34).我,插入：细胞内钙增加²⁺20-HETE刺激动脉肌细胞后的水平。二：宏观L型钙的活化²⁺外源性应用20-HETE（100 nM）记录猫脑动脉肌细胞的通道电流(A类). 20-HETE显著增加了峰值向内L型Ca的幅度²⁺电流(B类)在−50到+50 mV之间的10-mV阶跃去极化期间记录(16).

PKC在脑血管控制中的作用及20-HETE的作用机制

此时此刻，我们只能推测，动脉压的升高通过刺激血管壁中的分子来拉伸，从而激活磷脂酶(11,23,39,44). 尽管我们不知道压力诱导产生20-HETE以启动肌源性反应的确切机制，但我们确实知道PKC和可能的肌醇1,4,5-三磷酸参与了这一过程(11,25,29,30,39). 压力的血管收缩作用与去极化有关(19,22)在20-HETE释放和PKC活化和移位后(15,21,26,31,34). 刺激物诱导磷脂酶C的活化，包括通过压力作用，与随后形成的激活PKC的二酰甘油、AA及其代谢物有关(23,39)，禁止K_钙活性，并使质膜去极化，导致细胞内钙升高²⁺脑动脉肌的浓度和活化(16,21,31,34). 事实上，20-HETE的主要作用似乎是通过激活PKC(31). 这一假设的主要支持证据是发现内源性PKC的抑制使用选择性N个-肉豆蔻酰化PKC假底物抑制剂肽_(19–27)]区块20-HETE诱导的K减少_钙脑血管平滑肌细胞的电流记录(图5)没有采取独立行动(31). 类似地，PKC的原型激活物PMA诱导了K_钙上述PKC假底物抑制剂肽的作用减弱了同一脑动脉肌细胞中的电流，20-HETE模拟了该肽(31). MyrΨPKC-I_(19–27)不改变整个单元格K_钙与对照组相比，电流本身表明PKC介导的通路参与了20-HETE诱导的K抑制_钙电流。此外，生化数据表明，20-HETE增加了肉豆蔻酰化丙氨酸富含C激酶底物（MARCKS）的磷酸化，这是一种敏感和选择性的内源性底物，也是PKC活性水平的指示物(图6)为PKC作为20-HETE作用的分子靶点之一的作用提供了支持性证据。

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图5。

PKC的抑制减弱了对全细胞K的抑制⁺20-HETE电流。A类：应用N个-肉豆蔻酰化PKC假底物抑制剂肽_(19–27); 100 nm]未改变整个细胞K⁺电流(中间的)，20-HETE（300 nm）未能降低整个细胞K⁺PKC抑制剂存在时的电流(底部).B类：之前的平均峰值电流电压关系(○), 添加MyrΨPKC-I后_（19-27）（100纳米；●), 以及在继续存在100 nm MyrΨPKC-I的情况下添加300 nm 20-HETE后_（19-27）(▼). 20-HETE未降低整个细胞K⁺PKC抑制后的电流振幅(n个=每个实验5）。垂直线表示SE(31).

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图6。

MyrΨPKC-I的浓度依赖性抑制_(19–27)20-HETE（1μM）诱导猫脑动脉肌细胞中87 kDa肉豆蔻酰化丙氨酸富含C激酶底物（MARCKs）蛋白磷酸化。A类：描述MyrΨPKC-I浓度相关抑制剂作用的代表性放射自显影_(19–27)20-HETE诱导的MARCK磷酸化。B类：折线图，显示来自n个=6个这样的实验并行进行。平均数据用单一指数函数拟合(31).

20-HETE在压力诱导的肌源性自身调节中的重要作用

许多行为都归因于20-HETE的影响(15,16,31,47). 其中最重要的是PKC诱导磷酸化的激活(31). 20-HETE的这种作用导致K的抑制_钙通道活性和膜去极化。这种膜去极化负责多种信号事件，包括L型钙的激活²⁺通道和内向钙的增加²⁺电流。我们认为，细胞膜去极化是对钾离子抑制的反应_钙通道活性为钙创造了积极的驱动力²⁺内流和细胞激活的强大信号。这些发现在许多出版物中重复出现(15,16,31,47)是跨壁压力增加时压力诱导大脑动脉肌激活的标志性事件(16). 我们还认为，这也可能是导致压力诱导大脑小动脉激活的启动机制之一。PKC激活在20-HETE诱导的K_钙20-HETE能够增加MARCKS的磷酸化，这是PKC活化诱导磷酸化的一个特异而敏感的内源性靶点，并且20-HETE诱导的对K_钙选择性PKC激活剂PMA诱导的通道(31; 以及其中的参考文献）。据推测，这种PKC-相关的MARCKS磷酸化信号通路的激活是20-HETE血管收缩作用的基础，可能是与其他内源性信号分子或含有MARCKS-结构域的基因相互作用的联系，并可能影响调节肌源性反应的膜离子事件脑循环或其他血管床。因此，20-HETE PKC和MARCKS信号通路可以被认为是评估不同疾病条件下健康和/或脑血管疾病中大脑功能的关键信号级联。

CYP衍生EETS对20-HETE压力介导活化的拮抗作用：星形胶质细胞的营阳作用及其在功能性充血中的可能作用

我们实验室首次通过分子和生化方法证明了大鼠大脑皮层和海马区星形胶质细胞原代培养物中CYP 2C11环氧酶的表达和EET的形成(1). 近十年后，Bylund等人鉴定了第二种CYP环氧合酶异构体，命名为CYP 4X1(7)在我们的实验室中通过逆转录聚合酶链反应在大鼠、小鼠和人脑中进行。CYP 4X1在整个大脑、脑干、海马、皮层和小脑的神经元以及血管内皮细胞中表达(7). 与20-HETE不同，EET增加K的活性_钙通道电流和超极化大脑和其他动脉床，导致血管舒张(9,14,17,20). 自发现星形胶质细胞中的CYP 2C11环氧合酶以来，在过去的15年里，来自众多实验室的大量工作已导致鉴定与EET相关的许多生物功能。因此，EET已被证明在血管细胞增殖、血管生成、抗炎、镇痛、神经保护方面发挥作用，最重要的是在血管反应性中发挥作用，在血管反应中起调节功能性充血的作用(9,10,14,17,43,47,49,54,57–59). 由于EET能有效扩张大脑微循环，为代谢需要的神经元提供血液和氧气，因此，压力诱导的大脑动脉激活为血流充血增加奠定了基础。该场景如所示图7和​和8。8.英寸图8，我们提出了20-HETE和PKC介导的阴阳去极化膜(31)（去极化作用）和EET介导的反超极化作用(9,14,17).图7描述了由神经元、星形胶质细胞和微血管组成的整个神经血管单元的反应和相互作用。由激活神经元的代谢需求触发的信号将启动一系列事件，相当于通过功能性磁共振成像记录大脑活动，其中星形胶质细胞衍生的扩张器（如EET）增加血氧和血流量以匹配代谢需求(20,24,49). 包括我们在内的几个实验室几乎同时详细描述了这种事件序列的发生(20,24,49).

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图7。

压力和/或拉伸激活PLC以释放二酰甘油（DAG）和AA。由此释放的AA可被膜结合的CYP 4A酶代谢为20-HETE。20-HETE通过激活PKC导致离子通道磷酸化，在K的情况下_钙降低其活性，同时激活和促进钙²⁺进入L型Ca²⁺频道。这些离子机制会去极化并激活动脉肌肉，只要压力或拉伸刺激保持不变，动脉肌肉就会保持这种状态。脑星形胶质细胞或内皮细胞产生EET，EET通过增强K的活性抑制压力诱导的血管活性过程_钙通道电流和减少向内Ca²⁺电流从而扩张小动脉，激活；−，抑制；项目实施计划₂磷脂酰肌醇4,5-二磷酸；IP3，肌醇1,4,5-三磷酸；环氧合酶；TXA公司₂，血栓素A₂; 血管平滑肌细胞。

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图8。

示意图说明了第二信使信号事件和离子电导机制的级联，这些事件和离子传导机制有助于EET或20-HETE调节的压力诱导肌源性收缩的启动和发展。锂_钙，L型钙²⁺通道电流；SOCC，拉伸操作阳离子通道；P（圈出），通道的磷酸化状态。

血管生成

EET在诱导中枢神经系统血管生成方面的作用首次在星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞的共培养中报道(37). 星形胶质细胞释放的EET增加了胸腺嘧啶掺入到内皮细胞中，并启动了管状毛细血管结构的形成，这可以被CYP抑制剂17-十八烯酸阻断(37,59). 与EETs相关的血管生成是由星形胶质细胞释放这些CYP环氧合酶代谢产物AA介导的，也可以使用浸有EETs的Matrigel合成栓塞来观察(59). 根据酪氨酸激酶抑制剂金雀异黄素显著减弱这一过程的观察，这一血管生成过程似乎涉及酪氨酸激酶途径(59). 其他使用体内和体外方法的实验室已经证实EET在血管生成中的作用(57,58). EET诱导血管生成的其他途径包括MEK/MAPK、肌醇磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-Akt和鞘氨醇激酶-1信号途径(57,58). 当与星形胶质细胞一起培养时，脑毛细血管内皮细胞可以形成完整的血管回路，包括小动脉、毛细血管和血脑屏障(图9) (59).

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图9。

共同培养时星形胶质细胞和脑毛细血管内皮细胞的形态学变化。A类：在星形胶质细胞和脑毛细血管内皮细胞的共培养中，形成用乙酰化低密度脂蛋白双重标记的毛细血管样结构（箭头），标记有1,1′-二十八烷基-1,3,3,3′，3′-四甲基吲哚花青素高氯酸盐（DiI-Ac-LDL；红色）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP；绿色）。B类：在星形胶质细胞和脑毛细血管内皮细胞的共培养中，形成由血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1；绿色）、GFAP（红色）和4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）三重标记的毛细血管样结构（箭头）。注意星形胶质细胞和内皮管之间的相互作用（箭头A类和B类).C：用PECAM-1（绿色）和GFAP（红色）对血管和星形胶质细胞进行双重免疫标记，在正常大鼠皮层的一个切片中，显示撞击血管的足部突起的星形胶质细胞（箭头所示）。D类：通过DAPI染色鉴定形成试管的细胞（*）(电子)在共培养中，细胞-细胞边界上的连接蛋白43呈点状染色（箭头所示）。箭头指向中显示的区域插入放大倍率更高。F类：试管外的细胞（*）与D类显示中度至轻度的连接蛋白43细胞质染色。条形图输入A类=25μmA类和B类，巴=20μm英寸C，巴英寸F类=10μmD–F型，和酒吧插入属于D类=5微米(59).

大脑小动脉中的整个肌源性级联

通过对迄今为止已确定的信号转导和第二信使分子级联的研究，我们可以清楚地了解为什么100多年来我们一直在研究压力诱导脑血流自动调节的机制(三). 定义这种通路的试剂和方法的产生呈指数级增长，这使我们能够了解许多机制，这些机制负责为代谢活跃的神经元提供充足的血液流动。图10描述了我们目前对离子通道功能、膜电位调节以及感知和传递血压变化的无数信号分子的理解(5,11,13,15,19,22,25,27–31,39,44,48). 我们与Richard Roman博士（密西西比大学）和Howard Jacobs博士以及威斯康星州医学院的其他遗传学家的实验室合作，开发了一种大鼠模型，以确定压力诱导脑血流自动调节的生理和分子机制。我们定义的两个基因在这方面具有相对重要性，编码加合蛋白-3（ADD-3）和双特异性蛋白磷酸酶（DUSP）-5基因。

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图10。

示意图说明了第二信使信号事件和离子电导机制的级联，它们有助于压力诱导的肌源性收缩的启动和发展。磷脂酰胆碱；溶血磷脂酸；pHSP27，磷酸化热休克蛋白27；SR，肌浆网；肌球蛋白轻链激酶；GPCR，G蛋白偶联受体；全球环境基金，鸟嘌呤核苷酸交换因子；PPase、蛋白磷酸酶；L（左）_钙，L型钙²⁺频道。

DUSP-5是DUSP基因家族的一员，靶向并导致活化的MAPK、ERK、JNK、10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同系物以及Akt调节因子（PTEN）和P38（有丝分裂原活化蛋白激酶的一种形式）的去磷酸化(33,38)，已知关键信号分子也参与压力或拉伸诱导的肌源性反应(33,38,55). 另一个有趣的基因是ADD-3基因，它与DUSP-5类似，也在脑组织和脑血管中表达（未发表的发现），其功能是促进光谱蛋白-肌动蛋白结合，并通过在质膜上覆盖肌动蛋白丝来控制肌动蛋白聚合速率(35,36)从而能够启动肌源性反应。Adducin函数是Ca²⁺和钙调蛋白依赖，并包含MARCKS结构域(35,36)是一系列激酶磷酸化的靶点，包括PKC、酪氨酸激酶和[Rho]-激酶，或在传递压力或拉伸诱导的肌源性反应中起重要作用的类似分子(13,25,29,30,38,55). 尽管对DUSP-5和ADD-3基因在血管调节中的功能作用知之甚少，但我们必须研究和揭示ADD-3和DUSP-5基因在脑循环中压力诱导的肌源性自身调节的发展和维持中的潜在作用。随着我们对这些基因和与之相关的其他分子的了解越来越多，我们对正常和疾病状态下控制肌源性血流自动调节机制的了解也将增强。

总结

自从贝利斯早期工作以来(三)，我们已经知道血管壁能够适应透壁压力的变化。1984年，Harder(19)阐明了增加血管壁跨壁压力通过降低外向钾离子而导致膜去极化的事实⁺电流和向内钙增加²⁺通过L型Ca的电流²⁺频道。如上所述，许多第二信使可以参与启动信号事件，这些信号事件是调节肌源性张力、通过反馈机制调整直径以保持流量恒定并足以满足神经元代谢需求的核心。这篇综述涵盖了美国生理学会心血管科主办的2009年Wiggers讲座。由于演讲的初步性和专有性，我们没有介绍演讲中的大部分内容。大卫·R·哈德博士非常荣幸能被授予这一殊荣。美国生理学会有着悠久而丰富的历史，已经成为“包括使用所有学科和技术来回答与生物生理功能有关的问题”这一概念的缩影

披露

作者未声明任何利益冲突，无论是财务上的还是其他方面的。

参考文献