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细胞技术。2012年3月；64(2): 187–195.
2011年11月22日在线发布。 数字对象标识：2007年10月10日/10616-011-9407-0
预防性维修识别码：项目经理3279583
PMID：22105762

一种快速分离功能性原代小鼠肝细胞的两步法：细胞特征和基于去唾液酸糖蛋白受体的分析

玛丽亚诺·塞弗格尼尼,通讯作者 詹妮弗·谢尔曼, 阿尔菲卡·塞格尔, Narayananair K.贾亚普拉卡什, 贾斯汀·奥宾, 王刚（Gang Wang）, 张立刚, 张国鹏, 克里斯蒂娜·尤丘斯, 金伯乐,和凯文·菲茨杰拉德
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

原代小鼠肝细胞是生物医学研究领域中评估肝细胞功能的重要工具。几种肝细胞分离方法已经发表；然而，其中许多方法需要大量处理，因此可能会损害分离细胞的活性和功能。由于利用新分离的细胞的一个优点是维持一个细胞与体内状态更具可比性的环境，因此重要的是要有稳健的方法来生产高活性、高纯度的细胞，并且其功能与体内状态相似。在这里，我们描述了一种改进的两步方法，用于快速分离和表征小鼠原代肝细胞，从而获得高产量的活细胞。去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是肝细胞上最丰富的细胞表面受体之一，通过使用新开发的基于流式细胞术的配体受体结合分析显示其配体的特异性结合来监测分离肝细胞的功能。此外，利用最短培养时间的新鲜分离肝细胞成功开发了siRNA候选药物的体外筛选方法。

关键词：肝细胞，两步分离法，去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），GalNAc

引言

肝细胞参与许多生物过程，包括蛋白质合成、糖代谢、解毒以及胆固醇、胆汁酸和磷脂的合成和分泌等。由于其在肝功能中的核心作用，使用新分离的原代肝细胞已成为研究肝脏生物学各个方面的重要工具，包括代谢疾病、毒理学、肿瘤学和寄生虫学（Goncalves等人。2007; Qian等人。2007; Wallace等人。2010; 华纳等人。2003; Wu等人。2002). 多年来，使用标准的两步灌注方法分离的肝细胞已用于培养以及细胞悬浮液测定（Klaunig等人。1981; Li等人。2010; 华纳等人。2003). 在这些离体测定中，细胞在分离后立即使用，以避免基因调节、极化和去分化的变化（Bhandari等人。2001; Godoy等人。2010; Talamini等人。1997; Wallace等人。2010). 当前方案的主要缺点是需要通过梯度离心进行细胞纯化，这延长了细胞操作的时间，并可能导致细胞数量和存活率降低。在这里，我们描述了一种分离方法，该方法无需梯度离心纯化步骤，并可获得高产量的活细胞，这些活细胞可通过高度表达的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的活性保持其功能。

肝C型凝集素无唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是一个公认的肝细胞特异性药物传递的靶点。ASGPR在肝细胞上高水平表达（约500000拷贝/细胞），并在通过受体介导的内吞作用清除血清中去乙酰化糖蛋白中发挥重要作用（Braun等人。1996; Ishibashi等人。1994：Mu等人。1993). ASGPR对末端β-连接半乳糖（Gal）或N个-乙酰半乳糖胺（GalNAc）残基及其配体的结合导致快速内化（Ashwell和Harford1982; Park等人。2005; 间谍1990). GalNAc配体与ASGPR的结合亲和力取决于具有四触角（GalNAc-4)表现出较高的亲和力，随后是三天线天线（GalNAc三)和双天线（GalNAc2)配体。在原代肝细胞中观察到了这种配体-受体结合特征，但在将分离的受体用于基于细胞的分析时没有观察到（Connolly等人。1982; Rensen等人。2001). 在使用本文描述的隔离协议之后，我们证明ASGPR是存在的、活动的和功能的。

下文描述了分离小鼠肝细胞的快速两步灌注法、使用商用培养基添加剂的培养技术、GalNAc化合物的体外结合分析以及筛选siRNA-GalNAc结合物的高通量系统。小鼠肝细胞分离方案也适用于大鼠肝细胞分离，流速和灌注时间变化最小，结果与小鼠原代肝细胞相似（结果未显示）。

材料和方法

设备

40°C水浴、22G喂食针圆形尖端（Fine Science Tools）、单丝尼龙（缝线）、75μm细胞过滤器（Millipore）、手术器械、加热手术台（Harvard Apparatus）、灯、泵（Watson Marlow Sci-Q 401U/D Series）、50 mL锥形管（Corning）、注射器、血细胞仪和台盼蓝（Sigma Aldrich）。

肝细胞分离和培养试剂

解决方案1：汉克平衡盐溶液（HBSS，Gibco），EDTA 0.5 mM，pH=8。解决方案2：Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，Gibco），I型胶原酶0.8 mg/mL（沃辛顿生化集团）。解决方案3：Dulbecco改良鹰式中号。氯胺酮和二甲苯、牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich）、肝细胞板/解冻和维护培养基（Gibco）、鼠尾胶原蛋白（Sigma-Aldrich）和组织培养板（Falcon）。

隔离程序

  1. 使用8-10周龄的C57/Bl6雌性。
  2. 所有溶液都是新鲜制备的（就在隔离之前）。
  3. 将溶液1和溶液2预热至40°C，设置管道和灌注泵。
  4. 将手术台设置为40°C。
  5. 通过将氯胺酮（80 mg/kg）和二甲苯嗪（5 mg/kg）的混合物注入200μL生理盐水中，对动物进行麻醉。
  6. 准备动物进行手术（使用70%乙醇清洁/消毒）。
  7. 用胶带固定动物。解剖腹腔，将胃系统向右移动，露出内脏腔静脉。取出胸腔，注意不要破裂任何血管。
  8. 当心脏仍在跳动时，将导管（22G喂食针/圆形尖端，连接到溶液1）通过右心房插入腔静脉。通过应用手术结将导管固定到位（以稳定导管，防止血管破裂/穿刺）。
  9. 开始灌注，当血流开始，缓冲液到达肝脏时，在内脏腔静脉上切一个小切口。流速应为5 mL/min。
  10. 如果正确插入，所有血液将在1-2分钟内排出。用手指堵住内脏腔静脉（每2分钟一次）几秒钟（肝脏应该膨胀），以产生背压。灌注5-7分钟。
  11. 将灯放在动物上方几英寸处，以帮助将腹腔保持在约37°C。在整个过程中，继续监测腹腔温度。不要过热。
  12. 将导管从溶液1切换到溶液2，并继续灌注7–8分钟（流速5 mL/min）。
  13. 将肝脏（切断门静脉和结缔组织并与身体分离）收集到含有15 mL溶液2的试管中。
  14. 切开肝囊以释放肝细胞。
  15. 添加35 mL溶液3，并将肝悬浮液通过细胞滤网（使用抹刀轻轻搅拌滤网上的组织）。
  16. 在50 g下旋转细胞1分钟。
  17. 用溶液3清洗颗粒两次（45 g，1分钟）。最后一次清洗后，上清液应清晰可见。
  18. 用血细胞仪计数细胞，根据台盼蓝染色计算存活率，并以100万个细胞/mL的速度在DMEM/2%BSA中重新悬浮颗粒细胞。再次以50 g的速度旋转，并将细胞重新悬浮在平板培养基中进行细胞培养。

肝细胞纯度评估

在含有10μL 20 mg/mL蛋白酶K（Ambion）的1 mL组织和细胞溶解液（Epicenter）中溶解约100000个细胞。将裂解液在65°C的摇床中培养1.5小时，并以10000 RPM的转速旋转5分钟。捕获板是根据Affymetrix的分支DNA（bDNA）协议装载的转甲状腺素(TTR公司),胶原蛋白IaI,CD45型,第2级和GAPDH公司（负荷控制）用于定量mRNA水平。细胞也通过流式细胞仪（BD LSRII、BDFACSDiva Software、BD Bioscience）进行检测，其中肝细胞和非肝细胞根据细胞大小使用正向散射（FSC）和侧向散射（SSC）进行分离。使用FlowJo软件（Tree Star，Inc.）分析数据。

肝细胞培养和显微镜检查

细胞培养板在细胞培养前24小时涂上0.1%的鼠尾胶原（Sigma）。分离后，测定细胞数量和活力。根据平板尺寸（见表1详细信息）。轻轻播种细胞，并在37°C、5%CO的组织培养箱中培养2在4.5–5小时后，用DPBS清洗细胞一次，并向每个孔中添加适当体积的维护介质（见表1详细信息）。使用Axiovert 40 CFL（蔡司）显微镜拍摄相控照片。

表1

按表面积计算的肝细胞培养体积和细胞数（平板型）

板材类型涂层体积（μL）细胞数/孔介质体积（μL）
96口井5012,000100
24口井25040,000500
12口井500100,0001,000
6口井1,000330,0002,000

新鲜分离小鼠肝细胞的胶原蛋白体积（平板预涂层）、细胞密度和组织培养基体积

ASGR1标准-2和CYP2A13在培养中的调节

肝细胞mRNA水平ASGR1标准和ASGR2标准（来自Affymetrix的小鼠特异性探针）在培养5、24、48、72和96小时后通过bDNA进行测量。利用特异性抗体进行Western blot分析以估计CYP2A13和ASGPR1（Abcam）水平。β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）用作负荷控制。使用Odyssey系统（Li-cor）扫描蛋白质印迹。

流式细胞术检测生物素-GalNAc结合

将肝细胞在4°C、密度为200000个细胞/管/1 mL培养基（DMEM/2%BSA）的Stripwell微孔板（Corning）中匀化。将生物素GalNAc添加到细胞中，最终浓度为30、15、7.5、3.8、1.9和0.9 nM，并在设定为150 rpm的轨道振荡器中在4°C下孵育2小时。细胞在50 g/4°C下离心2分钟。去除750μL上清液，并用750μL冷DPBS/2%BSA洗涤。重复洗涤步骤两次。第二次清洗后，以1:200的稀释度添加750μL DMEM/2%BSA，其中含有链霉亲和素Alexa647（Invitrogen）。细胞在4°C下培养20分钟并清洗一次。将肝细胞重新悬浮在250μL冷DPBS/2%BSA中。将细胞放在冰上，直到流式细胞仪测量中值荧光强度（MFI）。数据通过FlowJo软件（Tree Star，Inc）和PRISM 4.0软件（GraphPad）进行分析。

GalNAc-siRNA结合物的体外活性

双或三天线GalNAc配体与靶向小干扰RNA双工体结合载脂蛋白B生成（siApoB）以测试体外沉默载脂蛋白B原代小鼠肝细胞中的mRNA。如本文前面所述，将小鼠肝细胞电镀在含有GalNAc-siApoB偶联物的96孔板中。siRNA-结合物的最终浓度为5、0.83、0.14、0.02、0.003、0.0006和0.0001μM，细胞密度为12000个细胞/孔/100μL培养基。培养4小时后，用PBS清洗细胞一次，并根据Affymetrix的bDNA协议进行裂解载脂蛋白B（ApoB）和GAPDH公司检测mRNA水平。

结果和讨论

分离后的细胞数量、活力和纯度

通过本文所述的方法分离肝细胞具有高度的重复性，如台盼蓝排斥试验（n≥120次分离）计算的，每只小鼠平均产生1800万至2000万个细胞，细胞存活率在93%至96%之间。为了评估细胞纯度，使用分支DNA（bDNA）方法检测肝细胞和非肝细胞的遗传标记的mRNA水平。图1a显示三种非肝细胞遗传标记的mRNA水平，CD45型（免疫细胞标记物），胶原蛋白IaI（星状细胞标记）和第2级（内皮细胞标记物）远低于肝细胞特异性基因Transthyretin(TTR）（分别为1.6%CD45、5.7%胶原蛋白IaI和5.7%Tie2）。这些结果表明，与其他细胞类型相比，使用这种流线型分离方案可以获得≥80%肝细胞的浓缩细胞悬浮液。通过使用流式细胞仪根据细胞大小分离细胞，其中约20%的细胞为非肝细胞，80%的细胞为肝细胞，通过单独分析确定了类似的纯度（图1b） ●●●●。

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一肝常驻细胞不同细胞标记物的mRNA水平。透明质酸(TTR公司),CD45型,胶原蛋白IaI和第2级通过分支DNA法（bDNA）测量新鲜分离的肝细胞中的mRNA水平。非肝细胞标记物相对于看家基因GAPDH的mRNA百分比为1.6%CD45型，5.7%胶原蛋白IaI和5.7%第2级.误差线表示标准偏差。b条流式细胞术测定肝细胞数量。前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）用于根据细胞大小分离肝细胞和非肝细胞。这个圆点图显示的是活细胞群的门控

肝细胞培养与细胞变化

根据经验确定合适的细胞密度和培养基条件，以在24小时后实现约85%的融合培养。表1总结了各种板配置的这些条件。重要的是不要以非常高的密度播种肝细胞，因为在高细胞密度下（通常在培养中最早5小时观察到），附着和随后的活力都会迅速降低。同样重要的是，在电镀后至少4小时内保持培养板不受干扰，以允许适当的细胞粘附。图2显示肝细胞早在培养5小时时就处于培养中，并持续到120小时。如相差显微镜所示，培养中肝细胞的形态随时间变化，与记录的形态变化一致（Bhandari等人。2001; Godoy等人。2010; Li等人。2010; Talamini等人。1997：Wallace等人。2010). 这些细胞变化包括细胞极化、去分化以及基因表达下调（Bhandari等人。2001; Godoy等人。2010; Li等人。2010; Talamini等人。1997：Wallace等人。2010). 与文献一致，两种广为人知的肝细胞标志物的变化，ASGR公司和细胞色素P450家族成员CYP2A13，在培养过程中观察到。图三mRNA表达水平下降约50%ASGR1标准和ASGR2标准早在细胞板形成后5小时，培养物中ASGPR蛋白水平随之下降48小时（图4). 早在电镀后24小时，CYP2A13蛋白也观察到类似的减少（图5). 这些数据与先前的研究一致，该研究表明培养的肝细胞在基因表达调控方面表现出快速变化。在使用培养的肝细胞进行体外分析时，需要记住这些细胞变化。

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电镀后肝细胞形态。在电镀后5、24、48、72、96和120小时拍摄的电镀小鼠肝细胞的典型相控显微镜照片（40倍放大）。比例尺代表35μm

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ASGR1标准-2镀膜肝细胞的mRNA下调。ASGR1和ASGR2使用分支DNA方法和小鼠ASGR1和ASGR2特异探针，相对于看家基因GAPDH定量mRNA水平。在细胞板形成后5、24、48、72和96小时收集细胞裂解物，并与新鲜分离肝细胞产生的裂解物进行比较。误差线表示标准偏差

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培养肝细胞中去唾液酸糖蛋白受体（ASGR1）主要亚单位的蛋白质水平。Western blot显示24、48、72、96、120、144和168小时后收集的肝细胞裂解物中ASGR1的水平。β-肌动蛋白用作负荷对照，HepG2细胞用作ASGR1表达的阴性对照

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培养肝细胞中CYP2A13蛋白水平。Western blot显示培养5、24、48、72、96和120小时后收集的裂解液中的细胞色素P450水平。β-肌动蛋白用作负载对照，HeLa细胞提取物用作低CYP2A13表达的对照

GalNAc结合作为功能读数

为了证明肝细胞在分离后是功能性的，我们评估了细胞结合的能力N个-乙酰半乳糖胺（GalNAc），一种文献证明的无唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）配体。使用流式细胞术评估配体结合，以监测与生物素化GalNAc结合的细胞分数，作为配体浓度的函数。计算出的双和三天线GalNAcKd值分别为28.3和2.3 nM，与之前报道的放射性标记配体受体分析获得的结合亲和力一致，其中GalNAc的计算Kd值为4.3 nM三双天线配体（GalNAc）为25 nM2)（Connolly等人。1982; Connolly等人。1983; 比森等人。1995; Lee等人。1983; Rensen等人。2001)（图6).

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一显示30 nM GalNAc孵育肝细胞荧光强度的直方图2(绿色)，30 nM GalNAc三(蓝色)和空白(红色).b条GalNAc配体结合分析。将新鲜分离的悬浮肝细胞与30、15、7.5、3.8、1.9和0.9 nM生物素化GalNAc孵育2 h2和GalNAc三在与链霉亲和素Alexa647孵育后，通过流式细胞仪测量中值荧光强度（MFI）。使用非线性回归曲线拟合模型（Prism 4.0软件）计算Kd值（nM）

GalNAc-siRNA的体外活性

我们开发了一种方法，用最短培养时间（4小时），用新鲜分离的悬浮小鼠肝细胞在体外筛选GalNAc-siRNA结合物的活性。图7显示了GalNAc结合的siRNA的浓度依赖性摄取，并使用双天线和三天线GalNAc结合的ApoB siRNA在原代肝细胞中沉默靶ApoB mRNA。从剂量-反应曲线确定的GalNAc的IC50值为1和80nM三-siApoB和GalNAc2-分别为siApoB。siRNA-GalNAc偶联物的功效结果与观察到的双和三天线GalNAc-配体的结合相关，因为ApoB-siRNA与三天线配体（GalNAc-三-siApoB）的靶mRNA敲除的IC50低于带有双天线GalNAc配体（GalNAc4）的siRNA2-siApoB）。这种相关性表明，当ASGPR仍然存在时，这两种分析都可以在悬浮细胞中进行，或在最短培养时间内进行（siRNA活性培养4小时）（图三).

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载脂蛋白BGalNAc-siApoB偶联物在原代小鼠肝细胞中沉默mRNA。将悬浮细胞与5、0.83、0.14、0.02、0.003、0.0006和0.0001μM GalNAc-siApoB与双或三天线GalNAc配体结合培养4 h。b进行DNA分析以监测载脂蛋白BmRNA相对于GAPDH公司mRNA作为siRNA结合物浓度的函数。IC50曲线通过剂量反应单位点拟合模型（Microsoft Excel fit）确定。IC50值以nM表示

结论

在这里，我们描述了一种改良的两步方案，用于快速分离肝细胞，以获得具有高活力和纯度的细胞。表2总结了肝细胞分离的几个参数（存活率、细胞数等），并将此处描述的方法与之前发布的两种分离方案进行了比较（Goncalves等人。2007; Li等人。2010). 我们表明，我们可以在短时间内获得富含细胞活力>90%的肝细胞的细胞悬浮液。大多数小鼠肝细胞分离方案的执行时间约为20分钟或更长。当需要从许多动物（如药物预处理、转基因等）中进行分离时，即使每只动物的时间差为5分钟，也会对分离细胞的质量产生负面影响，这时可以理解时间差。此外，我们开发了一种受体-结合分析来评估肝细胞功能。该分析监测分离细胞结合特征良好的去唾液酸糖蛋白受体配体GalNAc的能力。利用流式细胞术，我们证明了生物素标记配体与nM结合亲和力的结合，与之前公布的类似配体设计的Kd值一致（Connolly等人。1982：Connolly等人。1983; 比森等人。1995; Lee等人。1983; Rensen等人。2001). 此外，我们证明，当与ApoB靶向siRNA结合时，GalNAc配体的结合导致细胞摄取和基因沉默。siRNA-结合结果与测量的配体结合亲和力一致，该配体显示GalNAcIC50值较低三-siApoB与GalNAc相比2-siApoB共轭物。通过本文所述方法分离和培养的肝细胞可用于细胞悬浮分析，如所述的流式细胞术分析，或作为生物学和医学研究领域的重要工具，使用短培养时间进行分析。

表2

不同小鼠肝细胞分离方案的比较

参数/协议本研究贡萨尔维斯锂
灌注时间（min）15+30+20
生存能力（%）93–96%80–90不适用
小区数（百万）18–201–3100–400
梯度离心不是的不
细胞纯度标记CD45、Tie2、胶原蛋白IaI、，单元格大小CD45、CD95不适用

对Goncalves等人之前发表的分离方法之间的灌注时间、细胞活力、细胞数量和细胞纯度等参数进行了比较(2007)和Li等人(2010)以及这里描述的隔离方法

致谢

Tracy Zimmermann、Rajeev Kallanthottathil、Carmen Barnes、Anna Borodovsky、Tomoko Nakayama、Boris Klebanov和Scott Barros进行了有益的讨论、技术投入和协助。

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文章来自细胞技术由以下人员提供Springer Science+Business Media B.V.公司。