黑色素瘤细胞系代谢通量的比较分析

气相色谱-质谱联用

细胞颗粒（1–5×10⁶细胞）重新悬浮在0.6 ml含100μ米2-氨基丁酸或100μ米 我-去甲缬氨酸（内标），在干冰上冷冻30分钟，然后在冰上解冻10分钟，然后离心。将液相移入单独的管中，向颗粒中添加0.3 ml三氯甲烷和4μg/ml C17:0脂肪酸内标物。在14000 rpm/4°C下离心5 min之前，旋转试管（15 s×5）。将该氯仿提取物与初始甲醇/水提取物重新组合，涡旋并如上离心。分析前，将顶部（甲醇提取物）层和下部（氯仿）分为2–3个单独批次，通过离心蒸发干燥并储存在−80下。对培养基（0.1 ml）的样品进行类似处理，但最初添加0.5 ml甲醇-水混合物。

首先通过添加50μl 20 mg/ml甲氧基胺-盐酸（Sigma，在干燥吡啶中）衍生干燥甲醇提取物，并在80°C下培养20分钟。冷却后，50μlN第三-丁基二甲基硅基-N个-添加甲基三氟乙酰胺（Sigma），并在80°C下将样品重新培养60 min，然后在14000 rpm/4°C下离心5 min。将上清液转移到自动进样瓶中进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。岛津QP2010 Plus GC-MS的进样温度为250°C，进样分流比为1/10，（通常）进样体积为0.5μl。GC烘箱温度在130°C下启动4分钟，在4°C/min下升至230°C，在20°C/min时升至280°C，在此温度下最后保持2分钟。使用氦气载气的GC流速为50 cm/s。使用的GC柱为15 m×0.25 mm×0.25μm SHRXI-5ms（岛津）。GC-MS界面温度为300°C，（电子碰撞）离子源温度为200°C，电离电压/电流为70 V/150μA。质谱仪设置为扫描米/z（z）范围50–600，具有～1 kV探测器灵敏度（根据需要进行修改）。对于丙酮酸的分析，通过用乙基羟胺替换甲氧基胺来修改衍生化程序，初始GC-MS烘箱温度为110°C，持续4分钟，以6°C/min的速度上升到230°C，然后如上所述。使用Price的醛腈衍生法分析培养基提取物中的葡萄糖(23).

为了将脂肪酸作为甲酯进行分析，将干燥的氯仿提取物重新悬浮在200μl的0.5n个甲醇中的HCl，在60°C下加热30分钟，然后干燥并在100μl氯仿中重新悬浮，并转移至自动进样瓶。GC-MS条件如上所述，但典型的进样体积为2μl，GC烘箱温度最初为140°C，持续4分钟，在4°C/min时上升至210°C，在20°C/min下上升至280°C，在此温度下最后保持2分钟。EI源用30 eV/20μa电离电压/电流调谐，质谱仪被设置为扫描米/z（z）范围为200–600，检测器灵敏度为~1.7 kV（根据需要进行修改）。

分析极性代谢物的GC-MS数据以确定¹³代谢物的C标记和数量。根据总离子计数峰面积或比质量离子，使用同一批样品中运行标准物生成的标准曲线，对代谢物进行量化。要确定¹³C-标记，检索标记氨基酸或其他羧酸已知片段的质量信息。这些片段要么包含代谢物的整个碳骨架，要么缺少α-羧基碳，或者（对于某些氨基酸）只包含主链减去侧链(24). 对于每个碎片，检索到的数据包括最轻同位素的质量强度（没有任何重同位素，M₀)和单位质量增加的同位素（高达M₆)相对于M₀将这些质量分布除以M之和进行归一化₀至M₆，并使用所述的基于矩阵的概率方法校正元素H、N、O、Si和C的重同位素的自然丰度(24,25)在Microsoft Excel中实现(26).¹³C-标签数据表示为平均百分比¹³测量代谢物中每碳的C标记，或这些平均值¹³通过除以葡萄糖或谷氨酰胺的标记百分比，将C标记数据转换为葡萄糖或谷氨酸的百分比。

[U的质量数据-¹³C] 苹果酸葡萄糖标记（显示出与天冬氨酸和富马酸相似的质量分布，因此合理假设与草酰乙酸平衡）用于评估TCA循环中苹果酸或草酰乙酸的相对输入与丙酮酸羧化酶的回复反应。从广义上讲，无补体输入在M时明显为峰值_三在苹果酸标签中，表示结合了¹³丙酮酸产生的C3-碳单位，而TCA循环的输入在M₂表示以乙酰辅酶A形式产生的2-碳单位的输入。根据谷氨酸（C2-C5片段，相当于α-酮戊二酸中的相同片段）的质量分布估计TCA循环方向的输入，通过丙酮酸羧化酶的输入估计为乳酸（丙酮酸）标记加CO的组合₂，假定未标记。与[U类似-¹³C] 通过拟合柠檬酸合成酶输入的草酰乙酸和乙酰辅酶A质量分布（后者根据乳酸C2-C3片段的标记推断）和谷氨酸（C1-C5），计算谷氨酰胺标记、TCA循环中通过柠檬酸合酶或反向通量对柠檬酸的相对输入量质量分布加上未标记CO₂用于反向输入。在Matlab中进行了拟合计算。

为了估计葡萄糖或谷氨酰胺产生的相对ATP，进行了以下计算。首先，通过TCA循环的一个前转，由任一底物形成的苹果酸的相对比例计算为（对于葡萄糖）[M₂苹果酸标记]至[输入葡萄糖标记]；（对于谷氨酰胺）[M的比率₄苹果酸标签]至[输入谷氨酰胺标签]。如上所述，假设苹果酸标记与草酰乙酸标记相匹配，因此可用于计算整个TCA循环的流量。接下来，假设TCA循环的一整圈产生相当于10个ATP分子（来自3 NADH，加上FADH₂，加上GTP(27))，并且标记的苹果酸在TCA循环中被完全氧化，因此M₄-谷氨酰胺标记苹果酸的产量是M的两倍₂-从葡萄糖中标记苹果酸。假设反向通量消耗2.5个ATP分子，相当于异柠檬酸脱氢酶反向反应中使用的1个NADH或NADPH分子的当量，根据谷氨酰胺到柠檬酸的反向通量测量值，对谷氨酰胺在TCA循环中的ATP产量进行比例校正。然后，将TCA循环中葡萄糖或谷氨酰胺的相对ATP生成量计算为（葡萄糖的相对正向通量x10）与（谷氨酰胺的相关正向通量x20减去谷氨酰胺的比例反向通量x2.5）之比。对于总细胞代谢产生的ATP产量，通过在糖酵解到乙酰辅酶A合成和TCA循环的过程中添加从葡萄糖中获得的ATP（每个乙酰辅酶A单位2 NADH加1 ATP或6 ATP当量），再加上转化为乳酸或丙酮酸（并排泄）的葡萄糖部分产生的ATP，来调整葡萄糖的产量，在TCA循环中未被氧化（每乳酸2个ATP，每丙酮酸4.5个ATP（2个ATP和1个NADH））。通过谷氨酰胺输入TCA循环，计算谷氨酰胺的总ATP产量范围，谷氨酰胺输入100%通过谷氨酸脱氢酶，因此每谷氨酰胺产生额外的1 NADH（2.5 ATP），或100%通过交替途径(例如转氨酶）不产生额外ATP。

对C14:0（肉豆蔻酸）和C16:0（棕榈酸）脂肪酸的脂肪酸甲酯的GC-MS质量分布进行同位素天然丰度校正，并使用校正后的同位素模式计算乙酰辅酶A的标记，如前所述(15,28)，基于标记乙酰基单元掺入脂肪酸链的二项式概率分布。

为了将结果可视化为热图，将数据导入Gene Cluster 3.0(29)（由Michiel de Hoon修订）为沿一个轴和百分比的样本表¹³另一轴上测量代谢物的C标记。数据居中，首先沿样本轴从行平均值中减去每行中的值（这可以补偿样本之间整体标记的差异），其次，沿着代谢物轴，通过从列平均值中减去每个列中的值（这可以补偿代谢物标记之间的一般差异，并防止聚类由高标记代谢物（如乳酸）主导）。使用基因聚类中的皮尔逊相关性对两个方向（代谢物和样品）的数据进行分层聚类。使用Java TreeView 1.1.4r3可视化结果(30).

总蛋白的定量

使用DC蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad）测定细胞样品中的蛋白质含量。通常根据制造商的协议以微孔板形式进行分析。简单地说，将2.5μl细胞裂解液添加到225μl反应混合物中，并在室温下培养30分钟。使用Bio-Rad 3550-UV微孔板阅读器通过650 nm处的UV吸收率监测反应。每次测量均一式三份。使用牛血清白蛋白标准曲线计算蛋白质浓度。

缺氧对黑色素瘤细胞中心碳代谢的影响大于对黑色素细胞的影响

为了更详细地研究缺氧对黑色素瘤细胞和黑色素细胞代谢的影响¹³细胞提取物中中心代谢代谢物的C标记[¹³C] 通过GC-MS分析葡萄糖培养物。将数据归一化，以补偿样品之间和代谢物之间标记的总体差异（见“实验程序”）。以无监督的方式对标准化值进行聚类，并将其可视化为热图(图2). 因此，热图提供了从葡萄糖到每种代谢物的相对通量的全局图（原始标签数据见补充表S2). 毫不奇怪，沿着x个axis导致生物化学耦合代谢物的结合。例如，作为糖酵解最终产物的乳酸和丙氨酸聚集在一起。类似地，通过丝氨酸羟甲基转移酶连接的丝氨酸和甘氨酸被分组，而第三组包括剩余的六种代谢物，TCA循环的所有成分或通过TCA循环产生的所有成分。除了代谢产物的聚集，热图还揭示了葡萄糖流量的差异。乳酸和丙氨酸在缺氧时通常标记较高。相反，TCA循环代谢物和相关氨基酸在缺氧时标记程度较低。这些发现与低氧条件下从葡萄糖到乳酸的高流量以及通过TCA循环的相对流量减少相一致（参见图1).

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图2。

在常氧和缺氧条件下，葡萄糖向细胞内代谢物的流动。24小时后的细胞样本[¹³C] 葡萄糖标记实验图1通过GC-MS分析¹³代谢物的C标记。根据“实验程序”中的描述，对两个实验的数据进行平均，并将其转换为热图黄色系表明标签高于平均值，以及蓝色阴影在调整后的数据的平均值以下标注。这个比例尺表示调整数据平均值的变化。黑素细胞行名称如图1.常毒样品表示为纳米x和缺氧马力x源数据（百分比¹³C标签）补充表S2.

从细胞样本的聚类中可以明显看出最引人注目的观察结果(图2)是在常压下采集的样本中的一个重要分支与缺氧条件。这种差异主要是由葡萄糖到糖酵解和TCA循环代谢物对缺氧反应的相对通量的相反趋势引起的（如上所述）。然而，这些变化在黑素细胞中不太明显（如果存在的话），在那里，无论氧气水平如何，样本都聚集在一起(图2). 在黑素细胞中，从葡萄糖到TCA循环的流量保持相对良好，而在糖酵解平衡方面，随着黑素细胞缺氧，从葡萄糖合成丙氨酸的量仅略有增加(图3A类). 事实上，黑素细胞和黑色素瘤细胞系之间的一致差异是，在黑素细胞中，与黑色素瘤（>10%）相比，葡萄糖（～5%）产生的丙氨酸池比例较小(图3A类). 来自葡萄糖的细胞外丙氨酸生成数据同样显示黑色素瘤细胞比黑色素细胞产生更多的丙氨酸(补充表S1). 丙氨酸和乳酸都是糖酵解的潜在最终产物，但从葡萄糖合成的乳酸百分比没有观察到细胞特异性差异(图3B类)尽管黑素细胞比黑色素瘤细胞产生的乳酸在数量上要少(图1). 黑素细胞中丙氨酸标记较低并不是因为他们消耗培养基中的丙氨酸，因为对废培养基的分析表明，所研究的所有细胞系都是丙氨酸的净产生者（结果未显示），但可能与谷氨酰胺使用量低有关，因此以丙氨酸形式排泄多余氮的要求较低。

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图3。

黑色素瘤细胞和黑色素细胞中由葡萄糖衍生的细胞内丙氨酸和乳酸的比例。 ¹³细胞样本的C标记（如图2)测定葡萄糖中丙氨酸或乳酸的含量。黑色条常氧；灰色条，缺氧。误差线显示了生物重复的结果范围。黑素细胞行名称如图1.A类，丙氨酸；B、，乳酸。

黑色素瘤TCA循环在缺氧状态下继续发挥作用

在缺氧性黑色素瘤细胞中，并非所有葡萄糖都以乳酸或丙酮酸的形式分泌(图1C类)表明葡萄糖仍然可以被导入TCA循环。事实上，TCA循环代谢物的代谢物在缺氧时被标记(补充表S2). 为了更严格地评估TCA循环的功能，我们分析了在常氧和缺氧条件下苹果酸的标记。苹果酸是一种合适的报告物，因为它是在TCA循环中合成的，但也可以通过草酰乙酸通过丙酮酸羧化酶的回复作用从丙酮酸中独立制备。这两种生物合成途径可以在质谱中区分开来，因为TCA循环中合成的苹果酸含有2个额外的葡萄糖质量单位，但丙酮酸羧化酶反应增加了3个质量单位(图4). 只有在少数情况下（最显著的是黑色素瘤细胞系UACC903，在一定程度上是黑色素细胞），丙酮酸羧化酶输入的可测量贡献被观察到(图4). 该分析证实，即使在缺氧条件下，TCA循环也在所有细胞系中运行，通过丙酮酸羧化酶进入循环的次数最多也不多。

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图4。

黑色素瘤细胞和黑色素细胞中葡萄糖衍生的细胞内苹果酸。 ¹³对苹果酸的C标记进行分析，以确定葡萄糖产生的百分比以及是否输入¹³C通过TCA循环或丙酮酸羧化酶。黑色条常氧；灰色条，缺氧。通过丙酮酸羧化酶（如有）输入苹果酸的分数由棒材的上部开口部分表示。细胞系如图1. The插入式卡通说明苹果酸的替代输入是如何产生的¹³C类_三-标记或¹³C类₂-分别通过丙酮酸羧化酶（PC）或TCA循环标记苹果酸。¹³碳纤维是彩色编码的紫色。未标记的碳有颜色编码白色。办公自动化：草酰乙酸；Ac-CoA公司：乙酰辅酶A。

谷氨酰胺对WM35黑色素瘤细胞的强回补通量

TCA循环代谢物的相对低标记[¹³C] 葡萄糖暗示了其他营养物质的重要贡献。谷氨酰胺是已知的癌细胞的替代碳源，因此我们测量了黑色素瘤细胞和黑色素细胞对谷氨酰胺的利用(图5). 黑色素瘤细胞从培养基中摄取的谷氨酰胺比黑色素细胞摄取的谷氨酰胺多，尤其是在缺氧条件下。为了评估谷氨酰胺在黑色素瘤中的作用，我们在常氧和缺氧条件下用[¹³C] 谷氨酰胺。定量谷氨酰胺到每种代谢物的流量，然后将结果与葡萄糖的流量相结合（参见图2)计算来自每种底物的代谢物比例(图6). 有趣的是，这两种营养素对新陈代谢不同部分的贡献有明确的界限。葡萄糖是糖酵解中间体的主要碳源(黑色/灰色条在里面图6). 谷氨酰胺对这些代谢物几乎没有贡献，表明没有糖异生通量。然而，谷氨酰胺是TCA循环代谢物的主要碳源(红色/粉色条在里面图6)，因此它做出了重大的再补性贡献。低氧显著增加了谷氨酰胺对TCA循环中间产物的贡献。使用标记数据和“实验程序”中详述的某些假设，我们估计WM35细胞中葡萄糖或谷氨酰胺的ATP相对生成量为33–36%来自葡萄糖/64–67%来自谷氨酰胺；6–7%来自葡萄糖/93–94%来自谷氨酰胺。（较高的谷氨酰胺值假设通过谷氨酸脱氢酶氧化；较低的值假设通过其他非ATP生成途径氧化。谷氨酰胺计算的ATP包括对“反向”的修正谷氨酰胺的TCA循环通量将在下一节中介绍。由发酵生成乳酸或丙酮酸而非完全氧化的葡萄糖产生ATP的比例，在常氧条件下为12%，在缺氧条件下为49%）。

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图5。

黑色素瘤细胞和黑色素细胞对谷氨酰胺的利用。细胞培养基样本，如图1测定谷氨酰胺的消耗量。H3A黑素细胞未显示为谷氨酰胺利用率可忽略不计。图细节如所示图1.

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图6。

比较¹³WM35黑色素瘤细胞中葡萄糖或谷氨酰胺的C-标记。将WM35细胞标记24小时[¹³C] 葡萄糖或[¹³C] 计算谷氨酰胺和从任一底物衍生的代谢物的分数。这些组分以图表形式显示在每个分析代谢产物旁边。葡萄糖输入，黑色（常氧）或灰色（缺氧）；谷氨酰胺的输入，红色（常氧）或粉红色（缺氧）。这个垂直轴除丝氨酸、甘氨酸、乳酸和丙氨酸外，每个图表的显示均为满标度输入的100%，其中满标度等于输入的50%。