条件性破坏IκB激酶2不能防止肥胖诱导的胰岛素抵抗

摘要

介绍

NF-κB在炎症和免疫反应中起关键作用(1). 在未经刺激的细胞中，NF-κB二聚体与抑制蛋白IκB结合，从而保留在细胞质中。在对细胞刺激的反应中，主要通过促炎细胞因子如TNF-α，一种多亚单位蛋白激酶，IκB激酶（IKK）被激活(2). 然后，IKK磷酸化IκB N末端的两个丝氨酸残基，从而靶向IκB，使其被26S蛋白酶体快速降解。IκB的降解使NF-κB二聚体转移到细胞核并激活靶基因的转录(三).

IKK复合体由两个催化亚单位IKK1和IKK2以及一个调节亚单位NEMO/IKKγ组成，是NF-κB介导的先天免疫和炎症反应的主要调节器。在这两个催化亚单位中，只有IKK2对NF-κB在炎症刺激反应中的活化至关重要。因此，纯合IKK2缺陷小鼠胚胎在妊娠14.5天时因肝脏变性和凋亡而死亡(4,5). IKK2缺乏的胚胎成纤维细胞既降低了基础NF-κB活性，又损害了细胞因子诱导的NF-κ的活化。同样，在IKK2缺陷细胞中，IKK复合体的基础和细胞因子诱导的激酶活性大大降低(4,5). 这些结果表明，IKK2对前炎症信号诱导的NF-κB活化至关重要，而IKK1只能部分补偿IK2的丢失。IKK1对前炎症刺激激活NF-κB不是必需的，但对p100的诱导性加工很重要。此外，IKK1在表皮角质形成细胞的分化中起着关键的、明显独立于NF-κB的作用(6).

除了其经典的促炎功能外，TNF-α还可以影响体内代谢和体外脂肪细胞。在不同肥胖和糖尿病鼠模型的脂肪组织中观察到TNF-α信使RNA的诱导表达(7). 肥胖患者TNF-α的中和作用fa/fa大鼠对胰岛素的反应导致外周葡萄糖摄取显著增加，表明TNF-α在肥胖诱导的胰岛素抵抗中的作用(7). 体外，用TNF-α处理培养的小鼠脂肪细胞可诱导胰岛素受体底物1（IRS-1）的丝氨酸磷酸化，从而将IRS-1转化为胰岛素受体酪氨酸激酶活性的抑制剂(8). 在体内，TNF-α的缺乏显著提高了饮食诱导肥胖和观察/观察鼠标模型。TNF-α缺陷型和TNF-β受体缺陷型肥胖小鼠的循环FFA水平均较低，并且能够免受肥胖相关的IR信号减少的影响(9). 这些结果表明，TNF-α通过对胰岛素作用的几个部位的影响，是肥胖患者胰岛素抵抗的重要介质。

虽然体外和体内实验均表明，TNF-α诱导的胰岛素抵抗主要通过p55 TNF受体介导，但导致这种效应的细胞内信号级联仍不清楚(9). 已经证明，TNF-α刺激的JNK在丝氨酸残基307处磷酸化IRS-1，丝氨酸残基可消除TNF-β介导的对培养细胞IRS-1信号的抑制(10). 因此，研究表明，灭活小鼠JNK-1可以防止肥胖诱导的胰岛素抵抗(11). 另一方面，实验证据表明IKK2可以作为TNF-α诱导的胰岛素抵抗的细胞内介质。在培养的脂肪和肝癌细胞中，水杨酸盐（IKKs的特征性抑制剂）和显性阴性突变体IKK2的表达都逆转了TNF-α介导的IR酪氨酸激酶活性的抑制(12). 此外IKK2系列-空等位基因改善胰岛素敏感性对象/对象肥胖糖尿病小鼠模型(12).

为了进一步分析IKK2在肥胖诱导的胰岛素抵抗中的作用，我们有条件地灭活了IKK2系列小鼠骨骼肌中的基因，并分析了瘦肉和肥胖肌肉特异性IKK2缺乏小鼠的胰岛素作用。我们发现，通过注射硫代葡萄糖金（GTG）诱导肥胖后，肥胖野生型和肌肉特异性IKK2缺乏小鼠的胰岛素抵抗程度在分子和生理水平上相似。此外，高脂饮食导致的糖耐量受损在对照组和IKK2突变小鼠中发生的程度相同。综上所述，我们的数据反驳了骨骼肌中的IKK2作用在体内介导肥胖诱导的胰岛素抵抗中的重要作用。

方法

结果

有效的肌肉特异性IKK2失活。

对于肌肉特异性IKK2失活，携带loxP侧翼的小鼠IKK2系列在MCK启动子的控制下，将等位基因与表达Cre重组酶的转基因小鼠杂交。由此产生的双杂合子IKK2系列^弗洛克斯MCKCre公司将小鼠杂交以获得IKK2系列^{flox/flox公司}MCKCre公司小鼠和适当的对照动物。此外，IKK2系列^弗洛克斯在生殖细胞中激活的CMV启动子的控制下，用表达Cre重组酶的小鼠繁殖小鼠，以获得杂合性IKK2缺陷(IKK2系列^赫特)老鼠(15). 然后这些动物被杂交IKK2系列^{flox/flox公司}MCKCre公司小鼠获得四组不同的动物：IKK2系列^{flox/flox公司}（控制），IKK2系列^{flox/Het公司}（所有组织中50%的IKK2缺乏），IKK2型^弗洛克斯MCKCre公司（骨骼肌完全缺乏IKK2），以及IKK2系列^{flox/Het公司}MCKCre公司（所有组织中50%的IKK2缺乏，骨骼肌中完全的IKK缺乏）。为了简单起见，这四组小鼠将被称为IKK2系列^重量对于控件，IKK2系列^赫特对于全身减少50%的小鼠，IKK2系列^穆斯用于肌肉特异性击倒IKK2，以及IKK2系列^{赫特/穆斯}对于全身减少50%，骨骼肌中IKK2基因完全失活的小鼠。IKK2突变小鼠出生时具有预期的孟德尔频率，在形态学上与对照小鼠没有区别。

为了评估IKK2灭活的效率，从不同基因型小鼠的骨骼肌中制备蛋白质提取物，并用IKK2-特异性抗体进行Western blot分析。分析表明IKK2系列-空等位基因IKK2系列^赫特小鼠导致IKK2表达减少约50%（图​（图1a）。1a） ●●●●。IKK2在大鼠骨骼肌中的表达IKK2系列^穆斯小鼠的骨骼肌减少了90%以上IKK2系列^{赫特/穆斯}鼠标（图​（图1a）。1a） ●●●●。为了控制印迹的均匀负载，剥离膜并用抗肌动蛋白抗体重新制备，这表明所分析的裂解物的蛋白质含量相似（图​（图1a）。1a） ●●●●。此外，在存在不同程度的IKK2失活的情况下，IKK1的表达保持不变（图​（图1b）。1b） ●●●●。为了评估肌肉限制性IKK2失活的特异性，通过对这些小鼠的WAT制备的提取物进行蛋白质印迹分析来分析IKK2的表达。如图所示​图1c，1c、 携带一只的老鼠IKK2系列-空等位基因表现出预期的IKK2表达减少，而肌肉受限的存在MCKCre公司转基因并不影响IKK2在WAT中的表达。当分析不同小鼠肝脏中IKK2的表达时，也得到了类似的结果（数据未显示）。这些数据表明，上述靶向策略有效地消除了不同动物组骨骼肌中IKK2的表达。

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图1

在IKK2突变小鼠中高效肌肉特异性删除IKK2。(一)上面的面板显示了用抗IKK2特异性抗血清探测的对照组和条件性IKK2-d缺陷小鼠（1-7道）、对照组小鼠胚胎成纤维细胞（8道）和常规IKK2-缺陷小鼠（9道）制备的蛋白质提取物的Western blot分析。小鼠的基因型如下：IKK2系列^重量，1号和5号车道；IKK2系列^赫特第2和第6车道；IKK2系列^穆斯，车道3；IKK2系列^{赫特/穆斯}，第4和第7车道。“NS”标记骨骼肌中抗血清检测到的非特异性条带的位置。下面的面板显示了在剥离并用抗肌动蛋白特异性抗血清重制后，对上面面板中显示的相同斑点进行的Western blot分析。(b条)不同IKK2突变小鼠骨骼肌中IKK1表达的Western blot分析。小鼠的基因型如下：IKK2系列^重量，1号和5号车道；IKK2系列^赫特第2和第6车道；IKK2系列^穆斯，车道3；IKK2系列^{赫特/穆斯}，车道4。(c（c）)不同条件下IKK2突变小鼠脂肪组织中IKK2表达的蛋白质印迹分析。小鼠的基因型如下：IKK2系列^重量，1号和5号车道；IKK2系列^赫特第2和第6车道；IKK2型^穆斯，车道3；IKK2系列^{赫特/穆斯}，车道4。

经GTG治疗后，IKK2突变小鼠的生长速度正常，并出现肥胖。

为了分析IKK2在肥胖诱导的胰岛素抵抗中的作用，我们对2周龄小鼠进行了GTG或PBS的腹腔注射。当测定体重时，在PBS和GTG治疗后，对照组和IKK2突变小鼠之间没有检测到差异。到8周龄时，对照组和IKK2突变小鼠的体重开始显著增加，超过PBS处理的同窝小鼠（图​（图2a）。2a） ●●●●。到16周龄时，经GTG处理的小鼠比经PBS处理的同窝小鼠重约25%，并且在经GTG治疗的对照组和IKK2突变小鼠之间未检测到任何差异（图​（图2b）。2b） ●●●●。这些数据表明，GTG治疗有效地在这些小鼠中产生了肥胖表型，骨骼肌特异性IKK2断裂或全身杂合性导致了IKK2系列-零等位基因对体重和肥胖的发生没有影响。

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图2

GTG治疗会导致肥胖。(一)与经GTG处理的雄性小鼠（填充方块）相比，瘦雄性小鼠（开放方块）的生长曲线。数据表示每组至少16只动物的平均值±SEM。从第8周开始，瘦鼠和肥胖鼠的体重显著不同(对< 0.05). (b条)根据GTG治疗雄性小鼠的体重IKK2系列基因型。数据表示每组至少六只动物的平均值±SEM。(c（c）)瘦小鼠和肥胖小鼠的血浆瘦素浓度，以每组至少16只动物的平均值±SEM表示(*对< 0.01). (d日)所示基因型GTG治疗雄性小鼠的血浆瘦素浓度，以每组至少6只动物的平均值±SEM表示，根据IKK2的表达，没有显著差异。

为了进一步表征GTG治疗导致的肥胖表型，我们测定了不同实验动物组的血浆瘦素浓度，因为先前的研究表明，血浆瘦素水平与各种肥胖动物模型的肥胖程度相关，包括GTG处理的结果(16). 与PBS治疗组相比，GTG治疗组小鼠的循环血浆瘦素浓度显著增加，约六倍（图​（图2c）。2c） ●●●●。同样，在这些组中，对照组和IKK2缺乏小鼠的循环血浆瘦素浓度没有显著差异（图​（图2d）。2d） ●●●●。总的来说，GTG治疗的动物出现了类似程度的肥胖，与全身杂合性无关IKK2系列-零等位基因或骨骼肌中是否存在IKK2。

由于先前的研究表明肥胖诱导的胰岛素抵抗是由于脂肪组织中产生的TNF-α增加所致，我们测定了不同小鼠WAT中TNF-βmRNA的表达。在瘦对照和IKK2突变小鼠的WAT中几乎检测不到TNF-αmRNA（图​（图3a）。三a） ●●●●。相比之下，在肥胖动物中，WAT中TNF-α的表达显著增加（图​（图3a）。三a） ●●●●。肥胖对照组和IKK2突变小鼠之间未检测到显著差异（图​（图3a），三a） 这表明肥胖导致TNF-α表达增加，但这与IKK2表达减少无关。为了进一步研究肥胖导致脂肪组织中TNF-α表达增加是否会导致骨骼肌中TNF--α诱导信号增强，我们接下来用抗血清进行Western blot分析，测定了瘦肉和肥胖小鼠骨骼肌中磷酸化IκBα的量，仅在磷酸化状态下识别IκBα。该分析显示，与瘦肉对照组相比，GTG治疗肥胖对照组小鼠骨骼肌中的IκBα磷酸化显著增加（图​（图3b）。三b） ●●●●。重要的是，在骨骼肌中缺乏IKK2表达的肥胖小鼠中未检测到这种增加（图​（图3b）。三b） ●●●●。这些数据表明，GTG治疗导致WAT中TNF-α表达增加，骨骼肌中TNF--α信号级联激活增加，导致IκBα过度磷酸化。此外，在缺乏IKK2的小鼠中，这种作用被消除，这表明IK2负责肥胖诱导的IκBα磷酸化激活。

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图3

GTG治疗导致WAT中TNF-α表达增加，骨骼肌中TNF--α信号激活，血浆脂联素浓度降低。(一)上面的面板显示了从对照组和对照组WAT中提取的RNA的Northern blot分析IKK2系列^赫特小鼠注射PBS或GTG。“TNF-α”标记小鼠TNF-βmRNA的位置。下面的面板显示了溴化乙锭染色RNA凝胶在转移到尼龙膜上作为负荷控制之前的照片。“18S”标记18S RNA的位置(b条)从瘦肉型和肥胖型IKK2骨骼肌中提取蛋白质^重量和IKK2^{赫特/穆斯}小鼠进行SDS-PAGE，然后进行Western转移。转移到硝酸纤维素过滤器上后，剪切印迹，并使用RasGap抗血清对上部进行Western blot分析，作为负载控制，而使用抗血清对下部进行Westernblot分析。抗血清在丝氨酸32磷酸化时检测IκBα。下面板显示了各组四到六只动物的IκBα磷酸化的密度定量（平均值±SEM）。(c（c）)瘦鼠和肥胖鼠血浆脂联素浓度，每组至少16只动物的平均值±SEM(*对< 0.01). (d日)所示基因型GTG治疗雄性小鼠的血浆脂联素浓度，以每组至少六只动物的平均值±SEM表示，根据IKK2的表达，没有显著差异。

最近的研究表明，脂联素是另一种由脂肪组织分泌并调节全身胰岛素敏感性的因子(17). 因此，我们确定GTG治疗引起的肥胖是否伴随着血浆脂联素浓度的变化。该分析显示，与注射PBS的小鼠相比，GTG治疗的动物血浆脂联素浓度显著降低（图​（图3c）。三c） ●●●●。同样，肥胖对照组和IKK2突变小鼠的血浆脂联素浓度没有显著差异（图​（图3d）。三d） ●●●●。这些数据表明，无论IKK2缺乏与否，诱导肥胖后TNF-α表达和脂联素分泌的失调程度相同。

肌肉特异性IKK2缺乏小鼠的葡萄糖稳态没有改变。

接下来，我们确定了IKK2表达对葡萄糖稳态的影响。我们首先测定了不同组小鼠在禁食和喂食状态下的血糖浓度。在肥胖对照和IKK2缺陷小鼠之间，空腹或喂食血糖浓度没有差异（图​（图4a）。4a） ●●●●。与瘦鼠相比，肥胖动物的血浆胰岛素浓度显著增加，约为瘦鼠的两倍（图​（图4b），4b） ，但对照组和不同组的IKK2突变小鼠之间没有显著差异；这表明肥胖控制小鼠和IKK2突变小鼠都存在胰岛素抵抗（图​（图4c）。4c） ●●●●。为了进一步表征这些动物的胰岛素敏感性，进行了腹腔内胰岛素耐受试验。与瘦小鼠相比，肥胖小鼠对外源性胰岛素的反应迟钝，无论其IKK2基因型如何（数据未显示）。同样，腹腔内葡萄糖耐量试验显示肥胖小鼠的葡萄糖耐量受损（图​（图4d）。4d） ●●●●。肥胖对照小鼠和三组IKK2突变小鼠之间也没有差异（图​（图4e）。4e） ●●●●。综上所述，我们的数据表明，尽管服用GTG会导致肥胖相关的胰岛素抵抗和糖耐量受损，但在体内，对照组和IKK2突变小鼠之间的胰岛素敏感性或糖耐量没有差异。为了进一步阐明IKK2在肥胖引起的葡萄糖稳态障碍中的作用，另一组动物被置于高脂肪饮食中。这些小鼠还表现出糖耐量受损，与GTG治疗的小鼠相比（图​（图4d）。4d） ●●●●。同样，IKK2的部分缺失IKK2系列^赫特与接受相同饮食的对照组小鼠相比，小鼠和肌肉特异性IKK2破坏不会影响糖耐量受损（图​（图4f）。4f） ●●●●。这些数据表明，骨骼肌中IKK2信号的中断并不影响由GTG诱导的肥胖或高脂肪饮食导致的胰岛素作用的损害。

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图4

肥胖IKK2缺乏小鼠的葡萄糖代谢。(一)所示基因型经GTG治疗的雄性动物的随机喂养血糖浓度。数据表示每组至少六只动物的平均值±SEM。统计分析显示，各组之间（未配对学生的t吨测试）。(b条)瘦鼠和肥胖鼠的血浆胰岛素浓度，以每组至少16只动物的平均值±SEM表示(*对< 0.05). (c（c）)所示基因型雄性GTG治疗动物的血浆胰岛素浓度。数据代表每组至少六只动物的平均值±SEM。统计分析显示，各组之间（未配对学生的t吨测试）。(d日)雄性瘦小鼠（填方格）、GTG治疗小鼠（开方格）和喂食高脂肪饮食的小鼠（填圆圈）的葡萄糖耐量试验结果。数据表示每组至少12只动物的平均值±SEM(*对< 0.05, **对<0.01，未成对学生t吨测试）。(e（电子）)GTG治疗的雄性动物的葡萄糖耐量试验结果。数据表示每组至少六只动物的平均值±SEM(IKK2系列^重量老鼠，装满钻石；IKK2系列^赫特小鼠，填满方块；IKK2系列^穆斯小鼠，开放方块；IKK2系列^{赫特/穆斯}老鼠，打开钻石）。(（f）)高脂饮食雄性动物的葡萄糖耐量试验结果。数据表示每组至少六只动物的平均值±SEM(IKK2系列^重量老鼠，装满钻石；IKK2系列^赫特小鼠，填满方块；IKK2系列^穆斯小鼠，开放方块；IKK2系列^{赫特/穆斯}老鼠，开圆圈）。

肌肉特异性IKK2缺乏小鼠骨骼肌中的胰岛素信号传导。

为了在分子水平上表征肥胖诱导的对照和IKK2突变小鼠的胰岛素抵抗，我们测定了不同组小鼠骨骼肌中IRβ亚基的表达和胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化，因为之前已经证明肥胖诱导和TNF-α诱导的胰岛素抵抗都会导致胰岛素刺激的IR酪氨酸磷酸化降低，而这种缺陷可以通过水杨酸盐治疗来恢复(17). 虽然在肥胖小鼠中IRβ亚单位的表达没有改变，但与瘦肉对照组相比，肥胖动物中胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化减少了约50%（图​（图5，5，a和b）。同样，在肥胖动物中，胰岛素刺激的IR酪氨酸磷酸化的减少与IKK2表达的改变无关，这表明部分和完全骨骼肌特异性IKK缺乏都无法在IR酪氨酸磷酸化受损的水平上逆转肥胖诱导的胰岛素抵抗（图​（图5，5、a和b）。同样，在肥胖对照组和IKK2突变小鼠中，PI3K依赖性PKB/Akt通路的胰岛素刺激激活没有差异（数据未显示）。

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图5

胰岛素刺激的IKK2缺乏小鼠骨骼肌IR激活。(一)从小鼠骨骼肌中分离的蛋白质提取物，在收获前5分钟注射了5IU的常规胰岛素，用抗IR特异性抗血清进行免疫沉淀。上面的面板显示了使用抗磷酸酪氨酸特异性抗体（抗PY）的Western blot分析。下面的面板显示了用抗IR抗血清重制相同印迹后的自动放射自显影。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。(b条)所示为IRβ亚单位的胰岛素刺激酪氨酸磷酸化的密度定量，如一.肥胖控制的胰岛素刺激IR酪氨酸磷酸化(IKK2系列^重量)小鼠被任意设定为100%。结果代表了所示基因型的2-5只动物的平均值。肥胖动物与瘦肉动物相比，胰岛素刺激的IR酪氨酸磷酸化显著降低(对<0.05），但不同肥胖动物之间无显著差异IKK2系列基因型。

讨论

尽管在过去十年中，TNF-α在肥胖相关胰岛素抵抗发展中的重要性已得到明确证明，但TNF-β诱导胰岛素抵抗的确切分子机制尚未完全阐明。在这里，我们提供了遗传证据，证明骨骼肌中IKK2的表达对于所研究模型中肥胖诱导的胰岛素抵抗并非必不可少。虽然本报告中显示的数据是针对经GTG治疗的雄性小鼠获得的，但在删除IKK2后，雌性小鼠似乎也没有改善GTG诱导的肥胖（数据未显示）。同样，高脂肪饮食导致的胰岛素抵抗也不受基因杂合性的影响IKK2系列-无效等位基因和/或肌肉特异性IKK2缺失。鉴于有报道称IKK2-null等位基因的杂合性可以逆转胰岛素抵抗对象/对象小鼠及脂肪输注诱导的胰岛素抵抗(12,18). 肥胖对象/对象小鼠明显比GTG治疗后更明显。因此，这种肥胖模式可能使IKK2信号的作用特别明显。虽然本研究中产生的IKK2-null等位基因已被证明在纯合状态下导致IKK2活性的完全缺乏和NF-κB活性的受损，但该等位基因杂合的胚胎成纤维细胞在促炎信号诱导的NFκB活动中没有显着降低(19). 此外，我们还通过仅删除外显子7产生了第二个IKK2激活等位基因。这导致了一个框内突变，产生了一个突变的IKK2蛋白，该蛋白缺乏氨基酸160–189，包括激酶激活域的两个丝氨酸，这已被证明是培养细胞中的显性阴性突变(19,20). 此外，GTG诱导的肥胖小鼠（该等位基因杂合）表现出与对照小鼠相当的胰岛素抵抗（数据未显示）。总之，在本文分析的模型中，我们无法检测IKK2在逆转肥胖介导的胰岛素抵抗中的单倍充足性。然而，除了不同程度的肥胖和不同的靶向策略的影响外，所研究动物的遗传背景差异可能是观察到的不同表型的原因。

另一方面，虽然IKK2系列-空等位基因只能轻微逆转肥胖诱导的胰岛素抵抗对象/对象小鼠、阿司匹林和水杨酸对肥胖诱导和脂质诱导的胰岛素抵抗的改善作用更为显著(12). 根据这一点，Jiang等人最近报道，在培养的细胞中，水杨酸盐治疗可以逆转TNF-α或PMA刺激引起的胰岛素抵抗(21). 有趣的是，在该细胞系中，TNF-α未能激活IKK2。另一方面，水杨酸抑制JNK激活，表明水杨酸可以逆转TNF-α对胰岛素信号的抑制作用，而不影响IKK2(21). 另一项最近的研究表明，在培养细胞中，阿司匹林抑制多种丝氨酸激酶，包括JNK，这种抑制与阿司匹灵逆转TNF-α介导的胰岛素信号抑制的能力有关(22). 然而，这项研究也表明，在IKK2缺乏的胚胎成纤维细胞中，TNF-α诱导的IRS-1丝氨酸磷酸化抑制作用降低。这些数据与阿司匹林和水杨酸在调节TNF-α介导的胰岛素抵抗中的作用靶向多种丝氨酸激酶，包括IKK2的概念一致。鉴于JNK基因缺陷对肥胖诱导的胰岛素抵抗也有深远影响，这些数据表明水杨酸治疗在逆转TNF-α诱导的体内胰岛素抵抗方面具有更非特异性的作用，可能通过靶向JNK活性(11). 总之，我们的数据反驳了骨骼肌中的IKK2信号对我们分析的模型中肥胖诱导的胰岛素抵抗的实质性贡献。

已有研究表明，TNF-α表达本身通过NF-κB依赖性途径调节(23). 因此，抑制脂肪细胞中的IKK2活性可能会消除脂肪组织中与肥胖相关的TNF-α表达增加。脂肪组织特异性IKK2缺乏小鼠的产生将为进一步确定脂肪组织中IKK_2和NF-κB信号在介导肥胖诱导的胰岛素抵抗中的作用提供一个极好的工具。

致谢

脚注

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