Ac-SDKP逆转心肌梗死后心力衰竭大鼠炎症和纤维化

摘要

N-乙酰基-芳基-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP）是一种天然存在的抗纤维化肽，其血浆浓度通过血管紧张素转换酶抑制剂增加4-5倍。Ac-SDKP从其前体胸腺肽中释放-β₄，存在于大多数细胞中。¹它通过阻止进入细胞周期的S期来抑制多能造血干细胞和肝细胞增殖，使细胞保持在G期₀/G公司₁从而帮助控制其扩散。^2–4我们已经证明，体外Ac-SDKP抑制心脏成纤维细胞增殖和胶原合成，⁵而在体内，它防止了醛固酮盐性高血压和肾血管性高血压大鼠左心室（LV）和肾脏中的胶原沉积。^5,6胶原沉积减少与增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞数量减少有关，PCNA阳性细胞是细胞增殖的标志。Ac-SDKP的这些作用不会引起血压或心肌细胞肥大的变化。我们的研究表明，Ac-SDKP预防纤维化的机制之一是通过抑制成纤维细胞增殖和胶原合成。众所周知，炎症在心肌梗死后心力衰竭（HF）的间质和血管周围心肌纤维化的发病机制中起着重要作用。纤维化通常与巨噬细胞共存，巨噬细胞释放细胞因子，如转化生长因子-β（转化生长因子-β)这在心肌纤维化中起着关键作用。⁷有证据表明Ac-SDKP抑制TGF-β通过抑制Smad2磷酸化进行信号转导。^8,9然而，尚不清楚它是否也抑制TGF的表达-β.

在本研究中，我们验证了以下假设：在心肌梗死后心衰中，心肌非梗死区的Ac-SDKP作为抗炎细胞因子发挥作用，减少巨噬细胞浸润和TGF-β表达，从而减少反应性心脏纤维化，从而改善心脏功能。我们还测试了Ac-SDKP不仅可以预防炎症和纤维化的发展，而且可以在这些过程已经建立时逆转这些过程的假设。

方法

体重255至275克（马萨诸塞州威明顿Charles River Laboratories，Wilmington）的8岁雄性Lewis近交系大鼠被关在一个有空调的房间里，进行12小时的光/暗循环，接受标准实验室食物（0.4%钠），并饮用自来水。手术前给予动物5至7天的时间来适应新的环境，然后通过结扎左冠状动脉前降支（LAD）或如前所述的假手术来进行MI。^10,11在心肌梗死诱导前7天（预防方案）或心肌梗死后2个月（逆转方案），通过微渗透泵将Ac-SDKP或载体（生理盐水）注入腹腔。实验结束时，通过注射10%KCl使心脏在舒张时停止，然后切除、称重，并准备进行组织学和胶原蛋白含量、巨噬细胞浸润和TGF的测定-β-阳性细胞。所有程序均获得批准，并遵循亨利福特医院动物护理和使用委员会的指导方针。

结果

在60只接受冠状动脉结扎的大鼠中，有5只在手术后死亡，手术死亡率为8%。此外，有4人在2个月内死亡（HF-vehicle组2人，Ac-SDKP预防组2人），3个月内3人死亡（HF-vehicle组1人，Ac_SDKP逆转组2人。没有死亡与心脏破裂有关，沙姆封闭组没有大鼠死亡。

巨噬细胞浸润

sham-MI大鼠间质中可见少量巨噬细胞（34.7±2.1/mm²). 心肌梗死后2个月巨噬细胞数量显著增加（257.5±9.1个/mm²;P（P）<0.001 vs sham MI），并在4个月时保持升高（264.7±8.1/mm²;P（P）<0.001与假MI）。溶媒组在心肌梗死后2个月和4个月的巨噬细胞数量没有显著差异。Ac-SDKP在预防方案中减弱了巨噬细胞的增加（170.2±9.2/mm²;P（P）<0.001 vs MI-vehicle/4个月），逆转方案中巨噬细胞浸润减少（153.1±8.5/mm²;P（P）<0.001与MI-车辆/2个月和MI-车辆/4个月）(图1，上面板；图2).

在单独的窗口中打开

图1

Ac-SDKP对巨噬细胞浸润（上面板）和TGF的影响-β假心肌梗死（MI）大鼠心脏的表达（下表），或用溶媒或Ac-SDKP治疗的MI大鼠心脏*P（P）<0.01 vs sham；#和δP（P）与MI-vehicle（4个月）相比<0.01；†P（P）与MI-vehicle（2个月）相比，<0.01。

在单独的窗口中打开

图2

显示假心肌梗死（MI）或经溶媒或Ac-SDKP治疗的MI大鼠心脏巨噬细胞浸润（棕色染色）的典型图像（免疫组织化学染色和苏木精复染，×400）。

TGF公司-β-阳性细胞

一些TGF-β-假心肌梗死组心脏内可见阳性细胞（42.8±1.9/mm²). TGF数量-β-心肌梗死后2个月阳性细胞显著增加（184.9±8.0/mm²;P（P）<0.001），并在4个月时保持升高（195.6±8.4/mm²;P（P）<0.001与假MI）。在溶媒组中，TGF没有显著差异-β-心肌梗死后2到4个月的阳性细胞数。Ac-SDKP减弱了TGF的增加-β-预防方案中的阳性细胞（129.6±5.3/mm²;P（P）与MI载体/4个月相比<0.001），并且TGF显著降低-β-逆转方案中的阳性细胞（130.7±10.2/mm²;P（P）<0.001与MI-车辆/2个月和MI-车辆/4个月）(图1，下面板；图3). 组织学，TGF-β-阳性细胞与巨噬细胞非常相似：大而圆，核呈椭圆形或肾形，主要位于间质空间，提示TGF-β主要在心肌梗死后大鼠心脏的巨噬细胞中表达。

在单独的窗口中打开

图3

显示TGF的代表性图像-β-假心肌梗死或经溶媒或Ac-SDKP治疗的心肌梗死大鼠心脏中的阳性细胞（棕色染色）（免疫组织化学染色和苏木精复染，×400）。

胶原蛋白含量

假心肌梗死组心肌胶原含量为11.9±0.3μg/mg LV干重，心肌梗死后2个月和4个月时显著增加（22.6±2.0和23.7±0.9μ分别为g/mg；P（P）<0.001与假MI）。在心肌梗死后2个月和4个月，溶媒组的心脏胶原蛋白含量没有显著差异。Ac-SDKP显著降低了预防方案中胶原蛋白含量的增加至15.0±0.7μ克/毫克(P（P）<0.001 vs MI-vehicle/4个月），逆转方案中胶原蛋白含量显著降低（14.4±1.5μg/mg LV干重；P（P）=0.006与MI-车辆/2个月；P（P）<0.001与MI-车辆/4个月）(图4).

在单独的窗口中打开

图4

通过羟脯氨酸测定测定Ac-SDKP对左心室总胶原含量的影响*P（P）<0.01 vs sham；#和δP（P）与MI-vehicle（4个月）相比<0.01；†P（P）与MI车辆（2个月）相比，<0.01。

间质胶原组分

假心肌梗死组心肌间质胶原分数（ICF）为5.8%±0.2%，心肌梗死后2个月和4个月显著增加（分别为12.5±0.2%和13.0±0.3%；P（P）<0.001与假MI）。溶媒组心肌梗死后2个月和4个月的ICF无显著差异。Ac-SDKP在预防方案中减弱了ICF的增加（10.2±0.4%；P（P）<0.001 vs MI-vehicle/4个月）和逆转方案中ICF降低（10.3±0.6μg/mg LV干重；P（P）=0.003 vs.MI-车辆/2个月；P（P）<0.001与MI-车辆/4个月）(图5，上面板；图6).

在单独的窗口中打开

图5

Ac-SDKP对假心肌梗死或心肌梗死大鼠左心室间质胶原分数（ICF；上表）和血管周纤维化（下表）的影响，如血管周胶原面积（PVCA）与管腔面积（LA）的比值所示*P（P）<0.01 vs sham；#和δP（P）与MI车辆相比<0.01（4个月）；†P（P）与MI-vehicle（2个月）相比，<0.01。

在单独的窗口中打开

图6

显示假心肌梗死或经溶媒或Ac-SDKP（荧光标记花生凝集素染色×400）治疗的心肌梗死大鼠的间质胶原沉积（绿色染色）和心肌细胞横截面积（由间质空间描绘）的典型图像。

血管周围胶原蛋白

假心肌梗死组血管周围胶原面积与冠状动脉管腔面积之比（PVCA/LA）为1.76±0.1，心肌梗死后2个月和4个月显著增加（分别为4.5±0.5和4.8±0.2；P（P）<0.001与假MI）。在溶媒组中，心肌梗死后2个月和4个月的PVCA/LA没有显著差异。Ac-SDKP显著降低了预防方案中血管周围胶原的增加（2.5±0.2；P（P）<0.001 vs MI-vehicle/4个月），逆转方案中血管周围胶原显著减少（2.5±0.2；P（P）=0.002与MI-车辆/2个月；P（P）<0.001相对于MI车辆/4个月）(图5，下面板；图7).

在单独的窗口中打开

图7

典型图像显示假心肌梗死或经溶媒或Ac-SDKP（Gomori三色，×400）治疗的心肌梗死大鼠心脏血管周围胶原沉积（绿色染色）。

讨论

以前我们已经证明Ac-SDKP可以预防肾血管性和盐皮质激素性高血压大鼠的巨噬细胞浸润和心脏纤维化。^5,14在本研究中，使用MI后心脏重塑的大鼠模型，我们发现Ac-SDKP治疗不仅可以预防而且可以逆转心肌非损伤区域的反应性心脏纤维化（总胶原、ICF和血管周围胶原增加）。此外，Ac-SDKP部分预防并部分逆转了心脏的炎症过程（巨噬细胞和TGF增加-β-阳性细胞）。溶媒组心肌梗死后2个月和4个月的心脏纤维化和慢性炎症相似。我们还发现Ac-SDKP并没有改变血压。因此，Ac-SDKP对炎症和纤维化的影响似乎并不继发于血流动力学变化。此外，正如我们在高血压模型中发现的那样，Ac-SDKP并没有降低MCSA或左心室肥厚（LVH）。^5,14

心肌梗死后的左室重塑是一个复杂的过程，涉及梗死和非梗死区域，并对左室扩张、心衰发展和死亡有重要影响。心肌梗死部位发生修复性纤维化，对重建坏死心肌以保持心脏结构完整性和避免心脏破裂至关重要；¹⁵然而，瘢痕的形成并不是本研究的重点。在目前的工作中，我们专注于非梗死心肌，即发生反应性和修复性间质纤维化的心肌。大量证据表明，非梗死区的间质胶原基质在心肌梗死后的愈合和重塑中起着重要作用。^16–18在这个领域，对于心脏干细胞和炎性细胞（浸润组织后）是否能够增殖存在一些争议。^17,19,20研究表明，心肌梗死后心脏间质中存在大量浸润性巨噬细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞。^20–22趋化因子（包括单核细胞趋化蛋白-1[MCP-1]）刺激心肌和其他组织中的巨噬细胞浸润。^22–25这些浸润的巨噬细胞释放细胞因子，如TGF-β刺激成纤维细胞增殖和间质基质积聚，促进心脏纤维化。^21,26,27TGF已被充分证明-β是一种关键细胞因子，可促进胶原和细胞外基质（ECM）其他主要成分在许多纤维化疾病中的积聚，包括心肺纤维化、肾小球肾炎和血管再狭窄。^28,29此外，高血浆TGF-β₁在伴有LVH和微量白蛋白尿的高血压患者中发现了该水平。²⁸Ac-SDKP的抗纤维化作用可能至少部分是由于其对TGF的影响-β₁从而降低成纤维细胞增殖和胶原合成。在本研究中，我们发现MI后，大鼠心脏有相当多的胶原沉积，与TGF显著增加有关-β₁。我们还发现TGF-β-阳性细胞和巨噬细胞主要位于间质间隙，提示TGF-β在该模型中可能主要表达于浸润性巨噬细胞。然而，我们不确定TGF-β₁-阳性细胞是巨噬细胞，因为TGF-β₁不仅在巨噬细胞中表达，也在成纤维细胞、肌成纤维细胞和其他细胞中表达。此外，TGF-β₁从细胞释放到间质空间，通过磷酸化Smad信号蛋白的质膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体以自分泌和旁分泌方式发挥作用；然后这些蛋白质被转移到细胞核。在MI慢性期的心脏中，TGF-β₁激活与Smad2和4的表达增加和Smad7的表达减少相关，这些事件与持续的心脏纤维化呈正相关。^30,31最近，Pokharel等人⁸据报道，在培养的心脏成纤维细胞中，Ac-SDKP抑制Smad2的表达和核移位，这可能是其抗纤维化作用的部分原因。此外，Kanasaki等人⁹表明Ac-SDKP抑制TGF-β通过Smad7的核输出抑制R-Smad激活的信号转导。此外，我们的研究表明Ac-SDKP降低TGF的表达-β_1,它被认为是促进成纤维细胞向肌纤维细胞分化的刺激物。³²Ac-SDKP通过这些机制发挥作用，可能会抑制心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，肌成纤维纤维细胞在心肌梗死后心脏重塑期间主要负责胶原蛋白的生成。^27,33–37以前，我们已经证明Ac-SDKP在体外抑制成纤维细胞增殖和胶原合成。⁶这种对增殖和合成的直接影响也可能是其体内抗纤维化作用的部分原因。在另一项研究中，我们发现在肾血管性和盐皮质激素性高血压中，Ac-SDKP显著降低了PCNA（细胞增殖标记物，可能是心脏成纤维细胞）在心脏的表达增强。PCNA减少与胶原沉积减少有关，^5,14支持Ac-SDKP的抗纤维化作用可能是由于抑制成纤维细胞增殖和胶原合成。

人们普遍认为，心脏中胶原蛋白的增加会增加舒张硬度并损害舒张，最终促进左心室功能障碍。因此，我们预计预防或逆转心脏纤维化将有利于心脏功能。然而，我们发现即使Ac-SDKP降低了心肌纤维化，它也没有改善EF和E/A比率、收缩和舒张功能指标。相反，在预防方案中，与MI-vehicle组（4个月）相比，EF降低，LVDd增加。这可能是因为心肌梗死后阻止胶原蛋白沉积，通过引起心肌细胞滑移和增加梗死面积，改变心脏重塑。这些发现与Baicu等人一致，³⁸who发现，在猫的肥大乳头肌中，纤溶酶通过激活基质金属蛋白酶而使纤维化急性消退，这会对收缩功能产生负面影响。暴露于相同处理下的分离心肌细胞的收缩性与未处理的心肌细胞没有差异，表明胶原可能在肌细胞与心肌细胞的相互作用中发挥重要作用，优化心室收缩功能；因此，在心肌梗死后重塑的早期靶向胶原可能是有害的。在我们的逆转方案中，尽管心脏纤维化减少，但Ac-SDKP并没有改变心脏功能，这表明心脏纤维化的程度可能不是功能的重要决定因素，这可能主要是由于纤维化的质量，例如胶原交联的变化。³⁹除胶原外，左室重构的其他成分对心室性能至关重要。在大面积梗死（≥42%左心室）的大鼠模型中，存活左心室重量的减少和心脏几何形状的改变可能更为重要。

长期以来，ACE抑制剂可改善心脏功能，通常与胶原沉积减少有关。^40–43ACE抑制剂的抗纤维化作用可能部分通过抑制Ac-SDKP的降解来介导，而Ac-SDKP几乎完全被ACE水解。^1,44研究表明，ACE抑制剂在体内可使血浆Ac-SDKP增加4-5倍，而在体外可抑制[^三H] Ac-SDKP增长90%至99%。¹因此，增加Ac-SDKP可能有助于ACE抑制剂的抗纤维化作用。然而，在这种心肌梗死后心力衰竭模型中，ACE抑制剂不同于Ac-SDKP，可以改善心功能。^{12,40,45–49}ACE抑制剂在心力衰竭中的作用机制很复杂。除了阻断血管紧张素I向II的转化外，它们还抑制激肽水解并刺激一氧化氮的释放，这是Ac-SDKP所没有的作用。^{12,40,45–49}

总之，Ac-SDKP阻止并逆转了心肌梗死后大鼠心脏间质胶原和血管周围胶原的沉积，与巨噬细胞浸润减少和TGF减少相关-β–阳性细胞表达。我们的研究表明，Ac-SDKP的抗纤维化和抗炎作用可能部分通过抑制巨噬细胞浸润和TGF介导-β表达。然而，这些影响本身并不一定转化为心脏功能的改善。

致谢

工具书类