介绍
年龄相关性黄斑变性（AMD）导致的显著视力下降最常见的原因是病理性脉络膜新生血管、血管渗漏以及随后神经感觉视网膜中的液体积聚。这种疾病过程破坏了感光细胞和视网膜色素上皮（RPE）之间的微妙界面，RPE是一种细胞间阵列，对最佳视力至关重要。利用靶向单克隆抗体治疗对血管内皮生长因子-A的药物抑制已成为治疗这一致盲性疾病的主要方法，疗效显著。已经研究了血管内皮生长因子A靶向治疗的其他几种方式，包括通过短干扰RNA（siRNAs）沉默转录后基因，这是一种在临床前研究中显示出巨大前景的方法。然而，研究第一代靶向血管内皮生长因子-A的药物治疗新生血管性AMD的两项开创性临床试验突然停止，因为它们未能达到主要终点。其中一项试验的公开数据报告了低剂量但非高剂量的一些疗效。1在这些研究进行的同时，我们报告了一个令人惊讶的发现，即21核苷酸（nt）siRNA双链体激活了先天免疫受体Toll样受体3（TLR3）与序列或目标无关。2最近，独立报告也证实了包括控制序列在内的21-nt siRNAs可降低内皮细胞增殖并抑制血管生成体内。三,4,5
TLR是一种I型跨膜蛋白，可识别导致先天免疫反应和干扰素途径启动的病原体相关分子模式。迄今为止，已在人类中鉴定出10种功能性TLR，它们与许多感染因子中存在的特定病原体相关分子模式结合。长期以来，人们都知道病毒双链RNA（dsRNA）会诱导细胞毒性反应，但直到最近十年，这种机制才被证明是通过TLR3特异性识别dsRNA而部分介导的，6它几乎在包括特殊眼细胞类型在内的大多数组织中普遍表达。7进一步的研究表明，一种称为Toll/IL-1受体结构域适配器的细胞内蛋白与诱导干扰素-β（TRIF）密切相关8,9它可以通过核因子-κB和干扰素调节因子-3传递TLR3激活。10这种不同的信号通路在通过选择性诱导干扰素相关和细胞因子基因盒控制免疫介导的细胞类型和条件特异性TLR3激活反应中可能很重要。
冗余机制已经发展，以确保在哺乳动物免疫监测期间准确、灵敏地检测非自身dsRNA。除TLR3外，还有其他已知的dsRNA受体，包括RNA-结合蛋白激酶（PKR）、维甲酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）。RIG-I识别具有5′-三磷酸和部分双链特征的各种长度的RNA，而MDA5识别非常长的dsRNA分子（>2000-nt）。11,12暴露于长dsRNA（>40-nt）可通过配体结合的胞外结构域的多重聚合产生强大的TLR3信号，然而21-nt siRNA也可激活TLR3。13,14总之，这些数据表明，靶向21-nt siRNA的细胞效应不仅限于基因沉默，还可能通过TLR3激活及其下游信号成分诱导意外的细胞毒性。
我们之前证明了poly I:C（pIC），一种被细胞内化的合成高分子量dsRNA15并激活TLR36和其他dsRNA传感器，16诱导视网膜显著变性，大面积RPE细胞丢失，邻近感光细胞凋亡。17在本研究中，我们研究了眼内注射21-nt siRNA对视网膜的影响，并观察到一种急性细胞毒性反应，伴有依赖TLR3及其下游转录因子干扰素调节因子-3的显著RPE变性。将siRNA双链缩短为16-nt，这是一种非激活TLR3配体，显著降低了细胞毒性，这表明未来眼内RNAi治疗发展应考虑类似的缩短siRNA设计。
结果
短dsRNA和长dsRNA诱导视网膜变性
与溶媒对照组相比，在治疗后1周，玻璃体内注射化学未修饰的21-nt-siRNAs（2µg），其不是为细胞渗透而配制的，与AMD临床试验中使用的类似，均匀诱导的视网膜毒性导致大面积RPE细胞丢失和变性(). 通过比较siRNA剂量和小鼠和人类玻璃体体积（分别约7µl和4 ml，剂量为2µg和1200或1600µg）计算得出，在与上述临床试验的较高剂量（0.3–0.4µg/µl）中使用的浓度相等的浓度下观察到这种效应。相反，以萤火虫荧光素酶为靶点的16-nt siRNA（14-nt长RNA双链，2-nt悬垂，16-nt-吕克-siRNA）不激活TLR32,14在等摩尔浓度下对视网膜无毒().体内光谱域光学相干断层成像显示，视网膜外侧明显破裂，视网膜色素上皮和感光层受到急性损伤().
21-核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNAs）诱导视网膜变性。(一)玻璃体内磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照组和(b条)21吨-吕克-siRNA显示大的色素沉着区，表明视网膜色素上皮（RPE）丢失（黑色箭头，n个=四个独立实验中每组24个，P（P）通过Fisher精确检验<0.0001）。(c（c）)16-nt的管理-吕克-siRNA未诱导视网膜变性(n个=24，在四个独立实验中，P（P）< 0.0001). (d日)体内光学相干断层扫描视网膜成像显示外视网膜和RPE（用红色括号括起来）有明显破裂，21-nt吕克小核糖核酸(n个=6，在两个独立实验中）。16-nt后1周RPE平片闭塞带-1（ZO-1）免疫荧光（红色）-吕克-小干扰RNA(e（电子）)显示均匀排列的六边形细胞，但21-nt-吕克-siRNA处理(（f）)导致这种结合模式的显著破坏，细胞形态发生巨大变化(n个=4，在两个独立实验中）。棒材（d）=200µm；棒材（e，f）=20µm。
长dsRNA包括pIC和poly I:C12U（Ampligen），一种比pIC更特异的TLR3激活剂，18对视网膜有类似的影响(补充图S1a). 此外，我们发现21-nt siRNA诱导的视网膜变性与靶点或序列无关，因为其他几个未修饰的siRNA，包括与临床试验中研究的序列相同的双链RNA，也表现出类似的效果(补充图S1b和补充表S1用于序列）。21-nt siRNAs与胆固醇结合，使细胞渗透，从而获得真正的RNAi，19也会导致视网膜退化(补充图S2). 有趣的是，重复使用大剂量静脉注射21-nt稳定血清后，视网膜没有发生变性-吕克-小干扰RNA(补充图S3)这表明21-nt-siRNA不能有效穿透外血-视网膜屏障。
眼内dsRNA后RPE的破坏
RPE功能对于调节感光细胞更新和维持外血视网膜屏障至关重要，这两者对最佳视力至关重要。我们发现21-nt-吕克-siRNA诱导的RPE细胞-细胞连接的显著中断，如平悬带闭塞-1免疫荧光所示，而16-nt-吕克-siRNA没有改变RPE单层的六边形镶嵌(). 同样，全球表达增强型绿色荧光蛋白的小鼠在RPE中显示出增强的绿色荧光蛋白信号减少，核碎裂与21-nt治疗后的细胞死亡一致-吕克-小干扰RNA(补充图S4). 组织形态学分析显示，与对照组小鼠相比，RPE细胞受损，严重空泡化和色素丢失(). 超微结构研究显示，载体和16-nt中出现正常细胞-吕克-siRNA-处理的小鼠眼睛()但RPE细胞中的固缩核和吞噬体丰富，21-nt中覆盖的感光细胞阵列紊乱-吕克-siRNA组(). 玻璃体内注射21-nt后，暗视闪光视网膜电图定量的整体视网膜功能显著降低-吕克-小核糖核酸(). 总的来说，这些数据表明，短dsRNA和长dsRNA均可诱导急性和严重的RPE细胞毒作用，导致感光细胞界面的营养支持丧失，视觉功能下降，眼底镜改变类似于称为地理萎缩（GA）的晚期干型AMD。20
显微镜特征 21-核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNAs）诱导视网膜变性。治疗后1周的组织形态学评估(n个=6–8（在两个独立实验中）表明(一)16吨-吕克-siRNA没有改变正常的RPE细胞单层，而(b条)21吨-吕克-siRNA导致显著的视网膜和RPE变性，并伴有严重的色素丢失和空泡化（红色括号）。此时点的超微结构检查(n个在两个独立的实验中为4–6），在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和16-nt中显示出有序的感光细胞阵列和融合的RPE-吕克-小干扰RNA(c（c）,d日)但RPE明显改变，伴有21-nt的大空泡（星号）-吕克-小干扰RNA(e（电子）). 棒材（a–b）=20µm；（c–e），2µm。INL，内核层；ONL，外核层；POS、感光细胞外段、RPE、视网膜色素上皮。
玻璃体内21-核苷酸（nt）-短干扰RNA 给药抑制视网膜功能显示了小鼠暗视闪光视网膜电图（ERG）期间的典型波形和振幅响应。每周玻璃体内注射21-nt-吕克-与磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照组相比，共三次注射siRNA后，a波和b波振幅响应分别显著降低15.8±0.87%和13.2±0.39%(n个=在两个独立实验中每组8个*P（P）<0.05，曼·惠特尼U型测试）。
21-nt siRNA诱导的视网膜变性需要TLR3
哺乳动物的免疫系统有多个能够识别dsRNA的受体，因此我们严格研究了各种动物模型，以确定哪些是诱导这种表型所必需的。我们观察到21-nt-吕克-与等摩尔免疫球蛋白G（IgG）对照组相比，siRNA与TLR3中和抗体共同给药时，野生型小鼠或TLR3缺乏的小鼠没有引起视网膜毒性(). 然后，我们测试了是否需要激活其他细胞质dsRNA传感器，包括RIG-I、MDA-5和PKR，以实现这类效应。而用RIG-I特异性配体3p RNA处理的野生型小鼠12没有视网膜毒性的证据(补充图S5)，以及两者Mda5型–/–和脉搏波–/–用玻璃体内pIC治疗的小鼠出现类似于野生型小鼠的视网膜变性(补充图S6).
短链和长链双链RNA（dsRNA）诱导的视网膜变性需要Toll样受体-3（TLR3）。(一)一张典型的彩色眼底照片显示玻璃体内联合注射21-nt后视网膜变性-吕克-siRNA和同种免疫球蛋白G（IgG）(n个=6，在两个独立实验中）。(b条,c（c）)21吨-吕克-用中和TLR3抗体对眼睛进行预处理时，不会发生siRNA诱导的视网膜毒性(n个=两个独立实验中为6）或TLR3表达不足的小鼠(第三阶段–/–,n个=12，在三个独立实验中）。(d日)小鼠眼睛的TLR3免疫荧光显示出与视网膜色素上皮（RPE）标记物RPE65的强信号共定位(n个在三个独立实验中=3，Bar=10µm）。小鼠RPE（mRPE）细胞表面和细胞内TLR3染色的代表性直方图(e（电子）)和人类RPE（hRPE）(（f）)单元格(n个=4–5（在两个独立实验中）。nt，核苷酸。
TLR3在细胞表面表达，并与RPE中的21-nt siRNA相互作用
虽然TLR3的表达最初在细胞内的内质体样隔室中被发现，21最近的数据表明，它在许多细胞类型的表面表达。2,22,23首先，我们在未经处理的小鼠眼切片中观察到TLR3的强表达，其免疫定位于带有细胞特异性标记物RPE65的RPE(). 利用流式细胞术，TLR3在小鼠和人RPE细胞（分别为mRPE和hRPE）中的表面和细胞内定位得到证实，表明这些细胞容易受到细胞外和细胞发酵21-nt-siRNA的免疫激活(). 先前的数据强烈表明21-nt-siRNA与TLR3发生物理相互作用并激活TLR3，2,14,24但很难获得确凿的证据。因此，我们进行了竞争性结合分析和磷酸化研究以进一步研究这一点。事实上，我们观察到纯化的重组人TLR3外结构域与生物素化21-nt结合的生化证据-吕克-siRNA与受体二聚体()TLR3激活所需的过程。25TLR3结合的特异性通过使用过量未修饰21-nt的竞争试验得到证实-吕克-siRNA。除了结合21-nt-吕克-siRNA，我们还表明hRPE细胞暴露于非细胞发酵21-nt-吕克-siRNA诱导TLR3快速磷酸化(). 这些数据支持一种模型，即细胞外21-nt siRNA可以与TLR3结合并启动其细胞内信号级联。26
21核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNA）结合并激活在视网膜色素上皮（RPE）细胞表面表达的Toll样受体-3（TLR3）。(一)生物素化21-nt亲和素免疫沉淀证实了物理结合吕克siRNA，其显示＞250 kDa的TLR3免疫反应带，通过竞争测定减少(n个=3，在三个独立实验中）。(b条)暴露于21-nt后5分钟，在原代hRPE细胞中检测到TLR3磷酸化-吕克-小核糖核酸(n个=3，在三个独立实验中）。GAPDH用作装载控制。
TLR3激活导致视网膜色素上皮细胞死亡和caspase-3裂解
虽然许多机制可能导致dsRNA治疗后RPE丢失，但TLR3激活在包括RPE在内的多种细胞类型中是一种公认且有效的促凋亡刺激。17,27,28在本研究中，用pIC或21-nt处理hRPE细胞-吕克-siRNA的增殖显著降低在体外与16-nt相比-吕克-小干扰RNA(). TUNEL染色发现21-nt治疗的眼睛中晚期凋亡细胞增加-吕克-siRNA但不是16-nt-吕克-siRNA，特别是在具有波状特征的外核层区域()这是之前在其他视网膜变性动物模型中报道的一项特殊发现。29许多研究表明TLR3介导的细胞凋亡是通过caspase依赖性途径发生的。30,31,32我们发现玻璃体内注射21-nt-吕克-利用底物依赖性定量荧光分析和免疫组织化学技术，siRNA和pIC在小鼠RPE中诱导显著的caspase-3裂解(). 尽管经21-nt处理的hRPE细胞培养物中Caspase-3激活显著升高，但其活性不太稳定-吕克-siRNA或pIC（1.14±0.11，P（P）分别为车辆控制的0.07倍和1.19±0.085倍，P（P）< 0.05). 这些数据支持21-nt后caspase-dependent RPE凋亡模型-吕克-siRNA暴露。
21-核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNA）降低视网膜色素上皮（RPE）活性并增加细胞凋亡。(一)聚I:C（pIC）和21-nt-吕克-用BrdU掺入法测定siRNA显著降低hRPE细胞增殖(n个=3，在三个独立实验中）。(b条,c（c）)TUNEL染色发现21-nt组视网膜和RPE层晚期凋亡细胞数量显著增加-吕克-siRNA与16-nt的比较-吕克-24小时siRNA(n个=在两个独立实验中为6，分别为13.68±0.89%和3.70±0.25%，P（P）<0.01，曼·惠特尼U型-测试）。TUNEL+细胞核更集中于ONL/RPE（星号）的波状改变区域**P（P）<0.01和*P（P）<0.05由Mann–Whitney提供U型-测试。棒材代表平均值±SEM。棒材=20µm。
21-核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNA）诱导的Toll样受体-3（TLR3）信号传导激活视网膜色素上皮（RPE）中的caspase-3。(一)21-nt治疗后，通过荧光分析法定量小鼠RPE/脉络膜和hRPE细胞中活性裂解caspase-3-吕克-siRNA和poly I:C（pIC）与磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照的比较(n个=6，在两个独立实验中，折叠调节分别为1.56±0.11和2.05±0.39）。(b条–d日)21-nt后24小时白化Balb/C小鼠眼活性裂解caspase-3的免疫检测-吕克-siRNA或pIC在RPE细胞（黑色箭头）中显示信号增强，在神经视网膜层中显示可变染色(n个在三个独立实验中=3，Bar=20µm）*P（P）<0.05，作者：Mann–WhitneyU型-测试。条形代表平均值±SEM。siRNA，短干扰RNA。
RPE中TLR3信号通过转录因子IRF3传递
TLR3是TLR家族中唯一一个完全依赖细胞内适配器TIR域包含适配器诱导干扰素-β（TRIF）的成员。10虽然TLR4介导的信号能够通过TRIF或MyD88中继，8我们没有观察到野生型小鼠在玻璃体内注射脂多糖（250 ng和1µg，数据未显示）后出现急性RPE细胞丢失。TRIF信号通过IRF3或核因子-κB的核移位分叉。此前，我们报道了21-nt-siRNA对脉络膜新生血管的序列和靶向非依赖性抑制依赖于TRIF和下游核因子-κB信号传导。2相反，在目前的模型中，我们没有发现视网膜变性的证据红外线3–/–玻璃体内注射溶媒对照21-nt治疗的小鼠-吕克-siRNA或pIC(). 野生型小鼠的对照治疗组和pIC治疗组的组织形态学、超微结构和视网膜电图分析相似红外线3–/–小鼠(补充图S7a–f). 21-nt内-吕克-与载体对照组相比，siRNA-处理的hRPE细胞培养证实IRF3的核易位增加(). 这些数据表明IRF3易位是21-nt-siRNA诱导的视网膜变性的关键信号事件。
Toll样受体-3（TLR3）通过IRF3介导视网膜色素上皮（RPE）细胞死亡信号。(一–c（c）)红外线3–/–21-nt对小鼠的眼底无影响-吕克-小干扰RNA(d日)用21-nt处理1小时后，hRPE细胞胞质和核组分的IRF3免疫印迹显示核信号增强-吕克-小干扰RNA(n个=3，在三个独立实验中）。内务蛋白GAPDH和核仁素分别作为细胞质和核组分的负荷控制。nt，核苷酸。siRNA，短干扰RNA。
材料和方法
动物所有动物实验均由机构审查委员会和视觉与眼科研究协会批准。C57Bl/6J、C57-eGFP和第三阶段–/–小鼠购自马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室红外线3-/-（T.Taniguchi通过M.David赠送），脉搏波-/-（R.H.Silverman通过G.Luo赠送）和Mda5型-/-（科隆那M.科隆那的礼物）都已在前面描述过。对于所有程序，通过腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg；Ft.Dodge Animal Health，Ft Dodge，IA）和木聚嗪（10 mg/kg；Phoenix Scientific，St Joseph，MO）对小鼠进行麻醉，并用局部托吡卡胺（1%；Alcon Laboratories，Ft Worth，TX）扩张瞳孔。
人RPE细胞分离物对原始人类RPE（hRPE）细胞分离物（D.R.Hinton的礼物）进行已知TLR3多态性的基因分型，并用于低代（3-6）。细胞在含有10%胎牛血清（Gibco，Carlsbad，CA）和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基（高糖）中培养。在用dsRNA治疗之前，hRPE分离株在含有2%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中用干扰素-α/β（1000 U/ml，PBL干扰素来源，新泽西州皮斯卡塔韦）预处理24小时。
药物治疗siRNAs由磷酸盐缓冲盐水（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）、poly I:C（加利福尼亚州圣地亚哥InvivoGen）、poly-I:C配制而成12将U（Ampligen；Bioclones，南非开普敦）、脂多糖（InvivoGen）、中和鼠抗小鼠TLR3抗体（eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥）、同型对照IgG（eBioscience）溶解在磷酸盐缓冲盐水中，并注入总体积为1µl的玻璃体腔。对于RIG-I研究，体内使用10%NeuroPORTER（Genlantis，San Diego，CA）转染3p-RNA（1µg）。还制备了磷酸盐缓冲盐水和聚I:C对照品。使用Pico注射器（PLI-100；哈佛仪器，马萨诸塞州霍利斯顿）对小鼠进行视网膜下注射（1µl）。对于系统性研究，静脉注射聚I:C（100–300µg）或血清稳定21-nt-吕克-在第0天、第3天和第7天通过尾静脉给药siRNA（100µg）。
小干扰RNA化学siRNA序列和修饰列于补充表S1所有siRNAs均购自科罗拉多州拉斐特Dharmacon。
眼底摄影。用TRC-50 IX相机（日本东京Topcon）和3CCD数字彩色成像系统（日本东京索尼）拍摄了扩张小鼠眼睛的视网膜照片，并在Photoshop CS4（加利福尼亚州圣何塞Adobe Systems）中进行了相同的处理。
图像采集和处理所有亮场和荧光显微镜图像都是在蔡司Axio Observer Z1显微镜上采集的，带有10×/0.3、20×/0.8或63×/1.40物镜，以及使用Axiovision软件的彩色ICcR3相机（纽约州桑伍德卡尔蔡司）。切片分别安装在水或矢量架（加利福尼亚州伯林盖姆矢量实验室）中，用于亮场和荧光成像。然后将图像作为TIFF文件导出到Photoshop CS4（Adobe Systems），并进行相同的伽马调整处理。
视网膜电图小鼠整夜黑暗适应，麻醉，双眼置于ColorBurst-Ganzfeld刺激器内（E2；Diagnosys，Lowell，MA）。放置角膜电极和接地电极后，使用Espion软件（Diagnosys）提供全自动闪光强度序列，从中记录视网膜反应。确定每个闪光强度的最大a波和b波值，并比较平均值以进行统计分析。
光学相干层析成像。对小鼠进行麻醉，并使用配备30°透镜的商用光谱域OCT对眼睛进行成像（Spectralis；德国海德堡海德堡工程公司）。光谱域光学相干层析成像与cSLO在同一时间内完成，以最大限度地减少变化。对于OCT成像，我们使用了海德堡工程公司（Heidelberg Engineering）的市售Spectralis HRA+OCT器件，该器件具有∧=870 nm的宽带超发光二极管作为低相干光源。使用跟踪红外激光以每秒40000次扫描的速度采集二维B扫描，以减少眼球运动产生的斑点噪声。
组织学小鼠眼球摘除，4%多聚甲醛/3.5%戊二醛固定，2%四氧化锇后固定，乙醇脱水包埋。切割半薄（1µm）切片并用甲苯胺蓝染色。
TUNEL免疫组织化学根据制造商的建议（TACS XL；马里兰州盖瑟斯堡特雷维根）制备组织切片并进行处理。
透射电子显微镜制备乙酸铀和柠檬酸铅染色超薄切片，用于透射电子显微镜成像（Biotwin 12；荷兰阿姆斯特丹飞利浦）。
RPE形态学制备小鼠RPE/脉络膜平垫，用100%MeOH固定，并在4°C下用0.05%Triton-X的磷酸盐缓冲盐水中的1%牛血清白蛋白封闭过夜。然后用兔抗小带闭塞-1抗体（1:100；Invitrogen，Carlsbad，CA）培养平垫过夜，然后清洗和荧光二级抗体（AF594，1:1000；Invit罗gen）3小时。RPE平板支架在AxioObserver Z1荧光显微镜（卡尔蔡司）上成像。
蛋白质印迹细胞在裂解缓冲液中均质化（10 mmol/l Tris碱，pH 7.4，150 mmol/l NaCl，1 mmol/lEDTA，1 mmol/l EGTA，1%Triton X-100，0.5%NP-40，蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（瑞士巴塞尔罗氏））。使用Bradford测定试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA）以牛血清白蛋白为标准测定蛋白质浓度。蛋白质（40–100µg）在4–12%Novex Bis–Tris凝胶（Invitrogen）上运行。将转移的膜在室温下封闭1小时，并与初级抗体在4°C下孵育过夜。在室温下使用二级抗体（1:5000）1小时。该信号通过增强化学发光（ECL plus；Pierce，Rockford，IL）进行可视化，并由VisionWorksLS图像采集和分析软件（版本6.7.2，UVP；LLC，Upland，CA）捕获。
hRPE细胞活力测定将融合的早期传代hRPE细胞分离物通过隔夜血清饥饿进行同步化。90个6孔板以10000个细胞/孔的密度播种，然后用干扰素-α/β（1000 U/ml；PBL干扰素源）刺激24小时。然后用聚肌苷-多囊酰酸（高分子量聚I:C；InvivoGen）处理培养物，血清稳定21-nt-吕克-siRNA或血清稳定16-nt-吕克-siRNA。48小时后，根据制造商的说明，使用溴脱氧尿苷酶联免疫吸附试验（马萨诸塞州比勒里卡Chemicon）测量细胞活力。在450 nm处分析光密度（Synergy 4；BioTek，Winooski，VT）。
流式细胞术检测RPE表面和细胞内TLR3为了进行表面TLR3染色，用FcR块（BD，加州圣何塞）处理hRPE细胞，并用PE结合的抗人TLR3（20µg/ml；Imgenex，加州圣地亚哥）孵育。对于细胞内TLR3染色，细胞被固定并用Leucoperm（Serotec，Raleigh，NC）渗透，并在10%小鼠血清中对TLR3进行染色。PE结合小鼠IgGκ1同型作为对照（BD）。采集了至少10000个事件（LSRII；BD），并使用Kolmogorov–Smirnov统计数据（FlowJo；Tree Star，Ashland，OR）进行分析。
C57BL/6J RPE/脉络膜细胞悬浮液（106)分离并与APC抗小鼠CD31抗体（20µg/ml；BD）和PE抗小鼠CD147抗体（20μg/ml；eBioscience）孵育以鉴定CD147+CD31型-RPE细胞。为了进行表面TLR3染色，用预先偶联到Alexa Fluor 488（Invitrogen）的抗鼠TLR3（10µg/ml；明尼阿波利斯R&D Systems公司）培养细胞。对于细胞内TLR3染色，CD31/CD147标记的细胞进行固定和渗透，然后与抗小鼠TLR3（5µg/ml）孵育。荧光素异硫氰酸盐结合大鼠IgG2a同型（BD）作为对照。采集了至少50000个事件（LSRII；BD），并使用Kolmogorov–Smirnov统计数据（FlowJo）进行了分析。
TLR3免疫荧光显微镜定位将C57BL/6J小鼠眼切片（10µm）在4°C的冰镇丙酮中固定10分钟，封闭，并在4°C下与兔抗鼠TLR3（1:50；Imgenex）孵育过夜，然后再与Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（1:200；Invitrogen）孵养。按照制造商的建议（加利福尼亚州伯林盖姆Vector），使用小鼠抗鼠RPE65（1:50；Novus，Littleton，CO）孵育切片，然后使用鼠对鼠试剂盒进行异硫氰酸荧光素染色，以进行RPE的共标记。平行处理同型对照品（兔/鼠IgG；宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫Jackson ImmunoResearch）。图像是在Axio Observer Z1荧光显微镜（卡尔蔡司）上采集的。
TLR3磷酸化测定经21-nt-Luc-siRNA处理的hRPE细胞的蛋白裂解物通过十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用抗磷酸化TLR3抗体（pY759；Imgenex）进行western印迹。GAPDH用作均匀加载的控制。
siRNA-TLR3免疫沉淀.重组hTLR3（rhTLR3）和生物素化21-nt-吕克-将siRNA混合并通过UV（Spectrolinker；Spectroline，Westbury，NY）处理30分钟。为了检测交联siRNA–rhTLR3复合物，先进行链霉亲和素免疫沉淀，然后用TLR3抗体（315A；Imgenex）进行免疫印迹。竞争分析使用过量（×10）非生物素化21-nt-吕克-小干扰RNA。
IRF3核易位.21-nt后1小时从hRPE细胞质和核部分分离的总蛋白（80µg）的免疫印迹-吕克-将siRNA与初级抗体（干扰素调节因子-3；细胞信号传导，Danvers，MA；Nucleolin，Sigma；Vinculin，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）在4°C下孵育过夜。通过增强化学发光（ECL plus）观察辣根过氧化物酶偶联二级抗体。图像由VisionWorksLS图像采集（UVP）采集。
裂解的胱天蛋白酶-3的定量和定位
免疫组织化学：白化病Balb/C鼠眼(n个=3个/组）。用2%PFA固定冰冻切片（10µm）10分钟，然后用1%H孵育2哦2、2%叠氮化钠、0.1%皂苷、10 mmol/l HEPES置于厄尔氏平衡盐溶液（EBSS-皂苷）中1小时。阻断后（Dako USA，Carpintia，CA），在室温下用一级抗体（1:100；Cell Signaling，Danvers，MA）在EBSS-皂苷中孵育过夜。清洗后，用生物素化二级抗体（1:200；Vector Labs）检测30 m，用亲和素过氧化物酶孵育（ABC；Vectors）检测30m，用比色染色（DAB，Vector）检测。
荧光板分析：使用商业试剂盒（R&D Systems）检测100微克总蛋白的capase-3裂解，并按照制造商的建议在荧光板阅读器上进行分析（Synergy 4；BioTek）。
统计分析使用JMP 8.0（SAS Software，Cary，NC）分析数据，并表示为平均值±SEM。使用Mann–Whitney确定统计显著性U型Kruskal–Wallis或Fisher的精确测试P（P）< 0.05.
补充材料
图S1。TLR3激动剂和21-nt-siRNAs一致诱导视网膜变性。图S2。细胞渗透剂21-nt-siRNA也具有视网膜毒性。图S3。视网膜毒性需要眼内注射。图S4。21吨-吕克-siRNA诱导的视网膜变性抑制GFP信号。图S5。dsRNA诱导的视网膜变性不需要替代细胞质传感器RIG-I。图S6。dsRNA诱导的视网膜变性不需要交替的细胞质传感器MDA5或PKR。图S7。IRF3缺陷小鼠21-nt-siRNA诱导视网膜变性的组织学、超微结构和功能修复。表S1。siRNA序列和修饰。
