分子细胞。作者手稿;PMC 2012年12月23日提供。
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PMCID公司:PMC3246218型
美国国立卫生研究院:美国国家卫生研究院339374
线粒体丙酮酸脱氢酶激酶1的酪氨酸磷酸化对癌症代谢很重要
,1,6 ,1,6 ,1,6 ,1 ,1 ,2 ,2 ,2 ,2 ,三 ,1 ,4 ,1 ,5 ,1 ,1,*和1,*
日本麻生太郎
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
范军(Jun Fan)
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
Tae-Wook Chung先生
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
凯瑟琳·利思戈
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
徐旺
1佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院埃默里温希普癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
谢建新
2Cell Signaling Technology,Inc.(CST),马萨诸塞州丹弗斯
清远阁
2细胞信号技术公司(CST),马萨诸塞州丹弗斯
丁磊谷
2Cell Signaling Technology,Inc.(CST),马萨诸塞州丹弗斯
罗伯托·波拉基维茨(Roberto D.Polakiewicz)
2Cell Signaling Technology,Inc.(CST),马萨诸塞州丹弗斯
卓(乔治亚州)陈
1佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院埃默里温希普癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
提图斯·博根
4耶鲁大学医学院药理学系,康涅狄格州纽黑文
萨加·罗尼亚尔
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
法德洛·R·库里
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
苏敏康
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
陈静(音译)
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
1乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系
2Cell Signaling Technology,Inc.(CST),马萨诸塞州丹弗斯
三瑞士巴塞尔诺华制药公司
4耶鲁大学医学院药理学系,康涅狄格州纽黑文
5佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院药理学系
6这些作者为这项工作做出了同等贡献。
- 补充资料
1
制导:30BF9BEA-A5FC-4881-8F84-6858B7601338
总结
许多肿瘤细胞依靠有氧糖酵解而不是氧化磷酸化来持续增殖和生存。据信,Myc和HIF-1通过上调丙酮酸脱氢酶(PDH)激酶1(PDHK1)的基因表达促进了这种代谢转换,PDHK1磷酸化并使线粒体PDH失活,从而使丙酮酸脱水酶复合物(PDC)失活。在此,我们报告了酪氨酸磷酸化通过促进ATP和PDC结合来增强PDHK1激酶活性。在一些癌细胞中,功能性PDC可以在基质外的线粒体中形成,PDHK1在人类癌症中通常被定位于不同线粒体隔室的多种致癌酪氨酸激酶磷酸化。癌细胞中磷酸化缺陷的催化性低形态PDHK1突变体的表达导致缺氧条件下细胞增殖降低,氧化磷酸化增加,丙酮酸的线粒体利用增加,并降低异种移植裸鼠的肿瘤生长。总之,酪氨酸磷酸化激活PDHK1以促进Warburg效应和肿瘤生长。
简介
正常细胞通过氧化磷酸化在线粒体中生成ATP,而在缺氧条件下,葡萄糖转化为乳酸生成ATP。相反,Warburg效应描述了癌细胞比正常组织吸收更多的葡萄糖,并有利于有氧糖酵解(Kroemer和Pouyssegur,2008年;Vander Heiden等人,2009年;沃堡,1956年). 在正常细胞中,丙酮酸脱氢酶(PDH)A1催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A,后者与脂肪酸β-氧化产生的乙酰辅酶C一起进入克雷布斯循环,产生ATP和包括NADH在内的电子供体。PDHK1是一种Ser/Thr激酶,通过磷酸化PDHA1来负调控PDHA1的活性。这发生在丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)中(Roche等人,2001年). PDC围绕由乙酰转移酶(E2p)和E3-结合蛋白(E3BP)形成的60个十二面体核心组织(Hiromasa等人,2004年)结合PDH(aka E1p)、PDHK、二氢硫酰胺脱氢酶(E3)和丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDP)(Read,2001年). 在人类中发现了四种PDHK亚型(1-4)。PDHK通过与E2p/E3BP核心中E2p亚基的内脂酰(L2)结构域结合而被招募到PDC(Liu等人,1995年). 这通过允许PDHK访问其底物PDH来增强PDHK活性,PDH与E2p L2下游的E1结合域结合。PDHK对PDH的磷酸化导致PDC失活,而PDP的去磷酸化则恢复PDC活性(Roche等人,2001年).
然而,在癌细胞中,无论是否存在氧气,丙酮酸都会转化为乳酸。这可能部分是由于肿瘤细胞中PDHK活性上调和/或PDH抑制所致。据信PDHK1被Myc和HIF-1上调,通过磷酸化和灭活癌细胞中的PDH实现线粒体功能抑制(Kim等人,2007年;Kim等人,2006年;Papandreou等人,2006年). 最近的研究表明,二氯乙酸(DCA)靶向PDHK可将癌细胞代谢从糖酵解转变为氧化磷酸化,并抑制肿瘤生长(Bonnet等人,2007年). 这一发现表明PDHK/PDH轴可能有助于癌细胞代谢和肿瘤生长。
然而,致癌信号如何激活PDHK1来调节癌细胞代谢仍不清楚。在这里,我们报告了致癌酪氨酸激酶定位于癌细胞的线粒体,在那里,它们磷酸化并激活线粒体Ser/Thr激酶PDHK1,以促进癌细胞代谢和肿瘤生长。
结果
癌细胞中线粒体PDHK1被FGFR1磷酸化并激活
为了更好地理解通常在肿瘤中上调的酪氨酸激酶信号如何调节Warburg效应,我们检测了致癌FGFR1是否磷酸化并调节PDHK1(). 我们发现,活性的重组FGFR1(rFGFR1)能有效磷酸化纯化的GST-标记PDHK1在体外激酶测定(). 进一步的质谱分析确定了PDHK1的三个酪氨酸残基,包括Y136、Y243和Y244,它们被FGFR1磷酸化(; PDHK1的编号根据瑞士保护条目Q15118)。此外,GST标记的PDHK1在与FGFR1野生型(WT)瞬时共转染的293T细胞中被酪氨酸磷酸化,但在与FGFR 1共同表达激酶死亡(KD)形式的细胞中没有被酪氨酸磷酸化(). 此外,在在体外PDHK1激酶分析显示,来自共同表达FGFR1 WT而非FGFR1 KD的细胞的酪氨酸磷酸化GST-PDHK1的激酶活性增强,并有效磷酸化重组PDHA1作为底物( 上面的).
FGFR1直接磷酸化并激活PDHK1(A) PDHK1的示意图。显示了三个已鉴定的FGFR1-直接酪氨酸磷酸化位点,包括Y136、Y243和Y244。
(B) 活性重组FGFR1(rFGFR1)在酪氨酸残基处直接磷酸化纯化的GST标记的PDHK1在体外激酶分析。通过特异性磷酸化Tyr抗体(pY99)检测磷酸化rFGFR1和GST-PDHK1。
(C) 从共同表达FGFR1野生型(WT)的细胞中纯化的GST-PDHK1,但不是FGFR1激酶死亡型(KD),显示在一个在体外以重组丙酮酸脱氢酶A(rPDHA)为底物测定PDHK1激酶(上面的). Western blot显示,GST-PDHK1在FGFR1 WT共同表达的细胞中被酪氨酸磷酸化,但KD突变体没有表达(降低).
(D) TKI258对FGFR1的抑制(2小时)导致共同表达FGFR1 WT的细胞中PDHK1的酪氨酸磷酸化水平降低(左边). 同时表达FGFR1 KD和GST-PDHK1的细胞作为阴性对照。Western blot结果显示FGFR1与PDHK1及其底物PDHA1在线粒体中共定位(正确的).
(E) TKI258抑制FGFR1(2小时)导致白血病KG1a细胞(FOP2-FGFR1)PDHA1的S293磷酸化水平降低(左边)和肺癌H1299细胞(FGFR1)(正确的).
(F)左侧PDHK抑制剂DCA靶向PDHK1导致KG1a和H1299细胞中PDHA1的S293磷酸化水平降低。赖特:特定shRNA抑制PDHK1可降低H1299细胞中PDHA1的S293磷酸化水平。数字代表PDHK1特定带的相对强度(上面的)或磷酸-PDHA1(S293;降低)未经人类PDHK1(hPDHK1)shRNA处理,将其归一化为对照样品的值。
FGFR1的过度表达或其突变激活与多种人类实体瘤有关,包括乳腺癌、胰腺癌和恶性星形细胞瘤(Kobrin等人,1993年;Luqmani等人,1992年;莫里森等人,1994年;Penault-Llorca等人,1995年). 此外,涉及FGFR1号机组8p11.2-11.1基因与干细胞骨髓增生性疾病(MPD)相关,MPD导致活性FGFR1融合酪氨酸激酶的表达。我们发现,小分子抑制剂TKI258对FGFR1的抑制导致共同表达FGFR1 WT的细胞中GST-PDHK1的酪氨酸磷酸化水平降低( 左边). 在共同表达GST-PDHK1和ZNF198-FGFR1 4ZF的TKI258处理细胞中也获得了类似的结果,ZNF198-FGFR1是一种与t(8;13)(p11;q12)MPD相关的活性融合酪氨酸激酶(肖等人,1998年) (图S1). 有趣的是,免疫印迹结果显示FGFR1作为一种受体酪氨酸激酶与PDHK1及其底物PDHA1在线粒体中共定位( 正确的). 此外,TKI258治疗显著降低了携带FOP2-FGFR1融合蛋白的人髓系白血病KG1a细胞中S293处PDHA1的磷酸化水平(Gu等人,2006年) (;左边)和肺癌NCI-H1299细胞过度表达FGFR1(Marek等人,2009年) (;正确的). 与此相一致,PDHK抑制剂二氯乙酸(DCA)或shRNA靶向PDHK1导致FGFR1表达的癌细胞中PDHA1的S293磷酸化水平降低().
FGFR1通过多个酪氨酸位点的直接磷酸化激活PDHK1,促进ATP和PDC与PDHK1的结合
我们接下来发现,与rFGFR1孵育导致GST-PDHK1 WT的酪氨酸磷酸化水平和激酶活性增加F突变体,Y136、Y243或Y244的替代减弱了PDHK1激酶活性的FGFR1依赖性增加,该活性通过PDHA1蛋白的S293磷酸化水平评估,而Y243和Y244双重突变则取消了FGFR1对PDHK1的增强激活().
FGFR1依赖性酪氨酸磷酸化通过促进ATP和PDC结合激活PDHK1(A) 用小球将GST-PDHK1蛋白拉下,用蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)处理,然后用活化的rFGFR1处理。然后将珠粒与重组PDHA1在在体外激酶分析。免疫印迹法检测PDHA1的S293磷酸化(左边).赖特面板表示磷酸化PDHA1 E1α特定谱带的相对强度,这些谱带归一化为对照样品(GST-PDHK1 WT)的值,而不使用rFGFR1处理。
(B) PDHK1结构的卡通表示(PDB ID:2Q8G)(Kato等人,2007年)使用Pymol制成(网址:www.pymol.org). Y243和Y244靠近ATP盖(蓝色),并预测ATP结合的位置(以AMP-PNP结合的二聚体PDHK4结构PDB ID:2E0A为模型,灰色)。Y136更接近于AZD7545(绿色),后者是一种PDHK1抑制剂,可破坏功能性丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)的形成。
(C) FGFR1在Y243或Y244处磷酸化,而不是在Y136处磷酸化导致与PDHK1的ATP结合增加。从转染的293T细胞裂解物中用珠拖出GST-PDHK1变体,并与活性rFGFR1孵育,然后与[α]孵育-32P] ATP。未绑定的[α-32P] ATP被冲走。保留[α-32P] PDHK1上的ATP用闪烁计数器测量。
Y136(D)、Y243和Y244(E)的(D-E)FGFR1依赖性磷酸化促进PDHK1与PDC的结合。用小球将GST-PDHK1变异体拉下并与活性rFGFR1孵育,然后与293T细胞的全细胞裂解物孵育。免疫印迹法检测结合PDC E2蛋白和PDHA1 E1α蛋白。上部面板显示了一个典型实验的免疫印迹结果。下部面板显示了两个独立实验的总结结果,这两个实验代表了PDHA1 E1α和PDC E2与PDHK1结合的特定带的相对强度,这些带在不使用rFGFR1处理的情况下被归一化为对照样品的值。误差条表示平均值+/-SD。
如所示,PDHK1的晶体结构显示Y243和Y244靠近ATP盖和ATP结合位点,表明这些残基的磷酸化可能会影响ATP结合和PDHK1催化活性。相反,Y136位于PDHK1的ATP和底物结合位点的远端,但更接近小分子药物AZD7545的结合位点,该药物通过终止激酶与丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)支架的结合来抑制PDHK1和3(Kato等人,2007年). 事实上,与rFGFR1孵育导致[α-32P] ATP与PDHK1 WT和Y136F突变体的结合。相反,替代Y243和/或Y244可消除FGFR1依赖的ATP结合PDHK1的增强(). 为了确定Y136磷酸化是否影响PDHK1与PDC的结合,我们在在体外激酶分析,然后与293T细胞的全细胞裂解物孵育。FGFR1对PDHK1 WT的磷酸化导致PDHK1和PDC E2蛋白之间的结合增加,以及PDHK1与PDC中存在的底物PDHA1之间的结合增强。相反,在rFGFR1存在的情况下,Y136的替代消除了PDHK1与PDC E2蛋白或PDHA1的增强关联().
有趣的是,Y243和/或Y244的替代也导致FGFR1依赖性增加的PDHK1/PDC E2和PDHK1/PDHA1相关性的消失(). 这些结果共同表明,可能需要Y243和Y244的磷酸化,而不是Y136的磷酸化来促进ATP与PDHK1的结合,从而促进PDHK1与PDC支架的结合以接触底物PDHA1。相反,Y136磷酸化可能只会增强PDHK1和PDC之间的结合。图S2显示了用糜蛋白酶进行有限蛋白水解消化时蛋白质相对稳定性的分析结果(Kang等人,2007年)这表明每个突变蛋白的整体结构没有改变,激酶活性降低()PDHK1 Y→F突变体的ATP/PDC结合能力不是由于结构改变。
FGFR1磷酸化癌细胞线粒体PDHK1(A-B)PDHK1 Y243由rFGFR1在在体外激酶分析(A)和在表达FGFR1(B)的细胞中,通过特异性识别PDHK1磷酸化Y243的抗体检测。
(C) 免疫印迹显示TKI258在肺癌H1299细胞中靶向FGFR1(左边)或白血病KG1a细胞(正确的)降低PDHK1 Y243的磷酸化。
(D) 慢病毒shRNA在H1299细胞中连续48小时敲除FGFR1导致PDHK1 Y243和PDHA1 S293的磷酸化水平降低。
(E) Western blot结果显示FGFR1与PDHK1及其底物PDHA1在KG1a线粒体中共定位(左边)和H1299(正确的)细胞。
(F) 免疫印迹结果显示FGFR1定位于线粒体,线粒体COX IV和细胞溶质β-肌动蛋白作为KG1a的对照标记(左边)和H1299(正确的)细胞。
(G) 免疫荧光分析显示FGFR1与线粒体标记物MitoTracker®线粒体选择性染料共定位,但与核标记物DAPI在H1299细胞中不共定位(左上角). shRNA对FGFR1的敲除(右侧面板)导致FGFR1的线粒体定位降低(下左).
癌基因FGFR1定位于癌细胞线粒体中,磷酸化PDHK1
使用特异性识别PDHK1磷酸化-Y243的抗体,我们观察到rFGFR1和FGFR1 WT在Y243处磷酸化GST-PDHK1 WT、Y136F和Y244F突变体,但在在体外利用重组蛋白进行激酶测定()在293T细胞中共同表达这些PDHK1变异体()分别是。我们还观察到,TKI258抑制FGFR1可降低表达FGFR1的H1299肺癌细胞中PDHK1 Y243磷酸化(,左边)和KG1a白血病细胞(,正确的). TKI258不抑制在体外激酶测定(图S3A). 此外,shRNA在H1299细胞中敲低FGFR1 48小时会导致PDHK1 Y243和PDHA1 S293的磷酸化水平降低(). 关于长期敲除FGFR1后H1299细胞中PDHK1蛋白水平降低的进一步讨论,请参阅讨论部分。
我们还检测到线粒体中FOP2-FGFR1融合和FGFR1以及线粒体PDHK1和PDHA1的一部分()分别在KG1a和H1299细胞中,以线粒体COX IV和胞浆β-肌动蛋白作为对照标记().图S3B和3C线粒体部分无质膜或核污染。与这些观察结果一致,免疫荧光分析结果表明,FGFR1与控制线粒体标记物MitoTracker®线粒体选择性染料共定位,但与核标记物DAPI在H1299细胞中没有共定位(和图S4A).图S4BFGFR1抗体与MitoTracker®线粒体选择性染料之间无交叉反应。此外,shRNA敲低FGFR1导致H1299细胞中FGFR1的线粒体定位降低()而用FGFR1配体bFGF刺激细胞不会显著改变FGFR1线粒体定位(图S4C).
我们通过免疫金透射电镜(TEM)进一步研究了FGFR1的超微结构定位。在H1299细胞的线粒体中发现了特异性免疫金颗粒。当省略主要抗FGFR1抗体时,未观察到这种免疫金粒子分布(,左边)并且被FGFR1 shRNA大大减少(,正确的). 为了在线粒体内进行FGFR1的生化定位,我们对H1299和KG1a细胞的高纯度线粒体进行了亚分离。亚组分的Western blot分析表明,全长FGFR1和FOP2-FGFR1融合酪氨酸激酶主要存在于线粒体外膜(Om)中(). 我们还观察到PDHK1和PDHA1均存在于线粒体基质(Ma)、膜间隙(IMS)和Om中。详细讨论见讨论部分。为了确定FGFR1和FOP2-FGFR1融合是否整合在Om中,我们分别使用H1299和KG1a细胞的纯化线粒体进行蛋白酶K保护试验。对照组包括外膜标记物Tom 40和内膜标记物COX IV。如所示在Triton X-100存在和不存在的情况下,Tom 40通过蛋白酶K处理完全消化,而蛋白酶K仅在线粒体通过Triton X-100-处理溶解后才完全消化COX IV。我们发现,与Tom 40类似,在Triton X-100存在和不存在的情况下,全长FGFR1均被蛋白酶K完全消化。相反,在没有Triton X-100的情况下,FOP2-FGFR1仅被蛋白酶K部分消化,并且在线粒体被Triton X-10溶解后观察到FOP2-FGFR1完全消化。线粒体FGFR1和一部分FOP2-FGFR1可能整合在线粒体Om中,而其余的线粒体FOP2-FGFR1可能位于线粒体内,可能位于IMS中,但与某些未知Om蛋白相关。
FGFR1定位于线粒体外膜,癌细胞基质外的线粒体可形成功能性PDC(A) 透射电镜下FGFR1在H1299细胞中的线粒体定位。左侧面板显示无一级抗体的对照组。中部面板显示FGFR1在H1299细胞线粒体中的定位,箭头表示线粒体FGFR1的典型染色。赖特面板显示了shRNA击倒FGFR1的对照。比例尺:0.5μm。
(B) 肺癌H1299和白血病KG1a细胞线粒体外膜中全长FGFR1和FOP2-FGFR1融合酪氨酸激酶的定位。Tom40、Cyto C、复合物I 39-kDa蛋白和MnSOD分别是线粒体外膜(Om)、膜间隙(IMS)、内膜(Im)和基质(Ma)的标记物。
(C) 蛋白酶K保护实验,在Triton X-100存在和不存在的情况下用蛋白酶K处理分离的线粒体,然后进行Western blot。
(D-E)左侧:PDC介导的转换活动14C-标记丙酮酸14C标记CO2在H1299细胞(D)和KG1a细胞(E)的Om、IMS和Ma等线粒体亚组分中检测到。误差条表示平均值+/-SD。赖特:蛋白质印迹结果显示PDHA1(E1)、E2、E3和E3BP在指示的线粒体亚组分中的表达水平。标记物包括Tom40、Cyto C和MnSOD。
在一些癌细胞中,功能性PDC可以在基质外的线粒体中形成,PDHK1通常在这些细胞的Y243被各种致癌酪氨酸激酶磷酸化
此外,我们检测了线粒体Om和IMS中的PDC活性和各种PDC成分,以及H1299和KG1a细胞中的基质()。这些结果表明,致癌FGFR1可能通过磷酸化癌细胞Om中的PDHK1来抑制PDC。讨论部分提供了详细的讨论。
我们发现,PDHK1在与各种组成活化酪氨酸激酶突变体相关的多种造血癌细胞系中的Y243处磷酸化,包括HEL(JAK2 Val617Phe突变体)、KG1a(FOP2-FGFR1)、K562(BCR-ABL)和Mo91(TEL-TrkC),而FLT3内串联重复(ITD)突变阳性Molm14和Mv4中Y243磷酸化水平相对较低;11个细胞,但在EOL-1(FIP1L1-PDGFRA)细胞中未检测到。S293的PDHA1磷酸化水平通常与这些白血病细胞中PDHK1 Y243磷酸化水平相关(). PDHK1的Y243磷酸化也在各种人类实体瘤细胞系中检测到,包括肺癌H1299(FGFR1;)以及A549细胞和乳腺癌MCF-7细胞,但不是乳腺癌MDA-MB435细胞和前列腺癌PC3和DU145细胞(). 然而,这些实体瘤细胞中S293处PDHA1的磷酸化水平与PDHK1 Y243磷酸化水平无关(). 详细讨论如下。
PDHK1的Y243通常被定位于癌细胞线粒体的致癌酪氨酸激酶磷酸化(A) 免疫印迹法检测不同癌细胞中PDHK1的Y243磷酸化。显示了PDHA1在S293的磷酸化水平的Western blot结果。
(B-D)活性、重组ABL(B)、JAK2(C)和FLT3(D)直接磷酸化相应的Y243处PDHK1在体外激酶分析。
(E) 免疫印迹显示伊马替尼在K562细胞中靶向BCR-ABL(左边),HEL细胞中JAK2由AG490(中间的)或Mv4中TKI258的FLT3-ITD;11个单元格(正确的)降低PDHK1 Y243的磷酸化。
(F) 免疫印迹结果显示BCR-ABL(左边),JAK2(中间的)和FLT3(正确的)定位于线粒体,线粒体COX IV和细胞溶质MEK1分别作为白血病K562(BCR-ABL)、HEL(JAK2)和Molm14(FLT3)细胞的对照标记物。细胞质中也检测到BCR-ABL和JAK2,但未检测到FLT3。整合素β1和PARP分别是质膜和细胞核的标志物。
(G) 亚分馏结果表明,BCR-ABL和JAK2定位于K562和HEL细胞的线粒体基质中(左边和中间的FLT3定位于Molm14细胞的线粒体外膜(正确的). Tom40、Cyto C、复合物I 39-kDa蛋白和MnSOD分别是线粒体外膜(Om)、膜间隙(IMS)、内膜(Im)和基质(Ma)的标记物。
接下来我们发现活性重组ABL(),JAK2()和FLT3()也在Y243直接磷酸化PDHK1在体外使用重组蛋白进行激酶分析,而EGFR磷酸化PDHK1的效率较低(图S5A). 伊马替尼抑制BCR-ABL,AG490抑制JAK2,TKI258抑制FLT3-ITD,导致相关人类肿瘤细胞系PDHK1的Y243磷酸化降低(;左,中和正确的)。此外,免疫印迹结果证实了BCR-ABL、JAK2和FLT3的线粒体定位()与线粒体中的PDHK1及其底物PDHA1共定位(图S5B)在相关的人类白血病细胞系中。此外,对K562、HEL和Molm14白血病细胞高纯度线粒体亚组分进行了Western blot分析(;左,中和正确的表明一部分细胞质BCR-ABL和JAK2蛋白主要存在于线粒体基质中,而一部分受体酪氨酸激酶FLT3主要存在于细胞线粒体外膜中。这些致癌酪氨酸激酶也与PDHK1和PDHA1共同定位在相关人类白血病细胞系中相应的线粒体亚组分中,其中这些酪氨酸激酶可能磷酸化PDHK1。一直以来,除了所有这些细胞的基质外,线粒体Om和IMS中也检测到PDC活性(图S5C-5E).
癌细胞中存在催化活性较低的小鼠PDHK1 Y134F和Y239/240F突变体,导致缺氧条件下细胞增殖降低,氧化磷酸化增加
我们接下来生成了如前所述的“救援”细胞系(Hitosugi等人,2009年)通过RNAi介导的内源性人类PDHK1(hPDHK1)的稳定敲除和标记小鼠PDHK1的WT或相应的Y134F和Y239/240F突变体的拯救表达(). Flag-mPDHK1 WT和Y134F突变体(而非Y239/240F突变体)在H1299细胞中的FGFR1在Y239(对应于人类PDHK1编号中的Y243)被磷酸化(图S6A). 此外,与mPDHK1野生型细胞相比,Y134F和Y239/240F突变体的激酶活性降低,导致Y134F及Y239/240野生型细胞中PDHA1在S293的磷酸化水平分别降低(图S6B). 此外,尽管缺氧导致PDHK1表达增加和Y243磷酸化水平升高(图S6C)在常氧和缺氧条件下,不同的拯救细胞中均未检测到内源性hPDHK1蛋白水平,这表明shRNA介导的hPDHK 1敲低在缺氧条件下的效果没有改变(图S6D).
在H1299细胞中表达催化活性较低的小鼠PDHK1突变体,包括Y134F和Y239/240F,导致缺氧条件下增殖降低和氧化磷酸化增加(A) 免疫印迹显示,shRNA-介导的慢病毒转导在H1299细胞中稳定敲除内源性人类PDHK1(hPDHK1),并拯救包括WT、Y134F突变体和Y239/240F双突变体在内的标记小鼠PDHK1蛋白的表达。mPDHK1的Y134、Y239和Y240分别对应于hPDHK1中的Y136、Y243和Y244。
(B) 在H1299细胞中拯救表达mPDHK1 Y134F或Y239/240F突变体会导致在缺氧条件下(1%氧气)细胞增殖率降低,但在正常氧气张力下(常氧;17%氧气)细胞的增殖率不会低于表达mPD香港1 WT的细胞。细胞增殖通过接种后48小时和96小时每个细胞系的细胞数来确定(n=3;*:0.01<第页<0.05). 误差条表示平均值+/-SD。
与表达mPDHK1 WT的细胞相比,(C-E)Y134F和Y239/240F挽救细胞的耗氧率(C)显著升高,在常氧(D)下细胞内ROS生成增加,在常压(E)下乳酸生成显著降低。在乳酸测定之前,培养基与细胞培养1小时。误差条表示平均值+/-SD。
(F-G)与表达mPDHK1 WT的细胞相比,寡霉素处理导致Y134F和Y239/240F拯救细胞中ATP生成的抑制作用增强(F),增殖的降低(G)。误差条表示平均值+/-SD。
(H-I)从表达mPDHK1 Y239/240F的救援细胞中分离的线粒体显示丙酮酸消耗率(H)和PDC介导的转化率显著增加14C-标记丙酮酸盐进入14C标记CO2(一) 与从WT拯救细胞中分离的线粒体相比。误差条表示平均值+/-SD。
我们还观察到,在常压氧条件下,用任何mPDHK1变异体挽救的细胞显示出比亲代细胞更高的增殖率,亲代细胞中内源性hPDHK1被稳定敲除。然而,Y134F和Y239/240F挽救细胞在缺氧条件下的增殖速度明显低于mPDHK1 WT挽救的细胞(). 此外,与mPDHK1 WT拯救的细胞相比,Y134F和Y239/240F拯救细胞以及内源性hPDHK1稳定敲除的亲本细胞耗氧率更高()细胞内活性氧(ROS)生成增加()减少乳酸生成(). 此外,寡霉素(线粒体ATP合成酶的一种特异性抑制剂)的治疗导致了对内源性hPDHK1和表达Y134F和Y239/240F突变体的拯救细胞稳定击倒的亲代对照H1299细胞中ATP生成的抑制增加和增殖率降低,与mPDHK1 WT细胞相比()。这些结果共同表明,与具有mPDHK1-WT的细胞相比,表达催化活性较低的mPDHK1-突变体(包括Y134F和Y239/240F)的细胞更多地依赖氧化磷酸化来产生ATP和细胞增殖。
PDHK1的酪氨酸磷酸化对PDC介导的丙酮酸代谢很重要,可能通过抑制PDHA1的磷酸化
丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)有助于丙酮酸脱羧,其中丙酮酸转化为乙酰辅酶A和二氧化碳。为了确定PDHK1的酪氨酸磷酸化在调节PDC活性中的作用,我们使用高纯度线粒体进行了丙酮酸消耗实验,与WT拯救细胞分离的线粒体相比(). 此外,我们通过评估PDC介导的丙酮酸转化为CO的速率来检测PDC活性2。如所示,从表达mPDHK1 Y239/240F突变的细胞中分离的线粒体转化率显著增加14C-标记丙酮酸到14C标记CO2与从WT拯救细胞中分离的线粒体相比。这些数据表明,PDHK1的酪氨酸磷酸化可能通过磷酸化PDHA1在调节PDC活性中发挥重要作用。
接下来,我们试图确定PDHA1在PDHK1调节癌细胞代谢中的作用。如所示mPDHK1 WT或Y239/240F突变株的H1299拯救细胞中PDHA1 WT的表达或活性、缺磷突变株S293A的表达导致O2消费率。相反,mPDHK1 WT拯救细胞表达一种磷酸化、催化活性较低的PDHA1形式(S293D),其O增加较少2与表达PDHA1 WT或S293A突变体的细胞相比,PDHA1 S293D突变体的表达,而不是PDHA1 TT或S293 a突变体,导致O的显著降低2mPDHK1 Y239/240F在H1299救援电池中的消耗。此外,在mPDHK1 Y239/240F的挽救细胞中PDHA1 WT、S293A或S293D突变体的表达并不影响细胞在常压下的增殖。然而,PDHA1 S293D突变体的表达,而不是WT或S293A突变体,导致mPDHK1 Y239/240F救援细胞在细胞增殖方面对缺氧的敏感性降低(). 此外,转染PDHA1 S293D突变体的mPDHK1 Y239/240F拯救细胞的乳酸生成增加()以及对寡霉素处理的敏感性降低,寡霉素是ATP合成酶的抑制剂,涉及ATP的产生和细胞增殖(与转染PDHA1 WT或S293A突变体的细胞相比。这些数据以及表明mPDHK1 Y239/240F的拯救表达使细胞更加依赖于氧化磷酸化,而非活性的磷酸化PDHA1 S293D突变体的表达减弱了这种代谢开关。
PDHK1的磷酸化依赖性激活是通过PDHA1磷酸化和失活介导的,这对异种移植裸鼠的肿瘤生长很重要(A) PDHA1 S293D突变体的表达,但不表达PDHA1 WT或S293A(降低)导致O显著降低2mPDHK1 Y239/240F在H1299救援电池中的消耗量,但在WT救援电池中没有(上面的).
(B-E)在mPDHK1 Y239/240F的挽救细胞中PDHA1 WT、S293A或S293D突变体的表达不影响正常氧条件下的细胞增殖(B;左边); 然而,PDHA1 S293D突变体的表达,而不是WT或S293A突变体,导致mPDHK1 Y239/240F救援细胞在细胞增殖方面对缺氧的敏感性降低(B;正确的)增加乳酸生成(C),降低对寡霉素治疗的ATP水平(D)和细胞增殖(E)的敏感性。误差条表示平均值+/-SD。
(F)左侧:显示了一只典型裸鼠(#1743)的解剖肿瘤(用红色箭头表示),该裸鼠左翼注射了mPDHK1 WT H1299细胞,右翼注射了Y239/240F H1299。赖特:Flag-mPDHK1 WT和Y239/240F的表达,以及肿瘤裂解物中PDHK1和PDHA1的磷酸化水平。
(G) 与mPDHK1 WT细胞相比,Y239/240F拯救细胞在异种裸鼠体内的肿瘤形成显著减少(第页值由配对学生的t吨测试)。
肿瘤细胞中mPDHK1 Y239/240F突变体的表达导致异种裸鼠肿瘤生长减少
接下来我们进行了异种移植实验,在裸鼠体内注射Flag-mPDHK1 WT和Y239/240F拯救H1299细胞(图S7A). 每只小鼠注射1000万个细胞(左侧为Flag-mPDHK1 WT拯救细胞,右侧为Y239/240F细胞;n=10),并在5周内监测小鼠的肿瘤生长。与Flag-mPDHK1 WT拯救细胞形成的肿瘤相比,来自Y239/240F拯救细胞的肿瘤质量显著减少().
讨论
我们的发现是酪氨酸磷酸化激活PDHK1,这至少可以部分解释癌细胞线粒体功能减弱的原因(Kim和Dang,2006年). 这可能代表了白血病和实体瘤中Warburg效应的一种常见短期分子机制,以及慢性变化,包括上调PDHK1基因表达以实现线粒体抑制,相信这是由包括Myc和HIF-1在内的转录因子调节的。
一个有趣的观察是,包括FGFR1和FLT3在内的一部分受体酪氨酸激酶主要存在于线粒体外膜中,而一部分细胞质酪氨酸激酶BCR-ABL和JAK2存在于线粒体基质中。然而,我们还观察到一部分细胞质融合酪氨酸激酶FOP2-FGFR1主要存在于线粒体Om中。令人惊讶的是,蛋白酶保护试验的结果表明FGFR1可能整合在线粒体Om内,而FOP2-FGFR1也可能存在于线粒体内,可能存在于IMS中,但与某些Om蛋白相关,显示出线粒体Om的主要亚定位。这些发现共同表明致癌酪氨酸激酶的新作用,其可能定位于线粒体并通过磷酸化线粒体蛋白发挥作用。FOP2-FGFR1、BCR-ABL、FLT3-ITD和JAK2 V617F具有组成活性且不依赖配体。我们检测到线粒体全长FGFR1在H1299细胞中酪氨酸磷酸化,表明线粒体FGFR1具有基础水平的酪氨酸激酶活性,可能是配体独立的(Kang和Chen,未发表数据)。需要进一步研究以确定这些致癌酪氨酸激酶的线粒体定位区域,以及线粒体亚定位差异的分子机制以及对线粒体生物学和癌细胞代谢的贡献。
我们还观察到,在测试的人类癌细胞中,PDHK1和PDHA1都存在于Om和IMS中,在某些情况下,除了线粒体基质外,还存在于内膜中。Om亚定位可能是由于PDHK1与PDHA1与一些外膜蛋白结合所致。事实上,我们观察到PDHK1与催化活性的FGFR1 WT相互作用,而当PDHK1和FGFR1激酶死亡突变体(KD)共同表达时,PDHK1-FGFR1相互作用减少,这表明FGFR1和PDHK1之间的相互作用可能需要酪氨酸激酶活性(图S7B). 此外,在所有测试的癌细胞系中,除了基质外,还检测到线粒体外膜和膜间隙中的PDC活性和各种PDC成分(,图S5C-5E). 这表明PDC可以在基质外形成。此外,Om中含有致癌酪氨酸激酶的癌细胞,包括H1299(FGFR1)、KG-1a(FOP2-FGFR1)和Molm 14(FLT3-ITD),与基质相比,Om的PDC活性相对较低,而基质中含有致癌性TK的癌细胞包括K562(BCR-ABL)与Om相比,HEL(JAK2 V617F)在基质中的PDC活性较低。这些数据表明,尽管不同的致癌TK在癌细胞线粒体的不同部位存在差异,它们可能通过抑制相关线粒体隔室中的PDC活性,以类似的方式调节癌症代谢。然而,由于PDC及其产物NADH和乙酰辅酶A的线粒体分区不同,这些细胞中减弱的PDC活性如何促进癌细胞代谢可能会有所不同。这些发现也值得进一步研究,以确定基质外的功能性PDC活性如何有助于丙酮酸脱羧作用,从而促进线粒体功能和代谢。
磷酸化影响PDHK1功能的结构机制仍有待确定,但Y243和Y244的接近性表明ATP盖的动力学发生了变化,因此ADP/ATP结合特性也发生了变化。利用结构生物学技术进一步研究这些残基磷酸化的原子级效应将非常重要。有趣的是,在PDHK1 Y243磷酸化不可检测的EOL-1、MDA-MB435、PC3和DU145细胞中检测到PDHA1被S293磷酸化。由于PDHK1 WT蛋白经PTP处理后仍保持基本水平的激酶活性()这可能表明,这些细胞可能依赖PDHK1蛋白表达水平进行PDHA1磷酸化,而不是依赖酪氨酸磷酸化激活PDHK1。也可能是这些细胞中丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDP)活性相对较低,其通过去磷酸化PDHA1发挥作用,或者PDHK的亚型(PDHK1除外)可能负责这些细胞中PDHA1的磷酸化。相反,MCF-7细胞PDP1的蛋白表达水平较高(图S7C)这解释了为什么MCF-7细胞具有高水平的PDHK1磷酸化,但PDHA1磷酸化水平较低。
我们的研究结果表明,PDHK1可能是癌症治疗的一个治疗靶点,因此抑制PDHK1可以影响癌细胞代谢并导致肿瘤退化。这些发现与之前的观察结果一致,即小分子抑制剂DCA靶向PDHK可通过A549肺癌细胞抑制癌细胞增殖和肿瘤生长(Bonnet等人,2007年). 然而,作者报告称,通过特定siRNA靶向PDHK2,而非对照干扰siRNA,模拟DCA对A549细胞的作用。需要进一步研究以确定不同PDHK亚型在癌细胞代谢和肿瘤生长中的不同作用。
我们以前报道过致癌酪氨酸激酶,包括FGFR1磷酸化和抑制PKM2来调节癌症代谢(Hitosugi等人,2009年). PKM2和PDHK1的酪氨酸磷酸化依赖性调节都有助于癌细胞从氧化磷酸化到有氧糖酵解的代谢转换。有趣的是,我们发现PKM2的Y105磷酸化在调节PDHK1基因表达中很重要;与表达mPKM2 WT的细胞相比,表达FGFR1的H1299肺癌细胞中PDHK1的mRNA和蛋白水平显著降低,内源性人类PKM2被稳定击倒,小鼠PKM2 Y105F突变体被拯救表达(Hitosugi和Chen,未发表数据)。这部分解释了shRNA-介导的FGFR1长期敲除导致H1299细胞PDHK1蛋白水平下降的原因(). 这些发现表明FGFR1在癌症代谢中调节PDHK1中具有双重作用,包括FGFR1磷酸化PKM2以促进PDHK1基因表达的长期机制和FGFR1通过多个位点的酪氨酸磷酸化激活PDHK1的短期机制。PKM2的Y105磷酸化参与FGFR1调节的PDHK1表达,似乎是癌细胞代谢中FGFR1依赖性磷酸化和PDHK1激活之前的上游事件。
实验程序
免疫荧光显微镜、透射电镜和线粒体亚组分分析
对于免疫荧光显微镜,用MitoTracker Red CMXRos(Invitrogen)对接种在玻璃盖玻片上的细胞进行线粒体染色,然后固定在PHEMO缓冲液中,然后用10%的山羊血清(Invitorgen)封闭。细胞在含有5%山羊血清的PBS中与FGFR1一级抗体孵育,然后在含有5%羊血清的PBS-中与Alexa Fluor 488(Invitrogen)偶联的山羊抗兔IgG孵育。细胞在PBS中清洗,安装,并在蔡司LSM510 META共焦显微镜上成像。FGFR1的免疫金标记如前所述(Yi等人,2001年). 按照She等人的描述进行线粒体亚分离(她等人,2011年).
线粒体丙酮酸消耗量和[1-14C] -丙酮酸盐转化测定
线粒体对丙酮酸的利用如前所述(奥尔森,1971年). 简单地说,将分离的线粒体与线粒体再悬浮缓冲液混合,然后离心和丙酮酸测定。在含有20 mM Hepes、pH 7.2、0.05%BSA、20μM NADH和重组LDH(0.01 mg/ml)的反应缓冲液中进行检测。丙酮酸浓度是通过使用荧光分光光度计(例如340nm;em.460nm)测量NADH氧化引起的荧光降低来确定的。[1-14C] -丙酮酸转化试验按所述进行(Pezzato等人,2009年). 简要地,14一氧化碳2使用线粒体再悬浮缓冲液(1ml)中分离的线粒体(1mg)测量PDC的产量,该缓冲液含有[1-14C] -丙酮酸(0.1μCi/ml)。将培养混合物放置在带有橡胶塞的小瓶底部,并保持搅拌状态。这个14一氧化碳2孵育过程中产生的氢玻璃胺被放置在小瓶的eppendorf管中。1小时后用0.5 ml 50%TCA阻断反应。TCA注射20分钟后,将氢氧化钠中的所有样品与5 ml闪烁液一起转移到微型容器中,并在闪烁计数器上测定放射性。根据以BSA为标准的Bradford法测定的线粒体蛋白质水平,对结果进行了标准化。
异种移植研究
裸鼠(nu/nu,6-8周龄雌性,Harlan Labs)皮下注射1×107H1299细胞稳定表达mPDHK1 WT和Y239/240F突变体,同时分别稳定敲低左侧和右侧的内源性PDHK1。每隔2至3天评估肿瘤形成情况。通过使用公式4π/3×(宽度/2)测量5周内肿瘤的两个垂直直径来记录肿瘤生长2×(长度/2)。在实验终点采集肿瘤并称重,比较每只小鼠两侧的肿瘤质量(g)。使用配对学生的t吨测试。
集锦
PDHK1的酪氨酸磷酸化增强其激酶活性
肿瘤细胞中线粒体致癌酪氨酸激酶磷酸化PDHK1
功能性PDC可在某些癌细胞基质外的线粒体中形成
PDHK1的酪氨酸磷酸化促进肿瘤生长
致谢
我们感谢香农·埃尔夫对手稿的批判性阅读。我们感谢洪毅在电子显微镜方面的帮助。这项工作得到了NIH拨款CA120272和CA140515(J.C.)的部分支持。根据合同号HHSN261200800001E(H.F.),由国家癌症研究所、国家卫生研究院提供联邦基金。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策,提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。J.X.、Q.G.、T.-L.G.和R.D.P.是Cell Signaling Technology,Inc.的员工。J.L.R.是诺华制药公司的员工。T.H.是美国血液学会的研究员学者。Z.G.C.、H.F.、F.R.K.、S.K.和J.C.是佐治亚癌症联盟杰出癌症学者。S.K.是罗宾斯学者。S.K.和J.C.是美国癌症学会基础研究学者。S.K.是白血病和淋巴瘤学会的特别研究员,J.C.是白血病和淋巴瘤学会的学者。
脚注
补充信息补充信息包括详细的实验程序和七幅图。
出版商免责声明:这是一份未经编辑的手稿的PDF文件,已被接受出版。作为对客户的服务,我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前,将进行编辑、排版和校对。请注意,在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误,适用于该期刊的所有法律免责声明都适用。
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