人卵裂因子I的结构_米提示UGUA特异性RNA结合以外的功能

摘要

介绍

信使核糖核酸（信使核糖核酸）的3′加工是一个重要的成熟步骤，它可以提高信使核糖核酸的稳定性，促进其从细胞核输出到细胞质，并提高翻译效率。¹3′端形成是一个两步过程，首先是在聚腺苷化位点[聚（a）位点]进行内切核裂解，然后添加聚腺苷尾部。^2–5Poly（A）位点的定义是通过其相应的蛋白因子识别位于mRNA上的特定顺式元素[称为Poly（A）信号]来完成的。^4,5两种研究充分的poly（A）信号是A（A/U）UAAA六聚体和下游富含GU的元件，它们分别被切割和多腺苷酸化特异性因子（CPSF）和切割刺激因子（CstF）复合物结合。^4,5第三个poly（A）信号由UGUA元件组成，被确定为裂解因子I的首选结合位点_米（CFI_米)通过SELEX和生化分析。^6,7三部分核心蛋白-RNA复合物与裂解因子II_米作为一个平台，招募其他3′加工因子来调节裂解和聚腺苷酸化反应的效率。^1–三,8

CFI公司_米是一个双亚单位复合物，由一个小的25kDa（CFI_米25）亚单位和较大的59/68/72 kDa亚单位。⁹CFI公司_米25由一个基因编码，CPSF5系列而两个独立的基因，CPSF6系列和CPSF7系列，大亚基CFI的两种亚型的代码_米68和CFI_米59.第三种亚型，CFI_米72，是CFI的可选拼接形式_米68^9–11CFI公司_米68和CFI_米59都包含一个N端RRM结构域、一个富含脯氨酸的中央区域和一个C端RS-like结构域。^10,11CFI的N端RRM_米59/68介导与CFI的相互作用_米25¹¹除了在UGUA介导的聚（A）位点识别中的基本作用外，^6,7CFI公司_米已经显示出影响可供选择的聚（A）位点选择，^12–14mRNA输出，^15,16和mRNA剪接。¹⁷最近解决的CFI晶体结构_米25-RNA和CFI_米68 RRM-CFI公司_米25-RNA复合物¹⁸结合生化分析，阐明了CFI的分子机制_米对UGUA元素的特异性及其在选择性poly（A）位点选择中的作用。下文讨论了这些研究的主要发现及其影响。

CFI公司_米通过两个不同蛋白质结构域的协作结合mRNA

快速浏览CFI两个亚单位的域组织_米可能会给人留下CFI的错误印象_米68可能是识别UGUA序列元素的亚单位，因为它包含的RRM是脊椎动物中最丰富的单链RNA结合域。^19,20此外，在大量情况下，该基序以序列特异性的方式与RNA相互作用。^21,22相反，CFI_米25具有Nudix水解酶结构域，^23,24主要水解（二）核苷酸的家政酶中发现的一种基序。^25,26然而，紫外线交联¹¹和凝胶位移分析²⁷表明CFI_米25能够结合RNA。CFI_米另一方面，68 RRM增强了CFI介导的RNA结合_米25，但不能自行结合RNA。¹¹

CFI的晶体结构_米25与含有UGUA元素的RNA寡核苷酸的复合物揭示了序列特异性识别的分子基础。²⁷与其他Nudix蛋白的比较显示CFI_米25在Nudix折叠之前具有独特的α-螺旋环基序。这种α-螺旋环基序不仅阻断了典型水解酶活性位点，还为CFI提供了支架_米25结合RNA。²⁷UGUA元素通过各种氢键相互作用识别。U1主要被来自Phe104的主链原子识别，而U3则被Arg63的侧链识别。除了与Glu55侧链的相互作用外，G₂与A4形成分子内Watson-Crick/糖边碱基对。²⁷此外，Phe103与U1和G堆叠₂进一步稳定CFI_米25-UGUA综合体。²⁷

进一步调查更大CFI的作用_米在poly（A）位点识别中，我们解决了CFI的晶体结构_米68 RRM-CFI公司_米25-RNA三元复合物。¹⁸与之前的观察结果一致，CFI_米68和CFI_米25形成2:2异四聚体。¹²然而，不是形成二聚体，而是两个CFI_米68个RRM分子与CFI的相反侧结合_米25同二聚体。¹⁸CFI公司_米68 RRM采用典型的β₁α₁β₂β_三α₂β₄架构。²²RRM联系CFI_米25通过连接β的回路₁/α₁和β₂/β_三分别称为loop1和loop3。环1介导的相互作用主要是疏水性的，而环3残基参与氢键相互作用，涉及侧链和主链原子。突变分析表明，只有loop3对CFI至关重要_米复杂地层。

生化数据显示CFI的关键作用_米68在受CFI约束的两个UGUA元素之间循环干预序列_米25二聚体。两个CFI_米25个单体以反平行方向取向，使得两个UGUA元素的5′端相互面对。因此，干预序列需要循环定位CFI的RNA结合囊中的两个UGUA元件_米25.试图勾画低分辨率RNA路径的突变分析显示CFI_米68个RRM残留物位于CFI形成的裂缝中_米68立方英尺_米25接口对RNA循环至关重要。CFI认证_米68个RRM四倍变异体在两个裂口（W90A/W91A/N117A/R118A）中均含有突变残基，几乎消除了CFI的RNA结合亲和力_米与其他RRM不同，RRM在四条反平行β链形成的β片表面结合RNA，²²CFI公司_米68 RRM可能会将环状RNA引导至β-表面积下：位于RRM底部的Asp94显著降低了CFI的RNA结合亲和力_米当突变为丙氨酸时。此外，另一个C端α-螺旋（α_三)紧接着RRM的是阻断β-表的表面，β-表是通常结合RNA的平台。²²此外，在CFI中_米68 RRM负责RNA结合的三个高度保守的芳香残基之一被亮氨酸取代（RNP1上的L128）。²²

CFI公司_米68，立方英尺/平方英寸_米59及其同系物使用ClustalW进行比对²⁸计算序列保守性并映射到CFI_米使用ConSurf的68 RRM模型(图2B).²⁹与基于生化数据提出的RNA路径一致，位于裂口1和裂口2附近且位于RRM底部的残基表现出比其余RRM更高的保守性。综合这些观察结果表明，RNA不太可能在β-表表面循环。

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图2

CFI的序列和结构比较_米68和CFI_米59.（A）CFI的序列比对_米68和CFI_米59个RRM域。相同的残留物以红色突出显示。（B）CFI的保护_米68 RRM是使用ConSurf服务器计算的²⁹并用PyMOL显示。⁵³（C） CFI的静电表面电势_米68（左）和CFI_米用Delphi计算59（右）个RRM域⁵⁸并根据静电电势进行着色（蓝色，正极；红色，负极）。模型与（B）中右侧的模型方向相同。（D） CFI的叠加_米25/CFI公司_米59（PDB ID:3N9U）复合体与CFI_米25/CFI公司_米68（第三季度）。这两个综合体都显示为卡通模型。CFI公司_米25个单体与CFI络合_米59（CFI_米25₅₉)颜色为紫色和粉红色，而CFI_米25个单体与CFI复合_米68（CFI_米25₆₈)有绿色和浅绿色。CFI公司_米59个RRM为金色、黄色和CFI_米68个RRM为蓝绿色。图片左侧的Cleft1因RRM域中的移动而变窄，用橙色弯曲箭头表示。（E）中更详细地显示了灰色矩形所描绘的区域。（E） 左视图1的特写视图。CFI的Arg68_米25参与与CFI的Glu112的盐桥_米59（Glu112₅₉)，但相同的精氨酸残基距离太远，无法与CFI中的类似谷氨酸接触_米68（Glu111₆₈). 残留物显示为棒状模型，并根据它们所属的分子进行着色。离子键显示为红色虚线。为了清晰起见，螺旋线显示为圆柱体。

CFI对选择性聚腺苷酸化的潜在RNA环介导调控_米

由于3′-UTR中存在多个多聚腺苷酸化位点，前mRNA可能以几种不同的方式进行多聚腺苷化。³⁰深度测序和生物信息学分析证明了替代性多聚腺苷化的普遍性，^8,31,32产生具有不同长度的3′UTR的mRNA^30,33,34并随后影响各种细胞事件，如基因沉默、组织分化和发育。^30,35最近的一份报告说明了CFI的参与_米雄性生殖细胞中的交替聚腺苷化。^12–14此外，击倒任一CFI_米25或CFI_米Hela细胞提取物中的复合物导致转向使用上游聚（a）位点。^12,13通过CFI在两个UGUA单元之间循环干预序列的能力_米68为CFI提供了一种潜在的机制_米以规范选择性聚（A）位置选择。¹⁸使用不同长度的UGUA RNA对干预序列进行凝胶位移分析表明，CFI有效结合至少需要7个核苷酸（7nt）_米68 RRM-CFI公司_米25个复合物，而较长的间隔物（9至15 nt）增强了结合亲和力。这些数据导致了CFI的假设_米68 RRM可能不会限制干预RNA的最大长度，因此可能会环出整个poly（A）位点，包括AAUAAA六聚体和下游富含GU的元素(图1). 剪接调节器嘧啶轨道结合蛋白（PTB）也有类似的RNA环介导调控机制。³⁶PTB中RRM的反平行组织可能允许该蛋白循环并从成熟mRNA中排除整个外显子。³⁶有趣的是，3亚基切割刺激因子复合物（CstF）被提议形成由每个亚基的两个拷贝组成的杂六聚体：CstF77、CstF64和CstF50。^三,37–39虽然CstF64仅包含一个RRM域，但已证明该域可以识别富GU元素，^40,41CstF64可能通过CstF复合体的二聚状态实现类似的RNA环机制，从而影响替代poly（a）位点的使用。该假设与之前的观察结果一致，即与前B细胞相比，血浆B细胞中CstF64水平较低与使用替代聚（a）位点相关。⁴²我们推测，RNA环化可能是一些3′加工因子调节聚腺苷酸化的一般机制。

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图1

CFI模式_米可能促进选择性聚腺苷化。

CFI公司_米68和CFI_米59在3′加工中可能扮演不同的角色

CFI公司_米68和CFI_米59具有相似的结构域组成，这是剪接调节器SR蛋白的特征，⁴³中心富含脯氨酸的区域两侧为N末端RRM结构域和C末端RS样结构域。另一方面，CFI_米68具有一个额外的富含甘氨酸-精氨酸（GAR）基序，该基序在CFI中缺失_米59.有趣，CFI_米68以前已经被证明参与了mRNA从细胞核的输出，GAR基序负责与mRNA输出受体NXF1/TAP的相互作用。^15,16这些数据显示了两个较大亚单位的潜在不同功能。最近一项针对翻译后修饰的研究也揭示了更大亚单位的多种形式的作用。¹⁰在报告中，Martin和同事确定了CFI中精氨酸残基的不同甲基化模式_米68和CFI_米59，以及它们被甲基化的不同酶。¹⁰两个CFI的RS-like域_米68和CFI_米59被蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）家族成员PRMT1弱甲基化。^10,44发现PRMT2的SH3结构域与CFI相互作用_米59，但不是CFI_米68^10,45另一方面，PRMT5复合物仅甲基化CFI_米68在CFI中缺失的GAR基序中_米59¹⁰两个较大的CFI的不同甲基化模式_米亚单位提示它们在mRNA 3′加工中可能发挥不同的作用，但这些修饰的功能尚未确定。

除了CFI的晶体结构_米68 RRM-CFI公司_米25个综合体，¹⁸CFI的结构_米59 RRM-CFI公司_米最近还解决了25个复合物（卡洛林斯卡研究所结构基因组联盟；PDB ID代码3N9U）。尽管结晶使用了不同的RRM结构，即CFI的残基13–235_米CFI为68和50–182_米59，两组只能观察到RRM结构域的可解释电子密度，即CFI的残基81–173_米CFI的68和82–177_米59.两个复合物之间的结构比较可以深入了解各种CFI的功能_米异构体(图2D). CFI的整体蛋白质结构_米59 RRM与CFI非常相似_米68，典型的RRM折叠附加一个位于β-片顶部的C端螺旋。（以93 Cα原子计算RMSD 1.23Ω）(图2D). 除了Phe168和Tyr127之间的疏水堆积相互作用，以及Leu165和Tryr85之间的范德瓦尔斯接触，其稳定了α_三如CFI所示_米68，Arg159分别与Phe168和Gln167进行堆叠和氢键相互作用。在CFI中未观察到这些附加力_米68，因为苏氨酸位于CFI对应的位置_米59参数159。α中另一个有趣的特性_三是Ser166和残基162的主链羰基之间的氢键，₅₉（按CFI编号_米59），存在于两个CFI中_米59和CFI_米68.Ser166被磷酸化，⁴⁶这将破坏与残基161主链羰基的氢键相互作用，₆₈并可能破坏螺旋α的稳定性_三有趣的是，当这种丝氨酸突变为天冬氨酸（一种磷酸盐模拟物）时，我们观察到CFI的RNA结合亲和力增加了两倍_米68/CFI公司_米25复杂（数据未显示）。Ser166磷酸化在mRNA加工调控中的潜在作用有待进一步探索。

尽管它们在不同的空间群中结晶，CFI的异四聚体_米59 RRM-CFI公司_米25以与CFI 68 RRM-CFI相同的方式组织_米25个综合体，带两个CFI_米CFI侧翼的59名RRM_米25同二聚体。为了调查CFI之间的关系_米59和CFI_米68在RNA结合中，我们检查了序列的保守性(图2A和B)和两个RRM域的静电势(图2C). CFI之间的大多数表面电荷相似_米59和CFI_米68.一个显著的区别是CFI的裂2侧_米59比CFI带更多负电荷_米电荷差异对RNA结合的潜在影响需要进一步的实验研究。

尽管CFI之间各个子单元的总体域架构几乎相同_米68 RRM-CFI公司_米25和CFI_米59 RRM-CFI公司_米25个配合物，整个异四聚体的叠加显示出有趣的差异(图2D和E). CFI的大亚单位_米联系CFI_米25二聚体通过RRM结构域的环1和环3，在RRM-CFI处形成两个裂缝_米25接口。这些裂缝被认为是CFI结合mRNA的进入和退出途径_米.在CFI中_米68 RRM-CFI公司_米25复杂，出口裂口（指定为裂口2）相当宽（～20°），而入口裂口（定义为裂口1）更窄（～8°）。同样，在CFI中_米59 RRM-CFI公司_米25 complex，cleft2打开。而一个裂缝1的宽度与CFI 68 RRM-CFI相同_米另一个裂缝要窄得多（～4º），因为RRM域的～4°位移不影响保持在相同位置的回路1或回路3(图2D和E). 因此，CFI的Glu112之间形成盐桥_米CFI的59和Arg68_米25 (图2E). RRM域的移动表明CFI_米68个/立方英尺/平方英寸_米25和CFI_米59/CFI公司_米25个复合物可能以不同的方式结合RNA，因为RNA分子预计不会穿过4Å的裂缝。然而，我们不能排除RRM运动可能是晶体堆积相互作用的结果。CFI结构_米与含有两个UGUA元素的长RNA复合，需要确定介入循环序列的路径，并可能阐明CFI的不同作用_米68和CFI_米59参与RNA结合，特别是mRNA加工。

CFI公司_米可桥接3′处理与其他mRNA处理事件

尽管许多研究侧重于阐明mRNA加工中各个步骤的机制，但新出现的证据表明，所有步骤都密切相关（参考文献中综述）。⁴⁷). 作为mRNA加工的一个组成部分，3′加工与5′封盖和剪接耦合。⁴⁸早期的一项研究已经确定了帽结合蛋白（CBP）复合物与3′加工之间的物理联系，表明当从HeLa细胞核提取物中去除CBP时，3′加工复合物的稳定性较差，而添加重组CBP复合物恢复了3′切割效率。⁴⁹CFI的晶体结构_米68 RRM-CFI公司_米25项复杂和结构线形分析表明，CFI_米25可能是调节连接的3′加工因子。CBP是一种双亚单位复合物，由一个较大的80kDa（CBP80）和一个较小的20kDa亚单位（CBP20）组成，它们与m结合⁷GpppG Cap通过其RRM域。^50,51CBP20和CFI的叠加_米68表明，不仅β-片和α-螺旋可以重叠，更重要的是，环1和环3几乎完全对齐(图3). 如突变所示，只有loop3对CFI的形成至关重要_米复杂。考虑到环3介导的7个氢键相互作用中有4个是通过主链原子进行的，因此CBP20等蛋白质可能会与CFI建立稳定的接触_米25，与loop3中的氨基酸序列无关。此外，CBP20通过位于环1和环3相对侧的环2和环4与CBP80相互作用。这将允许CFI_米25在不干扰其绑定伙伴CBP80的情况下绑定CBP20。

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图3

CFI叠加_米68，RRM具有类似形状的环3。CFI公司_米25个单体分别呈绿色和浅绿色。CFI公司_米68 RRM（PDB ID:3Q2S¹⁸)为蓝绿色，CBP20（1H2V⁵¹)红色，U2AF65（2G4B⁵⁵)橄榄色，PAPBC（1CVJ⁵⁴)紫色和Rna15（2X1A⁴⁰)三文鱼。

根据CBP20-CFI_米68结构比对，我们对CFI的同源结构进行了系统搜索_米68使用DALI服务器的RRM域。⁵²我们将所有同系物与大于5的Z分数对齐，并使用PyMOL手动检查它们。⁵³在598个同源物中（由于PDB文件中存在多条链，因此该数据集包含重复），仅发现4个蛋白质（排除重复）与CFI中的loop1和loop3形状相同_米68 (图3)：细胞质多聚（A）结合蛋白（PAPBC）的第一个RRM（Z评分=12.5，PDB ID:1CVJ），⁵⁴CBP20（Z得分=11.8，PDB ID:1H2V），⁵¹Rna15，CstF64的酵母同源物（Z分数=10.9，PDB ID:2X1A）⁴⁰剪接因子U2AF65的第二个RRM（Z得分=10.4，PDB ID:2G4B）。⁵⁵U2AF65的鉴定很有趣，因为CFI的亚单位_米已在纯化的人类剪接体中鉴定。^56,57此外，CFI之间的具体互动_米实验确定了剪接因子U2AF65。¹⁷序列比对结果揭示了CFI的潜在分子机制_米25和U2AF65可以桥接3′加工和拼接。未来的工作将致力于验证CFI 25和已确定的蛋白质因子之间的直接相互作用，并调查这些相互作用可能对mRNA加工的影响。

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