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方法分子生物学。作者手稿；PMC 2011年12月7日提供。
以最终编辑形式发布为：
方法分子生物学。2011; 791: 11–21.
数字对象标识：10.1007/978-1-61779-316-5_2
预防性维修识别码：PMC3233226型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院339778
PMID：21913068

DNA甲基化检测：亚硫酸氢盐基因组测序分析

李媛媛1和Trygve O.Tollefsbol公司1,2,三，4,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

总结

DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶的C5位置，在基因表达、胚胎发育、细胞增殖、分化和染色体稳定性等许多生物学过程中起着关键作用。异常的DNA甲基化通常与DNA稳态的丧失和基因组不稳定有关，从而导致人类疾病的发展，如癌症。DNA甲基化的重要性迫切需要具有高度敏感性和可靠性的有效方法来探索创新的诊断和治疗策略。Frommer及其同事开发的亚硫酸氢钠基因组测序被认为是基于亚硫酸氢钠转化基因组DNA的DNA甲基化分析的一场革命。除了亚硫酸氢盐基因组测序方法的各种优点（例如定性和定量都很高）外，它还是许多衍生方法的基本原理，可以更好地解释DNA甲基化的奥秘。在这里，我们将介绍一个目前在我们的实验室中经常使用的方案，该方案已被证明可以产生最佳结果。我们还将讨论该领域各种应用程序的潜在技术问题和故障排除说明。

关键词：DNA甲基化、表观遗传学、亚硫酸氢盐基因组测序

1.简介

大量研究表明，DNA甲基化在调节哺乳动物的各种生理和病理过程中起着重要作用。DNA甲基化是调控胚胎发育、基因组印迹、X失活、细胞分化和增殖的重要表观遗传事件(1,2). 然而，DNA甲基化的异常模式与DNA不稳定性相关，并最终会引发后续遗传或癌症等必需疾病(三). DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸内胞嘧啶环的C5处，经常出现在基因调控位点，如启动子区(4). 基因启动子区CpG的密集甲基化与致密的染色质结构有关，导致附属基因的转录沉默。如果DNA超甲基化发生在某些关键癌症相关基因的启动子区域，则可能导致抑癌基因沉默，最终导致肿瘤发生(5). 因此，DNA甲基化在各种生物过程中的重要性代表了一个有吸引力的诊断和治疗目标。需要一种精确有效的方法来确定确切的DNA甲基化状态，以进一步阐明DNA甲基化在生物过程中的基本作用。

亚硫酸氢盐基因组测序被认为是检测DNA甲基化的金标准技术，因为它提供了一种定性、定量和高效的方法，以单碱基对分辨率鉴定5-甲基胞嘧啶。这种方法最早由Frommer等人提出，其基础是发现亚硫酸氢钠处理后，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶（5mC）的胺化反应会产生非常不同的结果(6). 在这方面，单链DNA中的胞嘧啶将被转化为尿嘧啶残基，并在随后的PCR扩增和测序中被识别为胸腺嘧啶，然而，5mC对这种转化免疫，并保持为胞嘧啶，从而使5mC与非甲基化胞嘧啶区分开来。后续的PCR过程是必要的，以通过亚硫酸氢盐处理后使用特定的甲基化引物来确定感兴趣位点的甲基化状态。实际甲基化状态可以通过直接PCR产物测序（检测平均甲基化状态）或亚克隆测序（监测甲基化模式的单分子分布）来确定(图1). 此外，亚硫酸氢盐测序分析不仅可以识别DNA单链上的DNA甲基化状态，而且还可以检测DNA双链的DNA甲基模式，因为转换后的DNA链不再是自互补的，扩增产物可以单独测量。

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亚硫酸氢盐基因组测序甲基化分析原理。用亚硫酸氢钠处理后，未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶（5mC）未受影响。PCR扩增后，尿嘧啶残基转化为胸腺嘧啶。DNA甲基化状态可以通过直接PCR测序或克隆测序来确定。

在过去几年中，基于亚硫酸氢盐的工作基础，出现了几种技术，包括甲基化特异性PCR（MSP）、亚硫酸氢酯限制性联合分析（COBRA）、甲基化敏感单核苷酸引物延伸（Ms-SNuPE）和其他一些取决于不同应用的技术(7–10). 与其他基于限制性内切酶敏感性的DNA甲基化方法相比，限制性内切酶可在其裂解识别位点内特异识别甲基化胞嘧啶(11)基于亚硫酸氢盐的DNA甲基化分析具有更高的定量准确性、检测灵敏度、高效性和样品分析的广谱性。

亚硫酸氢盐基因组测序作为DNA甲基化分析的基本方法，已广泛应用于各种研究和临床环境。为了优化亚硫酸氢盐基因组测序方案的最终结果，已经探索了许多修改，并显著提高了该程序的敏感性和准确性(12–16). 在本章中，我们将介绍一种改进的亚硫酸氢盐测序协议，该协议目前在我们的实验室中使用，并且一直运行良好。还将详细讨论技术问题、解决方案和故障排除，以帮助加强此技术的实施。

2.材料

2.1. 基因组DNA提取

  1. Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega）
  2. 70%乙醇
  3. 微型离心机
  4. 65°C培养箱

2.2. 亚硫酸氢盐反应

  1. 商用亚硫酸氢盐反应试剂盒，EpiTect亚硫酸氢酯试剂盒（Qiagen）。
  2. 对于传统亚硫酸氢盐基因组处理，需要3 M NaOH溶液、5 M亚硫酸氢钠溶液（含125 mM氢醌，pH 5.0）、5 M醋酸铵、异丙醇、乙醇和矿物油。亚硫酸氢盐反应溶液的混合物如图所示表1.亚硫酸氢钠和对苯二酚溶液是感光的，在所有步骤中都应防止光线照射。

    表1

    5M亚硫酸氢钠溶液试剂

    试剂/体积1毫升2毫升3毫升4毫升5毫升
    亚硫酸氢钠0.475克0.95克1.425克1.9克2.375克
    去离子水0.625毫升1.25毫升1.875毫升2.5毫升3.125毫升
    2 M氢氧化钠（80 mg/ml）175微升350微升525微升700微升875微升
    1 M对苯二酚（110 mg/ml）125微升250微升375微升500微升625微升
  3. 向导DNA清理系统（Promega）用于提纯亚硫酸氢处理的DNA。
  4. 一次性5毫升鱼饵锁注射器。
  5. 去离子水或TE缓冲液。

2.3. 靶DNA片段的PCR纯化、克隆及序列分析

  1. 常规2×PCR Mastermix。
  2. 琼脂糖凝胶、溴化乙锭和电泳仪。
  3. QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）用于PCR产物的纯化。
  4. QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen），用于从多个非特异性PCR产物中纯化目标PCR片段。
  5. pGEM-T Easy矢量系统II（Promega）。
  6. 对于细菌培养和阳性克隆选择，需要使用细菌-胰蛋白胨（BD）、酵母提取物、氯化钠、氨苄西林溶液、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、X-Gal（Bio-Rad）和37°C的细菌摇床培养箱。
  7. QIAprep Spin Miniprep套件（Qiagen）。
  8. ABI 3730 DNA分析仪。

3.方法

3.1. 基因组DNA制备（参见注释1–5)

通过使用许多商用DNA提取试剂盒以及相应的制造商协议，可以从培养细胞、培养细菌、动物组织和石蜡包埋组织切片中分离基因组DNA。将基因组DNA（1-10μg）溶解在最终体积为18μl的去离子水中。继续执行副标题3.2。,步骤1.

3.2. 亚硫酸氢盐改性

  1. 预先激活来自副标题3.1。在水浴中煮沸20分钟(看见 附注6).
  2. 通过添加2μl 3M新制NaOH和380μl 5M亚硫酸氢钠溶液使DNA变性(表1.）混合均匀(看见 附注7).
  3. 在400μL DNA溶液的顶部添加500μL重矿物油步骤2减少蒸发，并将溶液在50°C的黑暗中培养12–16小时(看见 附注8).
  4. 亚硫酸氢盐处理DNA的纯化：我们通常使用Promega的Wizard DNA净化试剂盒来纯化亚硫酸氢处理DNA。小心地从反应溶液中除去重质矿物油后步骤3，根据制造商的协议遵循涉及此步骤的程序。
  5. 亚硫酸氢盐修饰的DNA在50μl去离子水中洗脱，并加入11μl 3M NaOH。在37°C下培养15分钟以脱硫DNA。
  6. 添加166μl 5 M醋酸铵、750μl无水乙醇和200μl异丙醇，使DNA在−20°C下沉淀2-4小时。
  7. 以最大速度离心DNA 10分钟，然后排出上清液。
  8. 用200μl 70%乙醇清洗DNA，并按步骤7.
  9. 小心取出乙醇，并在室温下干燥DNA颗粒10分钟。将DNA重新悬浮在10–20μl TE或去离子水中(看见 附注9).

3.3亚硫酸氢盐PCR扩增

  1. 亚硫酸氢盐PCR引物设计对于后续亚硫酸氢酯测序分析的成功实施至关重要。亚硫酸氢盐处理DNA模板的底漆设计的详细指南在附注10.
  2. 亚硫酸氢盐PCR扩增可以作为常规PCR反应进行。然而，应仔细优化扩增亚硫酸氢盐处理材料的PCR条件(看见 附注11). PCR结果将通过凝胶电泳进行验证，单一、明亮和特异的条带将被视为成功的PCR扩增。

3.4. 直接PCR测序和克隆测序（参见附注12)

  1. 在直接PCR测序之前，有必要对PCR产物进行纯化，以去除可能干扰测序结果的PCR反应残留物。商用试剂盒，如QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）可用于特定PCR片段，而QIAquik凝胶提取试剂盒（Qiagen。纯化的PCR产物可以直接测序。
  2. 克隆测序对于观察单分子中甲基化模式的分布是必要的。我们倾向于使用pGEM-T Easy载体系统II（Promega）进行克隆，该系统提供了T4 DNA连接酶系统、pGEM-T-Easy向量和活性JM109细胞。通过使用该试剂盒，纯化的PCR产物可以连接到pGEM-T Easy载体并转化为活性JM109细胞。携带连接载体的JM109细胞可以通过颜色变化在含有氨苄西林/X-gal/IPTG的琼脂平板上选择，其中蓝色菌落代表空载体，白色菌落代表插入目标PCR产物的载体。然后可以选择白色菌落并在LB培养基中生长。使用QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）提取含有目标DNA的质粒，并进行标准测序分析。所有程序均遵循制造商的协议。

3.5. 数据解释

亚硫酸氢盐PCR扩增或亚克隆成功后，DNA甲基化状态可以通过后续的测序分析来解释。PCR产物的直接测序可能很容易实现，但一系列问题限制了其应用，例如无法读取整个靶区和高背景干扰。克隆测序可以在分子基础上提供有用的甲基化信息。为了获得较高的结果可信度，需要对大量克隆（最少5个，理想情况下10个）进行测序，这可能需要耗费大量时间和劳动。由于转换不完全，这两个过程都有可能产生伪影，可以通过严格遵守来防止注释1–9.

DNA甲基化状态可以通过比较测序结果和原始DNA序列来解释。基本上，所有非甲基化胞嘧啶（C）都会转化为胸腺嘧啶（T），C峰的出现表明基因组中存在5-甲基胞嘧啶（5mC）。如果同时出现C和T峰，则表明发生了部分甲基化或潜在的不完全亚硫酸氢盐转化。通过分析这两个波段的相对平方面积，可以解释5mC与C的比例(图2).

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甲基化测序结果的解释。亚硫酸氢盐处理后，所有非甲基化胞嘧啶（C）都转化为胸腺嘧啶（T），C峰的存在表明基因组中存在5mC。单个残基的总甲基化或完全转化显示出一个单峰。C峰和T峰的存在表明部分甲基化或潜在的亚硫酸氢转化不完全。

致谢

这项工作得到了国家癌症研究所（R01 CA 129415）、Susan G.Komen治愈奖和美国癌症研究所赞助的博士后奖（PDA）的部分资助。

脚注

1DNA的质量和数量在亚硫酸氢盐反应中很重要。通常，大多数协议建议>1μg从培养细胞或新鲜组织样本中提取的高质量DNA，以获得可靠的结果。因此，来自福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的样本可能会产生不利结果，因为亚硫酸氢盐处理期间初始DNA数量有限，随后DNA降解。一些修改已集成到传统的亚硫酸氢盐方案中，以帮助优化低数量DNA的分析，例如石蜡包埋组织块的样本(17).

2或者，一些人建议延长蛋白酶K处理，包括DNA分离，以通过去除残留蛋白质增加后续亚硫酸氢钠对DNA的可接近性(18). 在该程序中，可以在37°C下进行过夜蛋白酶K（2 mg/ml）培养，然后继续副标题3.2。,步骤1.

三在亚硫酸氢盐修饰之前，可以加入限制性甲基化敏感内切酶进行额外的DNA消化，这有助于减少变性后的DNA链退火(20).

4在亚硫酸氢盐修饰期间减少DNA损失的另一个过程是将DNA嵌入低熔点琼脂糖块中(14,16). 这种修饰将允许随后的亚硫酸氢盐反应在琼脂糖中进行，DNA在琼脂酶中被物理捕获。这将大大减少程序中的DNA损失，特别是当应用少量DNA样本时。

5鲑鱼精子DNA和糖原等载体可分别用于增加亚硫酸氢盐转化和DNA沉淀，从而减少整个过程中DNA的损失(19).

6亚硫酸氢钠反应的最关键步骤是DNA变性，因为亚硫酸氢钠只能与单链DNA中的胞嘧啶反应。因此，DNA完全变性是亚硫酸氢盐处理成功转化DNA的必要前提。根据Frommer等人最初制定的修改协议(6)基因组DNA在高温低pH的高亚硫酸氢钠溶液中变性。然而，这些苛刻的条件会导致DNA双链形成不利的构象，导致部分DNA复性，从而增加不完全转化反应的风险(20). 已尝试进行各种修改，以减少以下所列的钢绞线再退火。

  1. 可以通过使用蛋白酶K和适当的限制性内切酶将DNA片段化，如附注2和三.
  2. DNA可以嵌入低熔点琼脂糖块中，以防止DNA再退火，如上文所述附注4.
  3. DNA可以在亚硫酸氢盐处理之前预煮，以改进变性步骤，如副标题3.2。,步骤1.
  4. 可以向亚硫酸氢盐溶液中添加高浓度的尿素（6 M），以破坏DNA中碱基的稳定性(21).

7亚硫酸氢盐反应溶液表1每次转化反应前，必须新鲜制备NaOH溶液。

850°C下的标准过夜培养确保完全反应。然而，延长孵育时间会增加基因组中的脱氨基5mC(12,22)因此导致后续PCR分析中5mC的代表性不足。尽管有几个小组声称用亚硫酸氢盐孵育4到5小时就足以完全转化(13–15,20,23)，我们倾向于将DNA培养10小时以上的亚硫酸氢盐反应，这样可以在不进一步损坏DNA模板的情况下实现完全转化。如果进一步的PCR反应由于长时间孵育造成广泛的DNA损伤而导致结果不佳，则可以采用减少孵育。

9由于亚硫酸氢盐处理后的DNA构象是非互补的，转化后的DNA不稳定，应避免反复冻融。建议使用新制备的亚硫酸氢修饰DNA以获得最佳结果。根据我们的方案，如果储存在−80°C或液氮中，亚硫酸氢修饰的DNA可以以良好的质量用于长达一年的后处理。

10设计亚硫酸氢盐PCR引物的原理各不相同，以满足传统亚硫酸氢盐反应后的不同研究目的和方案。下面列出的引物指南用于亚硫酸氢盐基因组测序分析。甲基化引物设计的更详细描述见参考文献。 24,25.

  1. 亚硫酸氢钠处理后，未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，甲基化胞嘧啶仍保留胞嘧啶。由于CpG二核苷酸的甲基化状态未知，亚硫酸氢盐引物序列应严格避免CpG双核苷酸。因此，应根据原始DNA序列生成引物，将所有胞嘧啶替换为胸腺嘧啶。引物设计软件也可用于避免潜在的发夹结构和基于此修改序列的可能引物二聚体。
  2. 引物的长度应该在25到30个核苷酸左右。
  3. PCR产物的长度不应超过400 bp，因为在亚硫酸氢盐修饰期间可能会发生DNA降解，从而影响PCR扩增。

11应仔细优化亚硫酸氢盐PCR条件。由于亚硫酸氢盐处理降低了DNA双链的特异性，因此使用亚硫酸氢修饰的DNA模板确定最佳PCR条件的过程可能比常规PCR更加困难。

  1. 退火温度：梯度PCR热循环器可以帮助确定合适的退火温度。如果无法使用梯度PCR热循环器，则可以使用着陆PCR来提高退火灵敏度。
  2. PCR反应系统：商用PCR MasterMix，混合塔克具有最佳盐浓度的DNA聚合酶和dNTP可方便地用于亚硫酸氢盐PCR。如果这种常见的PCR反应体系不能产生干净的条带，建议尝试不同的PCR反应系统。在我们的实验室中，我们通常使用JumpStart（Sigma）或SureStart PCR系统（Startagene）来改进亚硫酸氢盐PCR结果。
  3. 巢式PCR反应：建议使用巢式或半巢式PCR方法，以获得足够的PCR产物，尤其是当使用有限数量的DNA时。

12pGEM-T Easy载体是一个T-a克隆系统，需要在PCR反应期间向两条链的5'端添加额外的腺苷。因此，选择合适的塔克克隆前的DNA聚合酶。通常，测序需要五个以上的菌落才能确定目标区域的准确甲基化模式。

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