两亲螺旋膜曲率传感

脂质体制备

如前所述制备脑脂质体(28)使用Folch牛脑提取物（组分1，Sigma）添加1%摩尔比的1,1-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐（DiD，Molecular Probes）和0.5%摩尔比的1.2-二油基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺-N个-（生物素帽）（DOPE-生物素，阿凡提极性脂质）。

为了研究膜电荷的影响，从三种脑脂类成分中制备脂质体；猪脑我-α-磷脂酰胆碱（PC）（Avanti极性脂质）以79%、66%或32.5%的摩尔比加入，猪脑我-α-磷脂酰丝氨酸（PS）（阿凡提极性脂质）的摩尔比分别为19.5%、32.5%或66%。三种混合物均含有1%的1,1-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐和0.5%的DOPE-生物素。

单脂质体曲率测定

如前所述，通过生物素-链霉亲和素偶联制备带有固定化脂质体的表面(28). 蛋白质/肽保存在冰上，直到添加到显微镜室。使结合在30分钟内达到平衡，之后获得图像。

显微镜在徕卡TCS SP5共焦荧光显微镜上进行，配有声光分束器和声光可调谐滤光片系统，允许波长检测间隔可调。所使用的物镜是一台放大倍率为100倍、数值孔径为1.4的油浸HCX PL APO。标记的蛋白质和肽在488nm处激发，在495-555nm处检测。脂质体在633nm处激发，在640-790nm处检测。连续采集图像以避免串扰。线采集频率为400 Hz，分辨率为2048×2048像素，像素大小为25.24 nm，位深为16位。所有图像均采用线平均值3进行采集，以降低噪声。对于所有样品，在添加蛋白质/肽之前对脂质体进行成像，以确保结合不会显著影响脂质体形态或荧光。将显微镜保持在22±1°C的恒定温度下。

图像分析和尺寸校准

使用Igor Pro 5.05（Wavemetrics）中专门开发的程序对图像进行分析，以提取单个粒子位置、背景校正荧光强度并识别共定位蛋白质和脂质体信号。脂质体直径是通过将显微镜测量的荧光强度分布与动态光散射获得的尺寸分布相关联来确定的。这两种方法在前面都有描述(19,35).

α-突触核蛋白的曲率传感不是基于亲和性的

我们想使用SLiC分析从传感能力和ρ的分离参数方面表征一种已知的基于AH的膜曲率传感器_B类和B_压裂.α-突触核蛋白，一种参与突触可塑性调节并与帕金森病相关的神经元蛋白(37,38)，具有良好的特征，是第一批因其感知膜曲率的能力而被认可的蛋白质之一(30,39,40). 它是一种140-残基蛋白质，在溶液中是非结构化的，但其N末端～100个氨基酸在与脂质膜相互作用时形成两亲性螺旋(36,41,42). 另一方面，C端区域具有相当大的负电荷，并且尚未发现与膜相互作用(36,41). 因此，我们将注意力集中在带正电荷的N端α-螺旋区域。考虑到α-突触核蛋白的细胞作用，我们选择使用从脑脂提取物中重建的脂质体作为生理相关模型系统。

首先，与以前的报告一致(14,30)我们用圆二色性证实了α-突触核蛋白与脂质体结合时采用α-螺旋结构(补充图1). 利用SLiC分析，我们观察到α-突触核蛋白通过以更高密度与直径减小的脂质体结合来感知膜弯曲(图2A类)，与之前的文献完全一致(30,39). 然而，该试验的单一脂质体性质使我们能够进一步消除B的影响_压裂关于表观曲率感测。因此，α-突触核蛋白的曲率传感被更严格地量化为1.23±0.08的传感能力（α），这使得该蛋白作为曲率传感器的效率与嗜内素和两性激素的N末端AHs（α=1.3）一样高(19)). 这相当于高度弯曲脂质体的浓度是基线结合密度的17倍，即。比之前使用批量分析估计的高6倍(30). 我们进一步研究了α-突触核蛋白在单个脂质体水平上是否表现出部分结合，并发现，正如对其他AH所观察到的那样，只有一个脂质体亚群接纳了蛋白质。平均B_压裂为13±1.5%，与内啡肽AH的结果相似(28).

对于内啡肽和两性激素的AH，据报道，由于表观结合位点密度增加（B_最大值)而不是增加对弯曲膜的亲和力(28). 换句话说K（K）_D类膜相互作用的变化仅为膜曲率变化的三倍，这不能解释ρ相应的80倍变化_B类这进一步适用于脂质锚定基序和NBAR结构域，因此，这似乎是疏水插入介导的曲率传感的一个特征。由于α-突触核蛋白表现出与嗜内素和两性生素的N末端AH类似的膜曲率敏感特性，我们继续评估α-突触核蛋白的结合是否受到膜上明显结合位点的类似限制。在图3A类，我们显示ρ_B类三种代表性浓度的α-synuclein（10n）与脂质体直径的关系米，200牛顿米，和1μ米). 总共有8种浓度在5n之间米和1μ米进行了测试。对于每个浓度，ρ_B类在7种不同的脂质体直径（60-600nm）下记录。其中三个直径突出显示为灰色列在里面图3A类.英寸图3B类我们绘制ρ_B类作为浓度函数的这些代表性直径（所有八种浓度）。因此，我们观察到，尽管ρ_B类随着直径的减小，结合曲线没有明显变化，表明K（K）_d日与脂质体曲率无关。通过绘制提取的K（K）_d日从所有七种直径的结合曲线(图3C类)很明显，α-突触核蛋白对不同曲率的膜的亲和力在～200n时保持不变米先前的几项研究通过量热法或荧光法检测了α-突触核蛋白对脂质小泡的亲和力，得出了约1μ米脂质体成分，与我们的相当(39,43–45). 这些研究还揭示了膜电荷的显著差异，即使是很小的差异，因此我们对脑脂质体的研究结果可以被认为与以前的数据很好地一致。关于曲率的影响，早期的一份报告显示，在50℃挤压的脂质体的亲和力没有显著差异与100纳米(45). 后来的一项研究发现，在直径从30纳米到200纳米的范围内挤出的合成脂质体的亲和力相差约2倍米(46). 考虑到与我们的脑提取物脂质体相比的成分差异，他们的观察结果似乎与我们的结果并不矛盾。作者还报告了声波样品和挤压样品之间约15倍的差异，这在本研究中未进行检测。因此，我们发现α-突触核蛋白的曲率传感主要不是基于亲和性的，这与以前的结果很一致。

两亲螺旋曲率传感的模型肽

α-突触核蛋白的螺旋区由一个保守的11聚体螺旋基序组成，重复7次(14,47)，表明该基序的曲率感知能力将代表整个α-突触核蛋白。为了验证这一理论，我们从α-突触核蛋白序列中创建了两个螺旋肽，每个螺旋肽包含两个重复基序（残基2–23和21–42）。我们发现，在这两种肽中，没有脂质体能检测到200 n时结合的蛋白质量米肽，只有在5μ米（未显示数据）。虽然从结构研究中可以清楚地看出，两亲性螺旋重复序列对膜曲率传感很重要，但这些结果表明，几个重复序列的协同作用对于有效结合是必要的，这与α-突触核蛋白占据很长时间的概念是一致的，近100个氨基酸双亲螺旋(14,36,48–50).

然而，我们选择了具有强烈两亲性（疏水矩=0.354）的肽2–23（p2–23）作为研究影响α-突触核蛋白曲率传感的螺旋性状的模型系统。对于这种系统性研究，最好使用从螺旋衍生的短肽，而不是整个螺旋，因为这会导致特定的单或双突变产生更强的影响，从而可以确定每个元素的作用，而不会影响螺旋的其他部分。因此，我们从p2–23中创建了几个突变体，如以下章节所述，重点关注预计可以改善结合的氨基酸替换。虽然我们已经进行了浓度依赖性研究来阐明α-突触核蛋白的结合机制，但我们选择了单一浓度（K（K）_d日200牛顿米)比较分析中的突变体。

增大AHs的疏水面可改善曲率传感

AHs通过将疏水残基插入膜中的脂质堆积缺陷来感知曲率，因此，我们突变分析的第一步是研究如何通过改变螺旋肽的疏水面来改变曲率感知。假设更显著的疏水表面会导致与脂尾的更强相互作用，我们基于p2–23创建了一个突变肽。突变肽(静音1)疏水面上的丙氨酸和甘氨酸被苯丙氨酸（G13F，A17F）取代，苯丙氨酸具有更大且疏水性更强的芳香侧链（参见图4A类). 因此，疏水表面的体积和疏水性都增加了，如平均螺旋疏水性的增加所证明的（0.354–0.408，参见表1和补充图2). 应该注意的是，已知被取代的甘氨酸会干扰螺旋的折叠，因此人们可能会认为突变也会促进螺旋的形成。Mut1肽能够在200 n时结合脂质体米，这意味着与本机p2–23相比，绑定确实得到了改进(表1). 这是否是较高B的结果_压裂或者说目前还不能说有更高的亲和力。与全长α-突触核蛋白相比，Mut1的曲率感知能力略有提高，感知能力为1.40±0.05。这与之前的报告相比较，其中ArfGAP1中三个大块疏水残基的丙氨酸替代显著降低了传感能力(51)将色氨酸引入内亲素A1螺旋可以改善微管化(52). 结合蛋白脂质体（B_压裂)与全长蛋白的值相似，为9.5±1.5%，而13±1.5%（当然高于p2–23，在该浓度下未观察到结合）。

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图4。

增加螺旋的疏水面有助于结合。 A类，基于α-突触核蛋白的模型肽序列（p2–23）创建了两个螺旋肽突变体。甘氨酸(G公司)和丙氨酸(A类)在疏水性脸上变成了苯丙氨酸(F类,静音1)疏水性和侧链容量或缬氨酸增加(V（V）,静音2)在不增加体积的情况下具有较高的疏水性。有关完整序列，请参见补充图2.B类与p2–23相比，这两种突变肽的结合能力都有所提高，p2–23200 n时不结合米因此，它们的结合行为与全长α-突触核蛋白的结合行为相比。这两种肽的结合密度均低于α-突触核蛋白，但与Mut2相比，苯丙氨酸疏水体积的增加减轻了Mut1的这种影响。这些图表代表了三个单独的实验。

为了分离疏水性和疏水体积的影响，我们创造了另一种突变肽，其中相同的丙氨酸和甘氨酸残基被缬氨酸取代，而不是苯丙氨酸(静音2; G13V、A17V，参见图4A类和补充图2). 缬氨酸同样具有强疏水性，但具有更小的脂肪族侧链(53). 与Mut1一样，该肽在200 n下可测量结合脂质体米，然而p2–23没有，这表明疏水表面的增强再次改善了结合。此外，与全长α-突触核蛋白（1.57±0.21）相比，Mut1的曲率感应显著增加与1.23±0.08），而相对于Mut1观察到的增加在实验不确定度范围内(表1). B类_压裂再次低于全长蛋白，为3.8±1.5%，甚至低于Mut1。有趣的是，这是由于B的大量减少_压裂在大脂质体上，而在小脂质体上与Mut1相比，它实际上增加了(图5). 因此，B_压裂以及ρ_B类对膜曲率敏感。在批量分析中，结合蛋白的这种重新分布表现为表观曲率传感的急剧增加，因为B_压裂在小脂质体上无法区分ρ的真正增加_B类在这些脂质体上。

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图5。

疏水性和极性螺旋面的变化强烈影响结合部分的尺寸依赖性。束缚分数（B_压裂)被描述为全长α-突触核蛋白脂质体直径的函数（分为四个直径范围）(A类)以及突变肽Mut1、Mut2和Mut3(B–D类). 虽然与全长蛋白质相比，Mut1和Mut2的结合普遍受损，但最大的降低是大脂质体（低曲率）；与Mut1相比，Mut2与小脂质体的结合也得到了改善，这一效果对Mut2尤为显著。相反，Mut3与各种尺寸的脂质体的结合都有所改善，但这种效果对小脂质体最为明显。这些图表表示三个单独实验的平均值。

对于这两个突变体，ρ较低_B类与α-突触核蛋白相比，所有粒径的脂质体均出现了明显的下降，其中大粒径脂质体的下降最为显著；与全长突变体synuclein相比，这些突变体的传感能力有所提高，因此主要来源于较低的ρ_B类在平板膜上(图4B类). 尽管增加插入区的疏水性增加了两个突变体的曲率感应，但插入残基的体积和结构的差异导致了B的结合行为显著不同_压裂即使不改变疏水性。理论上，这可能源于两条侧链的插入能量差异(54)并且肯定地表明疏水性不足以描述曲率敏感的结合。

两亲螺旋上的电荷分布调制结合和曲率传感

另一种改变结合能的方法是通过改变静电相互作用，因此我们继续研究改变极性面上的净电荷或电荷分布是否会导致改变结合行为，正如之前报道的其他含AH蛋白质的结合行为一样(28,55,56). 为了研究AH不同区域的正负电荷对曲率传感的影响，我们选择基于上述Mut1而不是p2–23的进一步突变。通过这种方式，可以检测改善和损害结合的突变；所检测的突变体及其结合行为总结于图6和表2.

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图6。

两亲性螺旋上的电荷强烈影响结合。 A类，根据中描述的Mut1肽创建了三个额外的突变肽图4。第一个（Mut3，右上角)用丙氨酸取代极面上的两种谷氨酸(A类)，在不影响结合态膜相互作用的情况下降低净电荷。如所示B类，该肽的结合密度明显高于Mut1；这种效果在大脂质体上最为显著（3倍与2倍于小脂质体），导致较低的传感能力。第二肽(静音4,中间偏右)有四种界面赖氨酸被精氨酸取代(R（右）)，能够与脂质头部组发生更强烈的相互作用。该肽在200 n的浓度下导致脂质体破裂米表明其膜相互作用明显强于Mut1肽。最后一个肽(静音5,右下角)用天冬氨酸替换相同的四种界面赖氨酸(D类)而极面上的三个负电荷变成了精氨酸(R（右）). 这种排列类似于先前报道的负曲率传感器（DivIVA），但在我们的检测中，Mut5肽无法与脂质体结合。这些图表代表了三个单独的实验。

第三个突变体（Mut3）还有另外两个氨基酸替换，E12A和E19A，都位于与疏水楔直接相对的极性面上。这将肽的净电荷从+2增加到+4，但由于其位置，受影响的侧链预计不会与脂质膜强烈相互作用(14). 对于Mut3，我们观察到B显著升高_压裂与Mut1（35）相比与9.5%）以及较低的传感能力（0.92与1.40). 虽然两者都是B_压裂和ρ_B类与Mut1相比，所有脂质体尺寸都有所增加，值得注意的是，对于Mut3 B_压裂对于较小的脂质体，增加最显著(图5D类). 与此同时，。ρ的最大增加_B类观察到大脂质体（～3倍，而小脂质体为～2倍），导致大小脂质体之间的差异较小，因此传感能力降低(图6B类). 这两个结果与在Mut1中增加疏水面时观察到的结果相反，这表明与源肽相比，Mut3观察到的改进的结合不是通过插入介导的。从这些结果可以清楚地看出，肽上的电荷会影响膜结合的概率，也可能通过增加ρ来改变给定肽的传感能力_B类在较大的脂质体上。此外，值得注意的是，尽管B_压裂和总ρ_B类代表膜结合的不同因子，三种突变肽与全长蛋白之间似乎存在一定程度的相关性。

接下来，我们设计了两个新的突变体来研究螺旋极性和疏水性区域之间界面电荷的重要性。在第一个突变体中，我们用精氨酸替换了四个界面赖氨酸残基(静音4; K9R、K11R、K20R、K22R；看见图6A类)，其保留正电荷，但通过胍基形成的额外氢键能够与脂质头基进行更强的相互作用。另一个界面电荷改变的突变体的界面赖氨酸被天冬氨酸取代，而极性面上的一个天冬氨酸和两个谷氨酸被精氨酸取代(静音5; D1R、K9D、K11D、E12R、E19R、K20D、K22D；看见图6A类). 由于与带负电荷的脂质头部基团的不利相互作用，这种电荷重新分配在界面区域产生负残基，在极区产生正残基，预计将损害结合。这些突变的另一个动机是DivIVA蛋白最近被报道为通过带负电荷界面残基的两亲性螺旋的负曲率传感器(6,57). 对于Mut5肽，即使我们将浓度增加12倍，也观察到完全缺乏结合。值得注意的是，我们不能仅从这个突变就说缺乏结合是由于这些突变引起的净电荷减少还是由于不利的界面相互作用，也不能排除这种（DivIVA-like）肽可以像以前报道的那样与负曲率的膜结合(7,57). 事实上，根据这些数据，我们无法预测这种肽的潜在传感能力；信号的缺失排除了关于结合行为的任何结论。

相反，Mut4的设计目的是通过界面精氨酸的额外氢键增加与脂质头部组的界面相互作用，而不改变净电荷。在这里，结果大不相同；200 n时米，Mut4导致脂质体破裂（数据未显示）。这可能与先前报道的α-突触核蛋白诱导膜弯曲有关(32). 因此，结合参数无法量化，但与其他肽或α-突触核蛋白相比，在该浓度下脂质体变形的能力明显表现出与脂质膜更强的相互作用。这些膜相互作用与流感病毒M2蛋白中类似的两亲性螺旋相似，据报道这种螺旋会破坏膜(58).

上述Mut4和-5以及Mut3强烈表明，界面电荷在调节两亲螺旋的结合和曲率传感中起着重要作用。这与之前的一份报告一致，在ArfGAP1的AH中引入界面正电荷，通过优先增加与大脂质体的结合来减少传感(55). 除了界面电荷的影响外，我们还发现，膜相互作用表面远端的极性残基确实会影响曲率传感，氢键对结合也会产生重大影响。

膜电荷通过B调节AH结合_压裂

基于这些发现，我们决定通过调整膜的组成来进一步研究螺旋和膜之间的静电相互作用的作用。正如改变螺旋上的电荷分布一样，改变膜电荷应该影响螺旋和膜之间的静电相互作用，这似乎是合乎逻辑的。为了测试这一点，我们生产了由中性猪脑组成的脂质体我-α-磷脂酰胆碱与负电荷我-20、33或67 mol%的α-磷脂酰丝氨酸磷脂我-α-磷脂酰丝氨酸。这些脂质体代表了比迄今为止使用的脑脂混合物更简单的系统，并允许控制膜电荷密度的变化。

α-突触核蛋白在100n时的结合米增加的脂质体我-α-磷脂酰丝氨酸含量总结如下表3与上一节中的结果一致。将膜中的负电荷量从20%更改为33%，然后再更改为67%，导致B增加_压裂从5.5±3.0到27±1.0，然后是34±10%。因此，当膜电荷密度增加时，B_压裂正如我们在增加肽净电荷时观察到的那样，当膜电荷从20增加到33和67%时，传感能力没有显著差异。与脑脂质体相比，传感能力略有降低（1.06±0.04与1.26±0.15），但根据脂质混合物的组成复杂性差异，这并不意外。然而，值得注意的是，增加膜电荷并没有增加ρ_B类任何大小的脂质体(图7). 因此，肽或膜上的电荷以不同的方式影响蛋白质结合；肽电荷的变化(例如磷酸化）可能改变肽感知膜弯曲的能力，而膜电荷密度的变化可能只影响B_压裂以曲率相关的方式绑定。传感效果的缺乏可能表明，只有一定数量的带负电荷的头部基团能够与螺旋界面上的正残基相互作用；虽然膜电荷密度总是影响对膜的长期吸引力（因此B_压裂)，附加电荷在插入时不会与两亲性螺旋相互作用，因此对ρ没有影响_B。

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图7。

膜电荷对α-突触核蛋白曲率传感的影响。将构成我们参考脂质体的复杂脑脂混合物分别以4:1、2:1和1:2的比例替换为含有中性PC和带负电荷PS的三种成分。100 n时α-突触核蛋白的结合米图中显示了这些脂质体的结合密度和曲率传感均不受膜电荷的显著影响。这些图代表了三个单独的实验。

总的来说，这些结果支持这样的观点，即静电相互作用对于AH对膜的远程吸引力和调节膜的相互作用都很重要，正如之前所报道的那样(31,59). 吸引人的静电相互作用增加了与膜的背景结合，尤其是在低曲率区域，从而影响曲率传感。