突触囊泡融合是由突触蛋白-1和SNAP-25在质膜上的反-SNARE复合物（或SNARE蛋白）和突触蛋白-VAMP在囊泡膜上的组装驱动的[1-三]. 钙2+然后通过与钙结合触发快速同步突触囊泡融合2+-传感器synaptotagmin[4-6]. 除了SNARE蛋白和synaptotagmin，快速钙2+-触发融合需要复合蛋白[7]. 复合蛋白由短的N端和C端序列和两个中心α螺旋组成。复合物通过其中心α-螺旋与SNARE复合物结合，该螺旋以反平行方向插入由syntapobrevin/VAMP和syntaxin-1形成的凹槽中[8,9]. 虽然多种方法揭示了复合蛋白在突触融合中的重要作用[7,10-15]，该角色的性质尚不清楚。在脊椎动物自闭症中，复合蛋白的缺失选择性地损害快速同步神经递质的释放，而不改变异步或自发释放[7,10]. 相反，在体外融合测定中，添加络合剂会导致SNARE依赖性融合的一般阻断，表明络合剂是SNARE钳[11-14]. 在果蝇属神经肌肉突触，复合蛋白的缺失使自发释放增加了20倍以上，但诱发释放仅略有减少[15]. 因此，复合蛋白在融合中的作用尚不清楚。此外，甚至复合体蛋白SNARE-复合体结合的重要性仍不确定[16,17]. 在这里，我们用两种互补的方法解决了这些问题——RNAi依赖性的复合蛋白敲除与拯救，以及用突触蛋白敲除（KO）小鼠用特定突变体替换野生型突触蛋白[18].
我们使用靶向复合蛋白-1和-2的shRNA来抑制培养皮层神经元中复合蛋白的表达，这是这些神经元中唯一显著表达的复合蛋白亚型[19]. 为此，我们使用慢病毒同时合成复合蛋白shRNA和GFP、野生型复合蛋白-1或无法与SNARE复合物结合的4M-突变复合蛋白-1(19,20). 无shRNA表达GFP的慢病毒提供了进一步的控制。该设计使我们能够同时分析表达GFP、野生型复合蛋白（作为救援对照）或4M-突变复合蛋白的控制神经元和复合蛋白击倒神经元。shRNA强烈抑制复合蛋白-1和-2的表达，而包括SNARE蛋白在内的其他蛋白的表达没有改变，突触数量也没有改变(图S1和S2).
复合蛋白击倒使自发微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的频率增加3-4倍，而不改变mEPSC的振幅(). 相反，复合蛋白敲除使孤立动作电位诱发的兴奋性突触后电流（EPSCs）振幅降低3-4倍(). 诱发的EPSCs不能通过增加细胞外Ca恢复2+-浓度，确定络合剂是钙的核心成分2+-触发机械(图S3). 这两种变化都被野生型而不是4M突变复合物挽救，证实了shRNA的特异性和SNARE结合的重要性。最后，在10Hz的刺激序列中，复合蛋白击倒降低了最初的EPSCs，但并没有改变序列诱发的总突触电荷转移，甚至增加了序列后的延迟EPSCs(图S4). 因此，复合蛋白击倒大大削弱了快速同步而非异步突触囊泡融合，并增加了自发融合，从而调和了脊椎动物自闭症中观察到的不同表型，果蝇属神经肌肉接头和体外融合检测[7,10-15].
复合物击倒增加自发融合，但抑制快速钙2+-诱发融合一，作为mEPSC监测的自发融合（左侧，代表性迹线；中间和右侧，分别为mEPSC频率和振幅的汇总图）。记录来自感染慢病毒的野生型小鼠神经元，慢病毒仅表达GFP（对照组），或抑制复合蛋白-1和-2的shRNA，并额外表达GFP、野生型大鼠复合蛋白-1（Cpx1-134)或具有灭活SNARE结合位点（Cpx）的突变大鼠复合蛋白-11-1344M）。有关蛋白质和突触定量，请参见图S1和S2.
B类，加利福尼亚州2+-诱发融合监测为由0.1Hz的孤立动作电位触发的EPSC（左=代表性轨迹；右=平均振幅）。如A组所述，神经元感染慢病毒。有关10 Hz刺激序列引发的反应，请参见图S3.
C类，复合蛋白的结构域和基于面板D和E所示救援分析的结构域分配。
D类和E、，挽救双重复合蛋白功能丧失表型所需的复合蛋白序列：mEPSCs（D）增加，EPSCs减少（E）。左，代表性痕迹；右图为mEPSC频率（D）和EPSC振幅（E）的汇总图，均按控制标准进行了规范化。记录来自只表达GFP的慢病毒（对照）或复合物shRNA和GFP或指示的大鼠复合物-1片段感染的小鼠神经元。
比例尺应用于组中的所有记录道。汇总图描述了平均值±SEM（参见表S1用于数字电生理数据）。与对照神经元相比，通过ANOVA评估统计显著性（***=p<0.001）；条形图显示了4-6个独立培养物中分析的神经元总数。
接下来我们研究了哪种复合蛋白序列介导自发和诱发融合(). 40个残基的N末端缺失（Cpx41-134)取消了所有络合剂的功能(). 这种消除并不是由于SNARE-复合物与突触结合蛋白竞争时的结合受损，因为复合物片段仅包含其中心α-螺旋SNARE结合序列（Cpx）41-86)仍然与SNARE复合体结合，并有效抑制突触结合蛋白结合SNARE复合物(图S5). 因此，与synaptotagmin竞争的SNARE-复合体结合对于复合体功能是必要的，但不足以实现，因为复合体功能还需要其N末端序列。对该N末端序列的进一步分析表明，非结构的N末端复合蛋白序列对于激活快速融合至关重要，但对于阻断自发融合则不重要()表明复合蛋白的双重激活/箝位功能具有不同的序列要求。
为了进一步分析复合蛋白的功能，我们使用了突触素缺乏的神经元，这些神经元缺乏自发和诱发的突触融合[18]. 野生型突触短肽的表达挽救了突触短肽缺陷神经元的融合损失。相反，正常形成SNARE复合体的3A突触蛋白不能支持复合体与这些SNARE复合物结合(图S6和S7)，不仅挽救了自发融合，而且使其增加了野生型水平的2倍以上(). 同时，3A-突触蛋白降低了诱发融合，并使其时间进程减慢和不同步(,S8和S9). 此外，尽管10Hz刺激序列诱导的融合最初在表达3A-突触蛋白的突触中减少，但融合很快恢复，因此刺激序列诱发的总突触电荷转移正常，刺激序列后延迟融合的数量增加(和第10节). 第二个突触蛋白突变（6A突变）既损害了SNARE复合物的形成，也损害了与SNARE复合体结合的复合物蛋白，但在孤立动作电位或刺激序列中，这并不能挽救诱发释放的减少(). 因此，3A突变导致的络合物结合阻滞导致同步快速融合的选择性丢失，不同于6A突变产生的SNARE-复合物组装抑制导致的所有融合损伤。
阻断络合物与SNARE复合物的结合可增加自发融合，但抑制快速钙2+-诱发融合Synaptobrevin-2 KO神经元感染了仅表达GFP（对照组）或野生型（Syb2-WT）、3A-突触蛋白（Syb2 3A）或6A-突触蛋白-2（Syb2-6A）的慢病毒。突触蛋白中的3A突变选择性地阻断与SNARE复合体结合的复合蛋白，而6A突变则进一步损害SNARE复合物的组装(图S6和S7).
一-D类，自发mEPSC（A，B）和mIPSC（C，D）的代表性轨迹（A，C）和频率（B，D）。有关最小振幅，请参见图S8.
E类和F类，由0.1Hz的孤立动作电位诱发的EPSC（左）和IPSC（右）的代表性迹线（E）和平均振幅（F）。
G、，在表达野生型（Syb2-WT）或3A-突变型synaptobrevin-2（Syb2 3A）的突触蛋白-2 KO神经元中监测到的孤立IPSC的时间进程。时间进程被分析为累积归一化电荷转移（左），并拟合为两个指数方程，得出快速和缓慢释放阶段的时间常数（右；参见图S9图示缩放叠加IPSC记录道）。
H（H）和我，10 Hz动作电位序列诱发的EPSC（左）和IPSC（右）的代表性轨迹（H）或平均突触电荷转移（I）（参见图S10用于电荷转移的量化）。
J、，10 Hz刺激序列期间累积IPSC电荷转移的时间进程。左侧，累积归一化电荷转移图允许定量序列释放（TR）和延迟释放（DR；仅显示表达野生型或3A-突触蛋白-2的神经元）；右侧，延迟释放对表达野生型（Syb2 WT）、3A-突变型（Syb3 3A）和6A-突变型突触蛋白-2（Syb2-6A）的神经元中总突触电荷转移的贡献条形图。
所有比例尺适用于系列中的所有记录道；所有条形图均描述平均值±SEM；通过ANOVA评估与野生型synaptobevin-2相比的统计显著性：***=p<0.001；摘要栏中显示了5-6个独立培养物中分析的神经元总数）。
复合蛋白N末端序列在SNARE复合物插入膜的点的位置表明，N末端复合蛋白序列可能控制SNARE-复合物组装到膜融合的耦合。如果是这样，复合蛋白可能作用于靠近膜的SNARE序列。我们通过在三组丙氨酸取代中突变突触短肽/VAMP的膜旁序列来验证这一假设：K85A/R86A、R86A/K87A和W89A/W90A（称为85、86和WA突变；图S6和S7).
WA突变对SNARE复合体的稳定性、与SNARE复合物结合的复合蛋白或突触结合蛋白，或突触靶向突触没有影响(图S6、S7和S11)，但导致最小频率增加2-3倍，而最小振幅没有变化(和第12节). 此外，WA突变使快速诱发融合减少了约2倍，剩余的融合在很大程度上是异步的，因为其动力学减慢了2-3倍(和第7部分). 同样，正如观察到的，对于复合蛋白击倒神经元和表达3A-突触蛋白的神经元，它们缺乏复合蛋白结合，由10 Hz刺激序列诱导的突触囊泡融合仅在初始同步反应期间受损。列车异步阶段的后期响应正常，延迟释放增强(和第13节)从而使WA突变成为突触凝集素-1 KO、络合剂KO、络合物击倒和突触凝集素3A突变表型的较弱现象(7,15,21;-). 与WA突变相反，85和86突变并不影响突触蛋白缺陷神经元中突触蛋白对突触传递的拯救(图S14)从而证实WA-rescue表型的特异性。
突触素膜插入序列中的突变（WA-突变）现象复制了复合蛋白击倒对只表达GFP（对照）、野生型（Syb2-WT）或WA-突变（Syb2-WA；参见图S6和S7).一-D类，自发mEPSC（A，B）和mIPSC（C，D）的代表性轨迹（A，C）和平均频率（B，D）。关于WA突触靶向突触-2，请参见图S11; 对于小振幅，图S12.
E类和F类、由0.1 Hz的孤立动作电位诱发的EPSC（左）和IPSC（右）的代表性轨迹（E）和平均振幅（F）。
G、，孤立IPSC的时间进程，分析为累积归一化电荷转移（左），并拟合为两个指数方程，得出释放快相和慢相的时间常数（右；参见图S9用于缩放叠加IPSC记录道）。
H（H）和我，10 Hz动作电位序列诱发的EPSC（左）和IPSC（右）的代表性轨迹（H）和平均突触电荷转移（I）（见。图S14用于电荷转移的量化）。
J、，10 Hz刺激序列期间累积IPSC电荷转移的时间进程，分析为累积归一化电荷转移（左；序列释放=TR；延迟释放=DR），并以总突触电荷转移的延迟释放分数表示（右）。
所有比例尺适用于系列中的所有记录道；所有条形图均描述平均值±SEM；通过ANOVA评估与野生型synaptobevin-2相比的统计显著性：***=p<0.001；在5-6个独立培养物中分析的神经元总数显示在B、D、F和I）的条形图中。
在这里，我们已经证明，在中枢突触中，络合剂既起到了钳夹作用，又起到了SNARE激活剂的作用。这些功能需要复合蛋白与SNARE-复合物结合，并依赖于不同的N-末端复合蛋白序列，该序列定位于反-SNARE复合物插入两个融合膜的点。突触素现象的近膜序列中的突变复制了复合体功能丧失表型。因此，复合蛋白对自发和诱发融合的同时控制似乎涉及到跨S NARE复合物组装到两个融合膜上所产生的力的转换()，与生化数据一致(22). 我们假设，在复合蛋白与SNARE复合物结合后，其N末端序列激活并钳制SNARE-复合物组装产生的力。复合蛋白的N末端可能通过将复合物拉近膜来发挥其激活功能，可能是通过与磷脂结合，而副N末端α-螺旋可能通过插入v-和t-SNARE之间的空间来夹紧复合物，或甚至取代反式SNARE复合物的C-末端片段中的SNARE之一(23). 一旦锚定在SNARE复合体上，复合体的N末端40残基会激活并钳制SNARE复合物以控制快速钙2+-触发神经递质释放的过程在所有动物中都是保守的。从更广的角度来看，复合蛋白和突触结合蛋白因此作为SNARE依赖性融合的相互依赖的钳夹激活剂发挥作用，突触结合素利用复合蛋白的激活作用并逆转其钳夹功能[11,20,21]. 在这种分子对偶中，这两种蛋白质的功能紧密相连：作为激活剂和钳夹，它们的表型都是相同的，一种蛋白质没有另一种蛋白质就不能工作。
复合物在SNARE依赖融合中的作用在融合过程中，囊泡经历三个阶段：启动、超边缘化和融合孔开放（顶部面板）。复合物通过插入组装的跨SNARE复合物来抑制自发融合，并通过直接或间接与跨复合物中SNARE蛋白的膜插入序列相互作用来激活诱发融合（下图）。与反-SNARE复合物结合的复合物同时稳定SNARE复合物组装，阻止组装完成，并抑制SNARE-复合物组装产生的力转移到融合膜上。突触结合蛋白随后通过逆转激活的SNARE复合物上的复合蛋白块及其钙来触发融合2+-依赖性磷脂结合活性。
