赖氨酸氧化酶样-2（LOXL2）的酶活性对LOXL2诱导的角质形成细胞分化的抑制不是必需的^*

细胞培养

HaCaT细胞由Fusenig博士（德国海德堡德国癌症研究中心）提供。细胞在补充有10%胎牛血清的MEM-Eagle培养基中培养米 我-谷氨酰胺、50μg/ml青霉素/链霉素（生物工业，以色列Beit Haemek），补充低（0.03 m米)或高（1.2 m米)钙浓度。HEK293和HEK293T细胞购自美国型培养物收藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。

质粒和慢病毒载体

先前描述了NSPI-CMV-Myc慢病毒表达载体(21). 先前描述了LOXL2 shRNA结构(22). 使用pGL2基本载体（Promega，Madison，WI）生成用于LOXL2启动子活性功能分析的质粒，该载体包含无启动子荧光素酶报告基因。

LOXL2启动子的分离及活性测定

为了鉴定LOXL2启动子，我们克隆了位于LOXL2翻译起始位点上游约3.2 kb的DNA片段。LOXL2的第一个非翻译内含子，之前发现它含有功能性缺氧反应元件(23)不包含在此片段中(图1C类)由于其大小（～35 kb）。因此，该片段包含位于内含子1下游的300 bp和位于LOXL2内含子1上游的DNA区域的2.9 kb。将该启动子片段插入pGL2质粒的荧光素酶报告子上游，并根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000转染到HaCaT细胞中。使用萤火虫和雷尼利亚如前所述进行荧光素酶分析(24).

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图1。

LOXL2抑制角质形成细胞分化诱导因子诱导的总括素表达。 A类，HaCaT细胞在含有低或高钙浓度的培养基中培养。一些低钙菜肴还含有维生素D（10⁻⁸ 米)如图所示。10天后，使用实时qPCR测定内源性LOXL2 mRNA水平。将在高钙浓度或维生素D存在下培养10天的细胞的mRNA水平与在低钙浓度下培养10天后的细胞中LOXL2 mRNA表达水平进行比较。B类，细胞裂解物由低钙和高钙培养的HaCaT细胞制备²⁺如图所示，在3或10天后。使用多克隆抗-LOXL2抗体对含有相同蛋白质浓度的等分试样进行蛋白质印迹分析。然后剥离印迹并探测β-肌动蛋白。C类，图片显示了所用LOXL2启动子片段的结构。含有缺氧反应元件的大内含子(23)启动子片段中不包括未翻译外显子1的下游。D类LOXL2启动子在HaCaT细胞中诱导的荧光素酶活性。针对高钙浓度或针对10⁻⁸ 米测定维生素D。这个年轴表示归一化为雷尼利亚控件。所示数据代表两个独立实验的平均值，实验一式三份。将平均值与低钙进行比较²⁺控件。E类，钙和维生素D对总苞素mRNA表达的影响按以下所述进行测量A类LOXL2 mRNA表达。将平均值与高钙进行比较²⁺控件。F类在含有高钙浓度的培养基中培养的HaCaT细胞感染或未感染空慢病毒表达载体（NSPI）或直接表达LOXL2的慢病毒_Myc公司（LOXL2），如图所示。一些含有感染慢病毒的细胞的培养皿直接表达LOXL2_Myc公司补充了10个⁻⁸ 米维生素D(维生素D), 2 μ米澳大利亚旅游协会(澳大利亚旅游协会)，20微米米曲格列酮，2μ米9-顺维甲酸或400μ米氯纤维酸。每隔一天添加分化诱导剂。10天后，使用实时qPCR检测Involucrin mRNA表达，并将其归一化为β-actin mRNA表达。

定量RT-PCR

电池（5×10⁴)在6孔培养皿中播种，然后生长到汇合处。使用5-Prime试剂盒分离总RNA。使用Verso cDNA合成试剂盒（Thermo Scientific，Lafayette，CO）从1μg总RNA和随机六聚体合成cDNA。cDNA的PCR扩增使用绝对^TM（TM）Blue QPCR SYBR®Green Rox Mix（Thermo Scientific）使用ABI Prism 7000序列检测系统，该系统具有人类LOXL2（5′-GCGTCCACTGACTGCAAGCAC和5′-CGAATCCACAC）、人类involucrin（5′-TGTCCTCCCACATA和5′-GCTTGAGACTCCACT）、，人角蛋白-10（5′-GGAAGAATCAACTGAGAGCTG和5′-ATTGTCGATCTGAAGAGG）或β-肌动蛋白（5′-TTGCGACAGGAGAGAGA和5′-AGGTGGACAGCGAGGCGAGGAGGAG）。为了测量内源性LOXL2mRNA的表达水平，我们使用了另一对引物，其中一对引物来源于LOXL2mRNA的3′UTR 5′-GTTGACATCACTGACGTGC和5′-GAGTGACCACGCAGGTTC。为了确保反应条件的特异性，在每次操作结束时，测量扩增产物的熔化温度以确认其均一性。使用以下条件：50°C持续2分钟，95°C持续15分钟，95℃持续10秒，60°C持续1分钟，共40个循环。每个样品分析两次。以β-肌动蛋白cDNA为参考，对扩增的cDNA水平进行标准化。产物在2%琼脂糖凝胶上进行解析，以确认扩增的cDNA的身份。目标基因表达水平通过2-ΔΔ计算C类_t吨方法(25). 在以对照百分比表示表达的实验中，对照始终是在高或低钙浓度下培养3天的未处理细胞中感兴趣基因的表达水平，如图所示。

Western Blot分析

如前所述进行细胞裂解和Western blot分析(26).

抑制LOXL2表达

shRNA-目标LOXL2(22)如前所述，使用慢病毒载体在HaCaT细胞中生成(27).

重组LOXL2变异体的生产和纯化

表达LOXL2的HEK293或HaCaT细胞系_Myc公司，LOXL2_Y689F型或LOXL2的各种缺失突变体_Y689F型如前所述，使用慢病毒载体生成(27). 其中一些重组LOXL2物种从无血清条件培养基中纯化，如下所示：表达LOXL2的HEK293细胞_Myc公司变异体生长到70%的汇合处，并用无血清DMEM培养基培养48小时。将条件培养基（200 ml）与1 ml抗Myc结合珠在4°C下培养24小时。然后收集珠子并用20体积的PBS清洗。用氢氧化铵（0.1）洗脱LOXL2米). 乙酸（1米)用于将洗脱液中和回pH值7。

LOXL2酶活性的测定

荧光安培红分析基本上如前所述进行(28). 纯化LOXL2_Myc公司或LOXL2_Y689F型将（2.5μg）或来自对照条件培养基的相应体积的类似纯化部分添加到反应混合物（10 m米K（K）₂高性能操作₄，pH 7.2，10μ米Amplex Red和0.1单位的辣根过氧化物酶）。底物是一种富含赖氨酸的PF4衍生肽LYKKIIKKLLES，我们将其鉴定为良好的LOXL2底物。将该肽添加到最终浓度为20μ米最终反应体积为100μl。酶反应在37°C下进行4小时。在540 nm激发和580 nm发射下测量荧光。

LOXL2 SRCR和催化结构域中缺失的产生

编码LOXL2的cDNA_Y689F型用作生成所示SRCR和催化结构域缺失的模板(图4A类). 对于每个缺失，使用PfuUltra II融合HS DNA聚合酶（加利福尼亚州圣克拉拉市斯特拉赫内）扩增缺失的上游和下游cDNA，并显示引物对(补充表S1). 使用Expand Long Template PCR系统（德国曼海姆罗氏）连接缺失片段上游和下游的扩增片段，测序并缝合在一起，基本上遵循先前描述的方案(29). 然后将含有该缺失的cDNA连接到NSPI-CMV-Myc慢病毒表达载体中。

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图4。

LOXL2对HaCaT细胞分化的非酶效应由LOXL2的第四个SRCR结构域介导。 A类，来自LOXL2的催化结构域缺失突变的示意图_Y689F型以及LOXL2的各种SRCR缺失突变体_Y689F型.B–D类，在含有高钙浓度的培养基中生长的HaCaT细胞被空慢病毒感染(空向量)慢病毒介导LOXL2的表达_Y689F/-猫.B类或慢病毒引导各种LOXL2的表达_Y689F型缺失不同SRCR结构域的缺失突变体(C类和D类). 细胞在6孔板中培养10天。所示数据代表两个独立实验的平均值，实验一式三份。然后使用实时qPCR测定总苞素mRNA的表达。将平均值与空载体对照进行比较。

LOXL2内化测定

HaCaT细胞接种在10-cm培养皿中（16×10⁴细胞/培养皿），并在含有高钙浓度的培养基中培养过夜。第二天，向细胞补充4μg/ml LOXL2_Myc公司或使用LOXL2_Myc公司用AB0023在4°C下预培养30分钟。在37°C或4°C下孵育30分钟后，使用蛋白质印迹裂解缓冲液在4°C下对细胞进行胰蛋白酶消化、洗涤和裂解。将裂解液与抗Myc抗体（200μg/ml）在4℃下混合2 h。LOXL2型_Myc公司然后使用蛋白G磁珠从裂解液中沉淀。用PBS洗涤珠子三次，煮沸，并使用抗Myc抗体进行Western blot分析，以检测内化的LOXL2_Myc公司.

增殖试验

HaCaT细胞接种在24孔培养皿中（5×10^三细胞/孔），并在含有高钙浓度的培养基中培养。Wells未接受任何添加、洗脱缓冲液（17μl/ml，与添加LOXL2的体积相同）、LOXL2_Myc公司（5μg/ml）或LOXL2_Y689F型（5μg/ml）。额外的因子每隔一天补充一次。每隔一天用犁沟计数器对粘附细胞进行计数。

抑制HaCaT分化不需要LOXL2的酶活性

先前观察到，LOXL2功能抑制抗体AB0023比BAPN更有效地抑制LOXL2对肿瘤进展的影响(8)即使在饱和浓度下BAPN抑制LOXL2的酶活性。”在体外“酶分析比AB0023更有效(5)可能是因为AB0023针对LOXL2的第四个SRCR结构域，而不是催化结构域(2,5). 这些观察结果表明，LOXL2的某些生物活性可能不需要其酶活性。一项实验表明，在低钙浓度培养的HaCaT细胞中添加BAPN并不能减轻LOXL2诱导的对总苞蛋白表达的抑制，相反，添加AB0023能够消除LOXL2诱导的对总苞素表达的抑制(图2，比较D类和E类). 未能恢复involucrin的表达并非由于细胞毒性，因为细胞在BAPN存在下正常增殖（数据未显示）。该实验还表明，LOXL2诱导的总苞蛋白表达抑制可能不需要LOXL2的酶活性。

为了进一步检验这个假设，我们在LOXL2的保守LTQ结构域中引入了一个点突变_Myc公司生成LOXL2_Y689F型(图3A类). 该突变基于先前的工作，该工作表明，LOX LTQ形成所需的保守酪氨酸残基的突变导致酶活性完全丧失(32). 事实上，我们发现LOXL2_Y689F型也缺乏酶活性(图3B类). LOXL2的表达_Myc公司或LOXL2_Y689F型在HaCaT细胞中，对内源性产生的LOXL2 mRNA的表达水平没有显著影响(补充图S1A类). 然而，在高钙浓度培养的HaCaT细胞中，重组LOXL2的表达_Y689F型抑制总苞蛋白mRNA和细胞角蛋白-10 mRNA的表达(图3C类和补充图S1C类). 此外，纯化的LOXL2_第689页添加到在高钙浓度下培养的HaCaT细胞中，能够像非突变LOXL2一样有效地抑制总苞蛋白mRNA和蛋白的表达_Myc公司(图3,D类和E类). 添加LOXL2_Myc公司在含有高钙浓度的培养基中，HaCaT细胞的生长培养基增加了粘附细胞的数量(图3F类)这可能是因为LOXL2抑制了它们的分化，也可能是由于LOXL2直接促进了它们的增殖。然而，我们无法检测到LOXL2诱导的细胞周期蛋白D1的表达，LOXL2也无法诱导ERK1/2的磷酸化（数据未显示）。由于LOXL2似乎不会刺激增殖，我们得出结论，在LOXL2存在的情况下，分化减少是细胞数量明显增加的原因，因为完全分化的角质化包膜从培养孔中脱落将减少。在这个实验中，LOXL2_Y689F型与LOXL2一样有效地促进细胞的积累_Myc公司(图3F类).

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图3。

酶死亡的LOXL2点突变抑制HaCaT细胞的分化。 A类，显示引入LOXL2-LTQ结构域的Y689F点突变的位置的示意图。B类亲和纯化LOXL2的酶活性_Myc公司，LOXL2_Y689F型或从感染空慢病毒的对照细胞中提取纯化条件培养基，并进行相同纯化(空向量)使用“实验程序”中所述的Amplex红试验测定。所示数据代表两次独立实验的平均值。将平均值与野生型LOXL2对照进行比较。C类，HaCaT细胞在含有高钙的培养基中培养并感染空慢病毒(空向量)或慢病毒直接表达LOXL2_Myc公司或LOXL2_Y689F型如图所示。10天后，使用实时qPCR测定总苞苷mRNA水平。将平均值与空载体对照进行比较。D类，HaCaT细胞在不添加任何添加剂的高钙浓度培养基中生长(不添加)或在补充有洗脱缓冲液（对照）的培养基中，纯化LOXL2_Myc公司(LOXL2型)，或LOXL2_Y689F型(LOXL2型_Y689F型). 额外的因子每隔一天补充一次。10天后，使用实时qPCR测定总合蛋白mRNA水平。将平均值与对照组进行比较。E类，细胞裂解物由按照D类通过Western blot分析确定细胞裂解液中是否存在总苞蛋白复合物和总苞素前体。F类，HaCaT细胞接种于24孔板（5×10^三细胞/孔）。油井要么没有添加(不添加)，洗脱缓冲液(车辆)，LOXL2_Myc公司（5μg/ml）或LOXL2_Y689F型（5μg/ml）。添加的因子每隔一天补充一次。每隔一天使用Coulter计数器对粘附细胞进行计数。将平均值与低LOXL2和LOXL2进行比较_Y689F型分别在第7天进行对照。

即使LOXL2的酶活性_Y689F型似乎被完全抑制了(图3B类)，我们认为可能仍然存在一些残余活性，并且这种残余活性可能足以抑制钙诱导的HaCaT细胞中总苞苷的表达。为了排除这种可能性，我们产生了LOXL2的缺失突变_Y689F型完全缺乏催化结构域（LOXL2_Y689F/-猫) (图4A类). 尽管缺乏催化结构域，但在高钙浓度培养的HaCaT细胞中表达重组LOXL2/-cat能够有效抑制总苞苷的表达(图4B类).

LOXL2抑制Involucrin表达需要存在LOXL2的第四个SRCR结构域

上述实验表明，LOXL2诱导的角质形成细胞分化抑制不需要LOXL2的酶活性。这些结果表明，其他LOXL2结构域，例如其中一个SRCR结构域，可能对该活性很重要。为了检验这个假设，我们制作了LOXL2的缺失突变体_Y689F型缺少所描述的一个或多个SRCR域(图4A类). 然后，我们在HaCaT细胞中表达缺失突变体，并确定这些突变的LOXL2变异体中哪些能够抑制钙诱导HaCaT电池中的总苞苷诱导。这些实验表明，抑制HaCaT中involucrin的表达依赖于保留第四个SRCR结构域。第四个SRCR结构域的缺失导致抑制总苞蛋白表达的能力丧失，而其他任何SRCR结构区的缺失都不会影响该能力(图4,C类和D类). 有趣的是，AB0023也能抑制LOXL2_Myc公司-诱导抑制总括素表达(图2D类)，也与LOXL2的第四SRCR结构域结合(5). 因此，发现AB0023也抑制LOXL2_Myc公司-诱导的involucrin表达抑制独立地支持将该结构域确定为介导LOXL2诱导的角质形成细胞分化抑制的结构域。