公共科学图书馆一号。2012年；7（2）：e31431。
激活转录因子4通过SIRT1表达的反激活实现胃癌细胞的多药耐药表型
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朱洪武
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
夏利民
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
张永国
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
王红红
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
徐文静
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
郝虎
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
王静（音译）
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
景欣
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
易纲
中华人民共和国西安市第四军医大学西京医院消化内科、肿瘤生物学国家重点实验室
苏梅沙
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
徐斌（Bin Xu）
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
戴明风扇
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
聂永战
中华人民共和国西安第四军医大学西京医院消化科和癌症生物学国家重点实验室
吴开春
中华人民共和国西安市第四军医大学西京医院消化内科、肿瘤生物学国家重点实验室
瓦尔·埃尔·里法伊（Wael El-Rifai），编辑器
中华人民共和国西安市第四军医大学西京医院消化内科、肿瘤生物学国家重点实验室
美利坚合众国范德比尔特大学医学中心
#贡献均等。
构思并设计了实验：KW YN DF HZ。执行实验：HZ YZ LX HW WX HH JW JX YG SS BX。分析数据：KW HZ LX。撰写论文：KW HZ LX。
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- 补充资料
图S1：
突变的ATF4结合位点对SIRT1启动子活性的影响。用pCMV-ATF4和野生型SIRT1、SIRT1-MUT1、SIRT1-MUT2或MUT1+MUT2报告子共转染293T细胞，测定其相对荧光素酶活性。模拟pCMV-Taq组的荧光素酶活性指定为1.00。结果是重复进行的三个实验的平均值±S.D.。*，P<0.05。左边是报告基因结构的示意图。右侧的条形图表示每个转染样本中荧光素酶活性的相对水平。（畅通节能法）
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摘要
背景
胃癌的多药耐药（MDR）仍然是临床治疗的主要挑战。激活转录因子4（ATF4）是一种参与体内平衡和细胞保护的应激反应基因。然而，ATF4在胃癌MDR中的表达和功能尚不清楚。在本研究中，我们研究ATF4是否在胃癌MDR中发挥作用及其潜在机制。
方法/主要发现
我们证明，ATF4的过度表达给胃癌细胞带来了多药耐药表型，而敲除多药耐药变异中的ATF4则诱导了再敏感。在这项研究中，我们还发现NAD+-依赖性组蛋白去乙酰化酶SIRT1是ATF4诱导胃癌细胞MDR效应所必需的。我们证明ATF4通过直接结合SIRT1启动子促进胃癌细胞的MDR，导致SIRT1上调。值得注意的是SIRT1公司通过小干扰RNA（siRNA）或特定抑制剂（EX-527）重新引入治疗敏感性。此外，在ATF4过度表达的细胞中发现Bcl-2/Bax比率和MDR1表达水平增加。
结论/意义
我们发现ATF4在胃癌细胞对化疗反应的MDR调节中起着关键作用，这些发现表明靶向ATF4可以缓解胃癌的治疗耐药性。
介绍
多药耐药通常是包括胃癌在内的恶性肿瘤化疗失败的主要原因[1]多药耐药一词通常用于定义耐药表型，即细胞同时对不同药物产生耐药性，但没有明显的结构相似性，并且具有不同的细胞靶点[2]在首次应用于癌症治疗后具有更显著疗效的新药更容易发生MDR。多种药物的临床用途受到天然和获得性肿瘤细胞耐药性的限制，而这种耐药性几乎总是多因素的[3]可能影响药物敏感性的因素包括：加速药物外排、药物激活和失活、药物靶点的改变、DNA甲基化、药物诱导损伤的处理以及逃避凋亡[4].
胃癌对化疗相对不敏感。胃癌细胞的多药耐药机制已经在我们的实验室和其他地方进行了广泛的研究[1],[4],[5]但尚未完全阐明，这表明其他未知分子或途径可能参与MDR的发展。
在哺乳动物细胞中，真核翻译起始因子2α亚基（eIF2α）被不同的eIF2β激酶磷酸化，以响应不同的应激信号，包括缺氧/缺氧、内质网应激、氨基酸剥夺和氧化应激。这种磷酸化事件导致全球蛋白质生物合成迅速减少，同时诱导基因的翻译表达，包括自动变速箱4减轻压力对细胞的损伤[6],[7]虽然ATF4在严重或长期应激条件下可能发挥促凋亡作用，自动变速箱4是一种有效的应激反应基因，被认为在综合应激反应（ISR）中通过调节细胞对不利环境的适应发挥保护作用[8],[9],[10]最近，据报道，ATF4的过度表达在多种肿瘤中表现突出，并可保护肿瘤细胞免受多种应激以及多种癌症治疗药物的影响[11],[12],[13],[14],[15],[16],[17]这种保护作用的潜在机制包括自噬诱导、促进DNA损伤修复和细胞内谷胱甘肽的上调[12],[13],[14],[17]然而，ATF4在胃癌MDR中的表达和功能尚不清楚。
在这项研究中，我们报告了与父母对照细胞相比，ATF4在胃癌细胞的MDR反应中显著上调。击倒自动变速箱4siRNA显著提高MDR细胞对多种化疗药物的敏感性，而SGC7901和AGS细胞中ATF4的上调使其具有多药耐药性。我们还发现ATF4通过上调SIRT1的表达部分促进胃癌MDR。SIRT1抑制可部分逆转ATF4介导的胃癌MDR表型。这些数据表明，靶向ATF4可能为逆转临床胃癌MDR提供一种新的治疗选择。
结果
ATF4调节胃癌细胞的MDR表型
为了确定ATF4是否参与胃癌细胞MDR的发生，采用Western blot和qPCR方法检测了SGC7901细胞系及其MDR变异体SGC7901/VCR和SGC7901-ADR中ATF4的水平().
ATF4调节胃癌细胞的MDR表型。（A） 采用Western blotting和qPCR检测多药耐药胃癌细胞（SGC7901/ADR和SGC7901/VCR）和亲代SGC7902细胞中ATF4的蛋白和mRNA水平。β-actin和GAPDH分别作为内部对照。数据表示三个独立实验的平均值±S.D。（B） 通过集落形成试验检测稳定转染SGC7901和AGS的LV-Vector和LV-ATF4对顺铂的反应。用0或0.25µg/ml顺铂连续处理细胞系14天；每3天更换一次培养基。细胞被镀成三份，实验重复三次。显示了具有代表性的油井。图提供了以未处理细胞百分比表示的平均量化。（C） 用0或0.5µg/ml顺铂连续处理LV-SCR和LV-siATF4稳定转染的SGC7901/ADR和SGC7901/VCR细胞14天；每3天更换一次培养基。（d）和（E）LV-Vector和LV-ATF4稳定转染SGC7901细胞株，LV-SCR和LV-siATF4稳定转基因SGC7901/ADR细胞用指定剂量的不同药物处理72小时。体外MTT法检测药物敏感性。数据代表三个独立实验的平均值±S.D。（F） 和（G）LV-Vector和LV-ATF4稳定转染的SGC7901细胞系、LV-SCR和LV-siATF4稳定转染的SGC 7901/ADR细胞及其各自的未经处理的对应物（NC）在新鲜培养基中生长，并存在指示浓度的顺铂（对于SGC7901-NC、SGC7900-Vector和SGC7901-ATF4，5µG/ml；对于SGC7901/ADR-NC、SGC7901/ADR-SCR和SGC7901-ADR-siATF4，10µg/ml），持续36小时。然后进行Hoechst 33258核染色和DNA片段分析。（H） 将上述SGC7901和SGC7901/ADR稳定转染细胞系在具有指示浓度顺铂的新鲜培养基中再培养6–24小时（对于SGC7901-Vector和SGC79 01-ATF4，10µg/ml；对于SGC79 01/ADR-SCR和SGC7 901/ADR-siATF4来说，20µg/ml）。在指定的时间，收集蛋白质提取物，并对caspase-3（未分离和裂解形式）进行免疫印迹分析。β-actin作为内部对照。
为了研究ATF4过度表达是否足以在胃癌细胞中诱导MDR表型，自动变速箱4表达cDNA稳定转染SGC7901和AGS细胞。首先，使用菌落形成试验测试CDDP敏感性。如集落形成分析的量化结果所示，ATF4过度表达导致集落数量比空载体表达细胞增加近3倍(). MTT分析也表明IC50与空载体转染细胞相比，SGC7901-ATF4的ADR、VCR、CDDP和5-FU值显著增加().
由于多药耐药胃癌细胞中ATF4水平升高，我们进一步想确定靶向ATF4是否能使多药耐药细胞系重新敏感。击倒自动变速箱4与CDDP联合使用时，SGC7901/ADR和SGC7901/VCR细胞中的siRNA导致细胞数量减少2至3倍(). 中的数据也表明下调自动变速箱4显著逆转SGC7901/ADR细胞对化疗的耐药性。
由于凋亡抑制是多药耐药的重要机制之一，我们还研究了转染特异性DNA的SGC7901/ADR细胞的能力自动变速箱4通过Hoechst染色和DNA片段分析，siRNA经历CDDP诱导的凋亡。通过Hoechst核染色评估，用指定浓度的CDDP处理SGC7901-ATF4和SGC7901/ADR-SCR细胞36小时后未诱导任何凋亡()和DNA片段分析(). 相反，SGC7901 Vector和SGC7901/ADR-siATF4细胞显示出显著的凋亡，更频繁地出现浓缩和碎裂的细胞核以及DNA梯状形成。此外，与SGC7901-ATF4和SGC7901/ADR-SCR细胞相比，CDDP处理后SGC7901载体和SGC79 01/ADR-siATF4细胞中的procaspase-3裂解更明显().
综上所述，这些结果表明ATF4赋予胃癌细胞MDR表型，靶向ATF4提供了一种使耐药细胞对化学治疗敏感的方法。
ATF4上调胃癌细胞中SIRT1、MDR1、Bcl-2和Bax的表达
先前的研究报告称，过表达SIRT1的细胞通过多种机制降低了对化疗的敏感性[18],[19],[20],[21]。我们很想确定SIRT1公司是一个对多药耐药发展至关重要的应激相关基因，可能是ATF4的下游靶点，负责介导ATF4诱导的胃癌细胞多药耐药。
用qPCR和Western blot检测LV-Vector和LV-ATF4稳定转染SGC7901细胞中SIRT1的水平。ATF4的过度表达与SIRT1在两种转录水平的表达增加相关(，左）和平移级别(，左）。相反，siRNA敲除自动变速箱4SGC7901/ADR细胞中内源性SIRT1公司表达式(，右侧）。这些结果表明ATF4上调SIRT1公司胃癌细胞中的表达。
ATF4上调胃癌细胞中SIRT1的表达。（A） 对LV-Vector和LV-ATF4稳定转染的SGC7901细胞株（左）和LV-SCR和LV-siATF4稳定转染的SGC 7901/ADR细胞（右）的SIRT1 mRNA水平进行qPCR。GAPDH被用作内部控制。数据表示三个独立实验的平均值±S.D。（B） 用所示抗体对A段细胞及其相应的未处理对应物（NC）的细胞裂解液进行印迹。β-actin作为内部对照。
为了进一步研究ATF4相关胃癌多药耐药的分子机制，我们还检测了上述胃癌细胞中MDR1、MRP、Bcl-2和Bax的表达水平。如所示与对照细胞相比，ATF4阳性细胞表达更多MDR1。同时，这些细胞株中的MRP表达没有明显差异。有趣的是，与对照细胞系相比，ATF4产生细胞中的Bcl-2和Bax表达水平均上调，而Bax的表达仅显示轻微变化，这表明上调Bcl-2/Bax比率可能会抑制ATF4过度表达胃癌细胞中药物诱导的凋亡。
这些结果表明，ATF4通过多种机制促进胃癌细胞的多药耐药能力。
ATF4反式激活SIRT1启动子活性并直接与SIRT1基因启动子结合
确定ATF4是否介导SIRT1公司基因转录，293T细胞联合转染1.2kbSIRT1公司启动子报告质粒与自动变速箱4表达质粒。荧光素酶报告分析显示SIRT1公司ATF4以剂量依赖的方式显著激活启动子活性().
ATF4通过绑定到SIRT1公司发起人。（A） 293T细胞联合转染1.2 kbSIRT1公司启动子报告质粒和自动变速箱4表达质粒。48小时后，使用荧光素酶报告试验检测SIRT1公司启动子活性。数据表示三个独立实验的平均值±S.D。（B） 人类SIRT1基因启动子的示意图，显示了用于ChIP分析的RT-PCR引物的位置。（C） ChIP分析用于检测ATF4与SIRT1公司发起人。使用抗ATF4抗体对SGC7901-ATF4细胞进行ChIP处理。A1代表假定的远端结合位点，A2代表假定的近端结合位点。ASNS启动子引物作为阳性对照，GAPDH引物作为阴性对照。
为了深入了解SIRT1公司诱导，我们检测了ATF4可能的诱导途径。通过分析5′侧翼序列SIRT1公司利用生物信息学软件（Tfsitescan服务、TESS和Genomatix），在该基因的−950至−600 bp区域内鉴定出两个ATF4推定结合位点SIRT1公司发起人().
确定是否SIRT1公司是ATF4的直接靶点，使用SGC7901-ATF4细胞的带有ATF4抗体的ChIP显示在SIRT1公司启动子区域，表明RNA和随后的蛋白质水平增加SIRT1公司在表达ATF4的细胞系中，可能是由于ATF4与SIRT1公司基因启动子().
为了研究这两个ATF4结合位点在调节SIRT1反式激活中的作用，我们使用定点突变来突变这些位点。荧光素酶报告子分析表明，突变结合位点1或结合位点2都会降低ATF4诱导的SIRT1启动子活性。此外，这两个结合位点的突变消除了SIRT1启动子的活性。这些结果表明，这两个ATF4结合位点都参与了SIRT1启动子的反式激活(图S1).
综上所述，这些结果表明SIRT1是ATF4的直接转录靶点。
SIRT1公司siRNA抑制部分逆转ATF4过度表达胃癌细胞的MDR表型
ATF4介导的识别SIRT1公司胃癌细胞表达水平的增加促使我们分析了该途径在胃癌多药耐药中的作用在体外ATF4稳定转染胃癌细胞后的药物敏感性SIRT1公司通过菌落形成和MTT分析得到的siRNA或干扰siRNA。击倒SIRT1公司与CDDP联合使用时，SGC7901-ATF4细胞中的siRNA导致菌落数减少>40%(，上部）。在AGS-ATF4细胞中也观察到这种作用(，下部）。此外，MTT分析的数据也表明SIRT1公司可以使SGC7901-ATF4细胞对化学药物重新敏感，但这在干扰siRNA转染的细胞中没有发生().
siRNA抑制SIRT1抑制ATF4诱导的胃癌MDR表型。（A） 用干扰siRNA（SCR）或SIRT1 siRNA（siSIRT1）转染SGC7901-ATF4和AGS-ATF4细胞。72小时后，用0或0.25µg/ml顺铂连续处理细胞系14天；每3天更换一次培养基。细胞被镀成三份，实验重复三次。显示了具有代表性的油井。图提供了以未处理细胞百分比表示的平均量化。通过Western blot检测插入的相对SIRT1蛋白表达。（B） 用干扰siRNA（SCR）或SIRT1 siRNA（siSIRT1）转染SGC7901-ATF4细胞。72小时后，将两种细胞系分别用指定剂量的不同药物治疗72小时。体外MTT法检测药物敏感性。数据表示三个独立实验的平均值±S.D。
为了确定SIRT1是否保护细胞免受CDDP诱导的凋亡，将SGC7901-ATF4细胞转染SIRT1公司用CDDP处理siRNA或打乱的siRNA，并用Annexin V和PI标记。Annexin V标记鉴定凋亡细胞。SIRT1 siRNA转染的SGC7901-ATF4细胞的凋亡率显著高于对照细胞(72.8%对25.9%）。与对照细胞相比，SIRT1 siRNA转染细胞中浓缩和碎片细胞核的出现也增加(). 此外，在SIRT1 siRNA转染的SGC7901-ATF4细胞中，早在用10µg/ml CDDP处理后12小时就观察到原蛋白酶-3的切割，但在混乱的siRNA处理的细胞中，即使在CDDP处理24小时后也没有观察到(). 这些结果表明SIRT1过度表达抑制CDDP诱导的凋亡。
siRNA下调SIRT1对细胞凋亡和MDR相关分子的影响。（A） 用干扰siRNA（SCR）或SIRT1 siRNA（siSIRT1）转染SGC7901-ATF4细胞。72小时后，将细胞在新鲜培养基中以5µg/ml的浓度在无或有顺铂的情况下再培养36小时。药物治疗后，用Annexin V和PI标记细胞。FACS分析确定活细胞和凋亡细胞的分布模式。（B） 以同样的方法转染A段SGC7901-ATF4细胞，然后用5µg/ml顺铂处理36 h，然后进行Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞。（C） 在A段以相同的方式转染SGC7901-ATF4细胞，并在含有10µg/ml顺铂的新鲜培养基中再培养6–24小时。在指定的时间，收集蛋白质提取物，并对caspase-3（未分离和裂解形式）进行免疫印迹分析。β-actin作为内部对照。（D） 在A段以相同方式转染SGC7901-ATF4细胞。72小时后，用所示抗体印迹细胞裂解物。β-actin作为内部对照。
为了研究siRNA下调SIRT1对MDR相关分子的影响，我们检测了转染SIRT1 siRNA或干扰siRNA后SGC7901-ATF4细胞中MDR1、MRP、Bcl-2和Bax的表达水平()与对照细胞相比。相反，MRP、Bcl-2和Bax的表达水平在样本之间没有明显差异。
这些观察结果表明，SIRT1介导ATF4诱导的胃癌细胞MDR效应。
抑制SIRT1活性使ATF4转染细胞对DNA损伤剂重新敏感
为了证明SIRT1催化活性也与ATF4诱导的MDR有关，SGC7901-ATF4细胞用EX-527进行预处理，EX-527是一种新型、有效且特异的SIRT1小分子抑制剂，然后用不同的化学药物进行治疗。首先，我们测定了EX-527在LV-Vector和LV-ATF4稳定转染的SGC7901细胞中的基本细胞毒性。MTT分析显示，浓度高达10µM的EX-527没有抑制，而是略微增加了两种细胞系的活力(). 接下来，我们检测了在上述使用的胃癌细胞中加入或不加入指定剂量的EX-527培养24小时后SIRT1、ATF4、MDR1、MRP、Bcl-2和Bax的表达水平。只有MDR1的表达被EX-527以浓度依赖的方式下调(). 然后我们用载体或EX-527（0.5、1、2、4和10µM）预培养SGC7901-ATF4细胞24小时，然后监测CDDP和5-FU介导的细胞死亡。如所示，EX-527以剂量依赖的方式显著增强了这两种药物的细胞毒性。我们还确定了EX-527对不同剂量的CDDP和5-FU介导的SGC7901-ATF4细胞增殖抑制的可能协同作用。如预期，10µM EX-527足以增强两种药物的细胞毒性().
抑制SIRT1活性可在ATF4过度表达细胞系中重新引入敏感性。（A） 将LV-Vector和LV-ATF4稳定转染的SGC7901细胞系与指定剂量的EX-527孵育。96小时后，用MTT法测定细胞活力。（B） 将A段中稳定转染的SGC7901细胞系与或不与EX-527（1–10µM）孵育24 h，并用所示抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹。β-actin作为内部对照。（C） 将SGC7901-ATF4细胞与指示剂量的EX-527预孵育24小时。然后将SGC79 01-Vector和SGC7901-ATF4细胞暴露于顺铂（1µg/ml）或5-氟尿嘧啶（1.25µg/ml）下额外72小时。通过MTT分析测定细胞活率。（D） 将SGC7901-ATF4细胞与或不与EX-527（10µM）预孵育24 h。然后，将细胞暴露于指示剂量的顺铂或5-氟尿嘧啶下额外72 h。通过MTT分析测定细胞活性。所有数据均表示三个独立实验的平均值±S.D。图提供了以未处理细胞百分比表示的平均量化。
这些结果表明，SIRT1活性在ATF4诱导的胃癌MDR中也起着关键作用，该作用可能部分通过MDR1表达介导。
讨论
MDR对许多人类恶性肿瘤的有效化疗提出了重大的临床挑战。细胞获得耐药性的机制是多方面和复杂的，因此对其进行更广泛的了解，以及确定新的耐药机制，将特别有助于提供更好的治疗选择。这项研究是第一份报告，高水平的ATF4通常出现在应激环境下的肿瘤细胞中，使胃癌细胞具有MDR表型，并且它确定这种影响部分由SIRT1表达的反式激活介导。
自动变速箱4和SIRT1公司是进化上保守的应激反应基因，参与广泛的生物过程，其中许多对体内平衡和细胞保护有益[22],[23],[24]这两个基因都是在各种应激反应中诱导的，包括缺氧、氧化应激、DNA损伤、营养缺乏和化学毒性应激。列文森VV等。首次报道ATF4表达的变化可能在对不同类别DNA靶向药物的多效性耐药性中发挥作用[16]近年来，一些研究发现ATF4通过自噬、谷胱甘肽依赖性氧化还原系统和DNA损伤修复直接或间接参与了耐药性的形成[11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[25],[26]在这里，我们表明ATF4的保护能力确实在化疗反应中介导了ATF4过度表达胃癌细胞系中的MDR表型。我们的研究结果清楚地表明，ATF4在胃癌细胞中的过度表达与更大的耐药性相关，而ATF4的敲除则诱导了再敏。这些数据表明，ATF4可能是多种机制引起的耐药性的重要下游介体，因此是一个有价值的治疗靶点。然而，作为ISR最重要的转录介质之一，ATF4可激活多种促进体内平衡恢复的靶基因，也可通过其他机制介导耐药性。在我们的研究中，发现与载体转染细胞相比，ATF4过度表达细胞中SIRT1上调。相反，击倒自动变速箱4ATF4特异性siRNA导致MDR胃癌细胞SIRT1下调。我们的结果表明SIRT1可能是ATF4诱导的胃癌MDR的下游介体。
作为碱性区亮氨酸拉链（bZIP）转录因子的ATF亚家族成员[22]ATF4有可能通过ATF或cAMP反应元件（CRE）结合位点作为转录激活物或转录阻遏物[22]ATF的共识结合位点被定义为TGACGT（C/A）（G/A）[27]，这是一个与CRE共识元素（TGACGTCA）相同的序列[28]此外，大多数CRE中高度保守的核心基序–ACGT[29]可以结合不同的bZIP因子，这取决于核心基序的侧翼基序[22],[30],[31]。在我们的研究中，在1.2 kb中发现了两个假定的ATF-CRE结合位点SIRT1公司启动子区，ATF4直接激活SIRT1公司通过与两种结合元件结合来转录。然而，这两个结合位点如何在详细的应激环境下发挥作用仍然未知，需要进一步研究。
哺乳动物SIRT1公司是酵母最接近的同源物沉默信息调控因子2以及研究最广泛的SIRT家族成员。它与决定寿命的细胞过程的调节密切相关，包括抗凋亡、神经元保护和细胞衰老或衰老[32]最近，越来越多的研究表明SIRT1的表达增加与化疗和电离辐射的耐药性有关[18],[19],[20],[33],[34],[35],[36]例如，与药敏细胞系相比，SIRT1在耐药神经母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌细胞系中过度表达。SIRT1的所有这些耐药作用可能是由于其抗凋亡作用[37],[38]抑癌基因的沉默[39]最后，我们可以预测，如果SIRT1参与ATF4诱导的MDR，那么抑制SIRT1应该会影响ATF4过度表达细胞对化疗的敏感性。正如预期的那样，siRNA和SIRT1的药理抑制都可以使ATF4过表达细胞对化学药物重新敏感。此外，我们的研究表明，SIRT1部分通过抗凋亡作用保护细胞免受死亡。
据报道，MDR1在SIRT1表达增加的细胞中上调[18],[36]在这项研究中，我们还证明MDR1在ATF4过表达细胞中上调，用SIRT1特异性siRNA敲低SIRT1或用EX-527抑制其活性可能导致MDR1下调，这与SIRT1的耐药性作用一致。然而，在ATF4过度表达细胞中上调的Bcl-2/Bax比率是SIRT1非依赖性的，这表明SIRT1独立机制也在ATF4-诱导的胃癌细胞MDR中发挥作用。
总之，我们证明ATF4赋予胃癌细胞MDR表型，这种效应部分由SIRT1过度表达的反式激活介导。此外，ATF4是耐药胃肿瘤的有效靶点，未来应考虑开发有效的ATF4抑制剂。这些发现为ATF4在控制SIRT1表达中的作用及其在肿瘤发生和化疗中的抗应激特性提供了新的见解。这对于临床考虑尤其重要，因为ATF4可以通过缺氧、氧化应激、营养剥夺和肿瘤微环境中几乎所有的不利应激源上调，而肿瘤微环境可能被癌细胞劫持，以逃避化疗引起的增殖抑制和细胞死亡。因此，以干扰肿瘤细胞中应激诱导的ATF4表达为基础的干预措施可能有效地规避或逆转胃癌的耐药性。
材料和方法
详细方法请参见文本S1.
细胞培养和试剂
人胃腺癌细胞系SGC7901（取自中国北京军事医学科学院）和MDR变异体SGC7901/ADR和SGC7901-VCR（在本实验室建立和维护）以及AGS（取自中科院细胞库，中国上海）在添加10%胎牛血清（Hyclone）和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养。293T细胞（也取自中科院细胞库）在添加10%胎牛血清的DMEM中培养。为了保持MDR表型，分别将阿霉素（最终浓度为0.5µg/ml）和长春新碱（最终浓度1µg/ml）添加到SGC7901/ADR和SGC7901-VCR细胞的培养基中。EX-527（Sigma）在DMSO中以指定浓度溶解。将阿霉素（ADR）、长春新碱（VCR）、顺铂（CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）溶解在指定浓度的生理盐水中。
细胞转染和稳定细胞系
人类自动变速箱4表达质粒（pCMV5-ATF4）由Amy S.Lee教授提供[25].编码特定于自动变速箱4使用PLKO.1-TRC（Addgene）生成对照siRNA，并分别指定为LV-siATF4和LV-SCR对照。在FUW-teto（Addgene）中构建了编码人类ATF4基因的慢病毒载体，命名为LV-ATF4。空载体被用作阴性对照，指定为LV-vector。通过转染指示的慢病毒构建物，然后分别在嘌呤霉素或促癌素（Invitrogen）中进行选择，生成稳定的细胞系。使用标准程序进行细胞转染和稳定细胞系的生成。siRNA结构的序列可以在文本S1.
免疫印迹法
使用标准程序收集蛋白质提取物并进行免疫印迹分析。抗体来源请参见文本S1.
膜联蛋白V染色和FACS分析
采用标准程序进行Annexin V染色和FACS分析。PI和Annexin V染色均为阴性的细胞被归类为活细胞，仅AnnexinV染色阳性的细胞被分类为早期凋亡细胞，PI阳性和Annessin V阳性的细胞是处于晚期凋亡的细胞。
DNA片段分析
根据制造商的协议，使用DNA梯形提取试剂盒（C0008，Beyotime公司，中国北京）提取DNA片段。DNA片段在含有0.1µg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离。
赫斯特染色
根据制造商的方案（C0003，Beyotime Co.）进行Hoechst染色。用DP70反转免疫荧光显微镜（Olympus）观察细胞。细胞核浓缩且碎裂的细胞被判定为凋亡细胞。
体外药物敏感性试验
ADR、VCR、CDDP和5-FU均在每次实验前新鲜制备。根据标准方案，使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定法测量药物敏感性(文本S1).
定量实时PCR（qPCR）
使用LightCycler 480 II系统（Roche）和SYBR Green检测（TaKaRa）进行定量实时PCR。引物序列见文本S1.
染色质免疫沉淀（ChIP）分析
ChIP分析是根据制造商的方案（P2078，Beyotime Co.）进行的，略有修改。对染色质溶液进行声波处理，并与抗ATF4抗体或对照IgG孵育，然后在4°C下旋转过夜。DNA-蛋白质交联被逆转，染色质DNA被纯化并进行PCR分析。引物5′-ACC CCT CGT TTT ACA TCT-3′和5′-TTTT GGA GTC CTT CCT TTC-3′被用来放大SIRT1公司远端启动子序列（A1，核苷酸−974至−843）和引物5′-ACC CAA CAA ACC CAT TCT-3′和5′-CCT CCT GGG AAG ACC TTT-3′被用来放大SIRT1公司近端启动子序列（A2，核苷酸−781至−647）。的引物GAPDH公司,5′-TAC标签CGG TTT TAC GGG CG-3′和5′-TCG AAC AGG AGG AGC AGG GAG CGA-3′，用作阴性对照。作为ATF4-DNA相互作用的阳性对照，引物5′-TGG TTG GTC CTC GCA GGC AT-3′和5′-CGC TTA TAC CGA CCT GGC TCC T-3′，设计用于扩增天冬酰胺合成酶(ASNS公司)启动子区域，包含至少两个据报告与ATF4结合的位点[41]也使用了。扩增后，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上解析，并通过溴化乙锭染色进行可视化。
报告基因检测
1.2 kb人类SIRT1公司合成了启动子序列（−1100到+100 bp），并克隆到pGL3-Basic载体的XhoI和HindIII位点。DNA测序证实了所得到的结构。然后将293T细胞与SIRT1公司启动子报告质粒、pRL-TK质粒（美国Promega）和pCMV5-ATF4质粒（使用Lipofectamine 2000（Invitrogen））。转染48小时后，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞三次。然后，在100µl被动溶解缓冲液（Promega）中溶解细胞，并摇晃15分钟。萤火虫萤光素酶和雷尼拉萤光素酶活性使用具有Varioskan Flash微孔板读取器（Thermo Scientific）的双萤光素酶报告物测定系统（Promega）进行测量。“相对活性”被定义为萤火虫荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性的比值，并通过将萤火虫萤光素酶测定获得的发光强度除以Renilla-荧光素素酶的发光强度来计算。所有测量均一式三份，并在293个T细胞中重复三次。
统计分析
每个实验至少重复三次。所有数据均以平均值±标准差表示。用Student t检验分析平均值之间的差异。所有统计分析均使用SPSS16.0软件（伊利诺伊州芝加哥）进行。显著性设置为5%。
支持信息
图S1
突变的ATF4结合位点对SIRT1启动子活性的影响。用pCMV-ATF4和野生型SIRT1、SIRT1-MUT1、SIRT1-MUT2或MUT1+MUT2报告子共转染293T细胞，测定其相对荧光素酶活性。模拟pCMV-Taq组的荧光素酶活性指定为1.00。结果是重复进行的三个实验的平均值±S.D.。*，P<0.05。左边是报告基因结构的示意图。右侧的条形图表示每个转染样本中荧光素酶活性的相对水平。
（畅通节能法）
致谢
我们感谢Amy S.Lee教授为我们提供pCMV5-ATF4质粒。我们还感谢乔泰东先生和郑晨女士的出色技术援助。
脚注
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
基金：本研究得到了国家自然科学基金（NO.81090270、NO.81090273、NO.81000864）、中国博士后科学基金（NO.20100471776）、国家重点基础研究发展计划（NO.2010CB529302）、，国家市政科技项目（2009ZX09103-667和2009ZX0.9301-009-RC06）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
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