为乳腺癌研究选择合适的细胞系

摘要

介绍

50多年前，乔治·盖伊在巴尔的摩实验室建立了第一个人类细胞系[1]. 这个细胞系是以Henrietta Lacks命名的HeLa，Henrieetta Lacks是一位患有子宫颈癌的女性。Gey的设想为我们今天所知的细胞培养铺平了道路，使其广泛发展成为癌症研究中的重要实验工具。在癌症研究中使用培养细胞系的一个主要好处是，它们提供了相对均匀的细胞群的无限供应，能够在标准细胞培养基中自我复制。

1958年建立的第一个乳腺癌细胞系是BT-20[2]. 然而，又过了20年，建立乳腺癌细胞系才变得更加广泛，包括MD Anderson系列[三]以及目前仍然是世界上最常用的乳腺癌细胞系，即1973年在密歇根癌症基金会建立的MCF-7[4]. MCF-7的流行很大程度上是由于其通过雌激素受体（ER）的表达对激素敏感，使其成为研究激素反应的理想模型[5].

尽管取得了这些早期成就，但最近建立的乳腺癌细胞系相对较少，主要是因为在培养没有明显基质污染的同质人群方面存在困难，至少在英国，部分原因是围绕获取人体组织进行研究的严格道德规范[6]. 成功的包括来自乳腺原发性肿瘤、胸腔积液或单个患者各种转移部位的10个细胞系的SUM系列[7]. 这些细胞系现在可通过商业细胞库广泛获得。

乳腺癌异质性

早在现代分子剖析技术出现之前，组织病理学家就通过形态学观察认识到乳腺癌是异质性的。根据以下指标进行分类：组织学类型、肿瘤分级、淋巴结状态和是否存在预测性标记物，如ER，以及最近出现的人类表皮生长因子受体2（HER2）。DNA微阵列分子谱的发展证明了这种异质性，通过基因表达谱和ERα、孕酮受体（PR）和HER2的免疫组织化学表达证明乳腺癌至少可分为五种亚型：管腔A、管腔B、HER2、基底型和正常型[8,9]. 表中总结了这些亚型的分子特征​表11.

每种亚型都有不同的预后和治疗反应[10]. 由于ER是一个治疗靶点，管腔a和管腔B亚型适合激素治疗。同样，HER2组也是曲苏单抗治疗的潜在候选药物。在目前缺乏公认的治疗靶点的情况下，基底部肿瘤很难治疗，生物学上更具侵袭性，预后往往较差。由于基础表型的特征是ERα、PR和HER2缺乏表达，因此有时被称为三阴性。尽管基本表型和三阴性表型有相似之处，但这些术语并不能严格互换；正如最近的一篇综述所概述的那样，对于基底癌仍然没有统一的定义，虽然三阴性对基底乳腺癌有丰富意义，但其表型并不完全相同[11].

最近，通过查询已建立的人类和小鼠数据集描述了克劳丁-罗亚型[12]. 由于ERα、PR和HER2表达缺乏以及相关的预后不良，这些肿瘤最初与基础亚型聚集在一起，这些肿瘤是独特的，因为claudin-3和claudinin-4的额外下调，增殖标记物Ki67的低表达，与上皮-间充质转化相关的标记物的富集和与乳腺癌干细胞（CSC）相关特征的表达（例如CD44⁺CD24型^-/低表型）[13].

目前的乳腺癌细胞系模型是否反映了乳腺癌的异质性？

我们小组之前强调了使用细胞系作为在体外乳腺癌模型[14]. 尽管有人质疑永生细胞系对人类乳腺癌的代表性[15]当以正确的方式使用时，这些仍然是强大的实验工具，在许多情况下，从中获得的信息已转化为临床效益。一个很好的例子是，人们认识到抗雌激素调节他莫昔芬刺激的MCF-7细胞的生长[16,17]为fulvestrant（Faslodex）的最终开发和后续试验铺平了道路^®，阿斯利康制药有限公司，德国威尔明顿，美国），一种选择性雌激素受体下调剂，目前推荐用于治疗绝经后复发性雌激素受体阳性转移性乳腺癌[18,19].

随着乳腺癌的不同分子分类现已确立，研究人员已将注意力转向乳腺癌细胞系，以确定在乳腺癌中观察到的分子特征是否反映在该疾病的细胞系模型中。Lacroix和Leclercq在乳腺癌分子图谱普及之前对乳腺癌细胞系进行了全面评估，得出的结论是，尽管乳腺癌细胞系提高了我们对乳腺癌生物学的理解，但在这些细胞系的代表性方面仍存在差距[20]-特别是，单个细胞系在多大程度上反映了与临床样本相关的异质性，专业组织病理学类型的覆盖范围有限，以及乳腺肿瘤的表型体内在细胞培养中保持。这一结论在乳腺癌差距分析中得到了证实[21]. 利用各种平台将复杂的转录谱应用于乳腺癌细胞系，在一定程度上解决了这些问题。总的来说，这些研究表明，在乳腺癌细胞系中识别出的管腔、基底、HER2和克劳丁-罗簇很容易区分（表​（表1）1) [13,22-26]. 值得注意的是，这一发现表明，克劳丁低亚型在乳腺癌细胞系中似乎过度表达，这可能是由于缺乏ERα、PR和HER2的细胞容易生长所致。这些细胞系为进一步研究这种表型提供了良好的机会，这将加强我们对其生物学的理解。

在治疗反应的评估中，管腔型乳腺癌细胞系优先对AKT抑制剂GSK690693和磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂GSK1069615产生反应，而基底细胞系的增殖被MEK蛋白激酶抑制剂GSK1120212选择性抑制[27]. 在9个已知HER2扩增的乳腺癌细胞系中评估了对曲妥珠单抗（一种选择性结合HER2的抗体）的反应，但9个细胞系中只有3个表现出明确的反应[22]. 这与临床观察报告的曲妥珠单抗疗效为34%相一致[28]并强调，依赖单一细胞系可能会产生错误或误导性数据。这些研究表明，需要一种更合理的方法来筛选潜在的新乳腺癌治疗方法，方法是考虑不同的亚组，并认识到即使在亚组内，反应也可能并不总是相同的。

乳腺癌细胞系作为乳腺癌干细胞模型

干细胞的特点是当异种移植到免疫缺陷小鼠体内时，它们能够产生新的肿瘤。Al-Hajj及其同事首次在乳腺癌中证明了这一点，他们发现只有100到200个具有CD44表型的乳腺CSC⁺CD24型^-/低林^-当引入NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫时，能够形成肿瘤[29]. 如今，乳腺CSC由以下一个或多个特征识别：它们形成肿瘤的能力体内; 乳房层形成在体外; 醛脱氢酶的表达；或通过细胞表面生物标志物的表达，通常是CD44⁺/CD24型^-/低表型[30].

越来越多的证据表明，人类乳腺癌细胞系中存在极少数的CSC（通常被描述为肿瘤诱导细胞）[31,32]. 使用来源于细胞系的CSC显然有很多优点，因为它们可能是进一步了解干细胞生物学和开发CSC特异性治疗靶点的良好模型。然而，在开发用于常规用途之前，需要克服两个主要障碍：CSC在特定肿瘤人群中占大多数，CSC的人口倍增时间极慢。需要改进富集方法以提供足够数量的CSC来进行这些类型的研究，并且当涉及到实验测试潜在的新疗法时，其缓慢的增殖率具有挑战性。

细胞培养环境

细胞之间存在复杂的相互关系体内当细胞系在塑料上进行二维培养时会丢失，然而二维培养仍然是最受欢迎的机制在体外乳腺癌研究。此外，细胞系通常对培养条件敏感，尤其是包含生长因子，这些生长因子有时会改变细胞表型，导致不适当的途径激活或分化。例如，当腔上皮细胞培养中包含表皮生长因子（培养乳腺肌上皮细胞的培养基中的一种常见成分）时，这可能会导致上皮细胞向间充质细胞转化特征的E-cadherin表达缺失，并且细胞表现出更具能动性的表型[33]在不适当的条件下培养也会显著影响细胞形态、细胞间和细胞-基质相互作用、细胞极性和分化[34,35]以及改变信号级联和基因表达[36]. 因此，鉴定维持所需细胞表型的最合适条件是一个关键问题。除了考虑乳腺癌细胞系的分子特征外，我们还需要超越简单的二维乳腺癌模型。因此，生长细胞在更具生理相关性的三维系统中发生了转变，包括多种细胞类型的复杂性增加[34,37].

Kenny及其同事强调，三维细胞形态与组织培养塑料的二维细胞形态不同[38]. 在两个维度上，管腔样上皮细胞表现出典型的鹅卵石状形态和细胞-细胞粘附分子（如E-cadherin）的表达，而基底上皮细胞则表现出更细长和尖刺状的外观，并表达上皮-间充质转化的标记物（如波形蛋白）。相比之下，在三维培养中生长的细胞株显示出四种不同的形态：圆形、块状、葡萄柚状和星状[38]. MCF12A正常乳腺上皮细胞形成圆形极化腺泡样结构，类似于正常人类乳腺组织。管腔A T47D和MCF-7细胞以及管腔B BT474细胞形成紧密的内聚结构，表现出强大的细胞-细胞粘附。相反，基础MDA-MB-468、克劳丁低MDA-MB-231、HER2阳性MDA-MB-553和SKBR3均形成松散内聚的葡萄状或星状结构，与它们显示的侵袭性更强的表型一致在体外[22]. 当管腔A和HER2阳性细胞在二维和三维培养中生长时，我们常规观察到的细胞形态示例如图所示​图11并与Kenny及其同事的研究结果密切相关[38].

在单独的窗口中打开

图1

二维和三维培养细胞系的细胞形态.二维文化（a）灯具A T47D和（b）在组织培养塑料上生长的HER2阳性MDA-MB-453细胞系。T47D细胞表现为紧密结合的鹅卵石外观，而MDA-MB-453细胞则表现为细长的外观。（c）T47D和（d）如前所述，在三维培养的MDA-MB-453细胞系[46]. T47D细胞形成紧密结合的团块结构，显示出强大的细胞-细胞粘附，而MDA-MB-453细胞形成松散结合的葡萄状结构，这与Kenny及其同事观察到的形态学一致[38].

功能性三维研究有助于更好地了解正常乳房的结构和发育；例如，通过定义层粘连蛋白V和桥粒蛋白在上皮细胞极性和维持正常组织结构中的作用[35,39,40]. 三维模型还揭示了β-₁-整合素与乳腺癌进展及阻断抗体逆转上皮细胞恶性表型[41]. 随着基质在调节乳腺癌行为中的作用越来越受到重视[42-44]以及最近的认识，基底部和管腔乳腺癌与基质成纤维细胞共同培养时表现非常不同[45]，其他三维乳腺癌模型也加入了基质细胞，如成纤维细胞[46]，巨噬细胞[47]和内皮细胞[48].

增加这些模型的复杂性并不是没有问题，识别多细胞结构中的单个细胞种群尤其具有挑战性，量化形成的结构仍然是一个难题，尽管基于计算机的形态分析方法显示出潜力[49]. 最近的一项研究成功地模拟了浸润前导管癌就地通过肿瘤细胞与肌上皮细胞共培养，观察导管癌就地与临床标本相似的结构[46]. 进一步添加肿瘤相关的成纤维细胞导致肿瘤细胞侵袭，并使其形态与侵袭性癌相似[46]. 虽然这是对乳腺癌进展阶段建模的一大进步，但尚未达到的金标准是使肿瘤和基质成分共同进化在体外.

这些复杂的多细胞三维培养物不仅是了解疾病进展的工具，而且可能在药物筛选中具有重要意义。Pickl and Ries最近强调了这一点[50]与二维培养的细胞相比，三维培养的SKBR3细胞对曲妥珠单抗的反应明显更高。因此，三维模型可能成为研究和药物筛选的更广泛的工具，虽然这些模型在技术上很难建立，但从长远来看，它们是研究疾病的更具生物相关性的模型在体外.

虽然现有的三维乳腺癌模型正朝着添加复杂乳腺肿瘤微环境中发现的一些细胞成分的方向发展[46,51]迄今为止，CSC的纳入一直被忽视。在乳腺肿瘤微环境中添加来源于各种细胞类型的干细胞可能会增加这些在体外三维研究。鉴于CSC在富集方面的困难及其缓慢的扩散速度，这不是一项微不足道的任务。然而，需要更复杂的异型模型来对体内细胞环境&需要一种系统生物学方法来解决这一问题。

随着含有多种细胞类型的复杂培养基的选择变得越来越重要，其中一种细胞类型的培养基可能会影响共培养细胞群的表型。这本身可能会带来问题；必须依赖单一类型的媒体来支持可能具有完全不同媒体要求的细胞类型，这是一项挑战，并强调需要正确的控制和强有力的方法标准化。

异种移植研究中的细胞系

虽然异种移植模型为肿瘤生长提供了一个完整的生物体环境，但这些模型也有局限性。实验通常在免疫缺陷小鼠中进行，这可能影响肿瘤的形成和进展。植入部位是一个重要的考虑因素，尽管小鼠和人类的乳腺有着截然不同的结构，但注射到乳腺脂肪垫比皮下注射在生理上更具相关性。另一个令人困惑的变量是人类和小鼠乳腺组织基质之间的差异，这使人们对异种移植模型的相关性产生了怀疑[52]. 如上所述，基质现在被认为影响乳腺肿瘤细胞。小鼠和人类间质的不同生物学特性，以及人类乳腺肿瘤异种移植对小鼠间质自发转化的报道，导致异种移植中的鼠-人核杂交[53]，提出进一步的担忧。一些研究小组试图通过联合注射人类成纤维细胞和癌细胞系来克服这一问题[54,55]但这不允许肿瘤和基质在癌症发展过程中发生共同进化。

在通常纳入异种移植模型的细胞系中，ER-阳性管腔A细胞系（如MCF-7和T47D）只会在存在雌激素的情况下形成肿瘤，并且，毫不奇怪，抗雌激素治疗可以抑制生长。代表其他亚型（例如，BT474、MDA-MB-468和MDA-MB-231）的细胞系也被证明具有致瘤性；然而，代表HER2亚型的细胞，包括SKBR3和MDA-MB-453细胞，具有很低的致瘤潜力。

异种移植模型的一个意外发现是肿瘤侵袭和转移的能力有限，特别是考虑到细胞系的经常转移来源（在[14]). 如果发生转移，通常转移到肺，而肺不是人类乳腺癌最常见的转移部位，因此乳腺癌转移通常通过静脉注射进行研究，从而使特定器官得以定植；例如，颈动脉注射用于研究脑转移或左心室注射用于骨转移。被认为具有侵袭性的细胞系，如MDA-MB-231在体外转移性相对较差体内尽管当直接导入循环时，细胞系在实验性转移模型中被证明是有用的。通过轮体内马萨格团队经过精心挑选，进行了优雅的实验，开发出了具有高度转移性的MDA-MB-231细胞衍生物，这些衍生物位于特定的转移部位，能够生成与特定转移部位相关的基因表达特征[56]. Kupperwasser及其同事使用来源于转移性淋巴结临床样本的人乳腺癌细胞系SUM1315将其作为原位模型引入携带人骨移植物的免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠中，并显示细胞优先自发转移到人类骨移植而不是小鼠骨骼[57].

MDA-MB-435细胞

如果不参考自发转移的MDA-MB-435细胞，对这种性质的综述将是不完整的。乳腺细胞系的基因组和分子特性目录将MDA-MB-435细胞分类为基底B细胞[22]. Hollestelle及其同事还通过基因表达微阵列分析将MDA-MB-435表征为基础细胞系[26]. 然而，这一细胞系的起源却备受争议。最初作为MD Anderson系列的一部分进行隔离（因此MDA前缀[58])，这些细胞被认为来源于乳腺癌，但随后的微阵列和免疫组化数据表明MDA-MB-435可能来源于黑色素瘤[59-61].

尽管围绕MDA-MB-435存在明显争议，但许多研究人员仍将其作为真诚地乳腺癌细胞系。我们相信这种细胞系的持续使用，包括高影响力期刊上的出版物，例如MDA-MB-435被用作三阴性乳腺癌的模型[62]-甚至在乳腺癌专家杂志上[63,64]是不可接受的，因为它可能会产生潜在的误导性数据。然而，研究人员现在更清楚MDA-MB-435细胞的来源，最近的两篇论文将该细胞系用作黑色素瘤模型[65,66]并将其列入2010年来源可疑的细胞系名单[67]. 我们敦促研究人员、赠款审查小组成员、期刊审稿人和编辑更加注意这一点。事实上，许多期刊现在都有一项政策，要求在提交稿件时提供某种形式的细胞系认证，这是我们支持的。

尚需开发的乳腺癌细胞系

尽管目前已有合理数量的乳腺癌细胞株可用于反映分子亚群，但对于一些较罕见的组织病理学类型，缺乏相关模型。有一份关于叶状肿瘤中两种细胞系的发展的单一报告[68]但这些似乎并未得到广泛应用。来自炎症性乳腺癌的细胞系仅限于SUM149和SUM190[7]，但该组基础表型的患病率[69]提示基底细胞系可以作为代用品。据我们所知，目前还没有已知的来源于男性乳腺癌的细胞系，而且考虑到男性乳腺癌发病率正在上升[70]这对功能意义上的建模提出了挑战。

结论

在过去的几十年里，利用乳腺癌细胞系，我们对乳腺癌生物学的理解取得了巨大进展。我们现在必须超越过去的“一个标记，一个细胞系”研究，利用通过基因和转录组分析获得的知识，更有效地使用细胞系或细胞系面板作为实验模型来研究特定的乳腺癌亚群，因为这可能对改善乳腺癌患者的预后产生最大的影响。

缩写

CSC：肿瘤干细胞；ER：雌激素受体；HER2：人表皮生长因子受体2；MEK：丝裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶激酶；PR：孕酮受体。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

工具书类