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英国药理学杂志。2011年11月；164(6): 1738–1748.
数字对象标识：10.1111/j.1476-5381.2011.01500.x
预防性维修识别码：PMC3230819型
PMID：21615722

神经元NOS衍生的过氧化氢产生减少导致动脉粥样硬化中的内皮功能障碍

LSA卡佩蒂尼,1 SF Cortes公司,2 JF席尔瓦,1 JI阿尔瓦雷斯-莱特,三和VS莱莫斯1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景和目的

NO可用性降低被描述为动脉粥样硬化中内皮功能障碍的关键机制。我们之前报道了神经元NOS（nNOS）衍生的H2O（运行）2是小鼠主动脉中一种重要的内皮衍生舒张因子。H的作用2O（运行）2动脉粥样硬化中内皮功能障碍的nNOS仍未确定。我们假设nNOS衍生H的减少2O（运行）2导致载脂蛋白E缺乏小鼠（ApoE）血管舒张功能受损−/−).

实验方法

肌电图上记录等长张力的变化；同时，NO和H2O（运行）2使用碳微传感器进行测量。反义寡核苷酸被用于击倒eNOS和nNOS体内用Western blot和共聚焦显微镜分析NOS亚型的表达和定位。

主要成果

ApoE的主动脉−/−小鼠表现出血管扩张受损，同时NO和H减少2O（运行）2生产。L-Arg对nNOS的抑制作用二氧化氮-L-Dbu，击倒nNOS和过氧化氢酶，分解H2O（运行）2在氧气和水中，乙酰胆碱诱导的舒张作用减少一半，NO生成量略有减少，H2O（运行）2在野生型动物中，但对ApoE没有影响−/−老鼠。共聚焦显微镜显示ApoE内皮细胞nNOS免疫染色增加−/−老鼠。然而，ACh刺激血管导致ApoE中Ser852的磷酸化较少−/−老鼠。

结论和启示

我们的数据显示内皮细胞nNOS衍生的H2O（运行）2ApoE的生成受损并导致内皮功能障碍−/−主动脉。本研究为动脉粥样硬化中内皮功能障碍提供了一种新的机制，并可能成为阐述血管动脉粥样硬化治疗策略的新靶点。

关键词：nNOS，氢2O（运行）2内皮功能障碍、动脉粥样硬化

介绍

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病因，在西方世界，动脉粥样硬化在发病率和死亡率中仍占主导地位。内皮功能障碍被认为是动脉粥样硬化的早期标志，是动脉粥样硬化斑块的血管造影或超声证据的先兆(Busse and Fleming，1996年;Luscher和Barton，1997年;罗斯，1999;蔡和哈里森，2000;东（Higashi）等2009年).

作为血管内稳态的主要调节器，内皮细胞不仅调节血管平滑肌的张力，还抑制平滑肌细胞增殖和迁移、血小板聚集、低密度脂蛋白氧化、，单核细胞和血小板的粘附和炎性细胞因子的合成，从而表现出重要的抗动脉粥样硬化作用(Vanhoutte，1986年;库贝斯等., 1991;弗里德曼等., 1999;Shimokawa，1999年;利奥波德和洛斯卡佐，2009年;司马等., 2009). 许多这些影响在很大程度上是由NO介导的。

NO由NOS酶产生，这些酶分为内皮型NOS（eNOS）、神经元型NOS和诱导型NOS(阿尔德顿等., 2001). 虽然eNOS主要在内皮细胞中表达，nNOS在神经元中表达，但许多组织表达不止一种亚型。血管系统有表达nNOS和eNOS的潜力(Rosenblum和Murata，1996年;布朗格等., 1998;Toda和Okamura，2003年;巴凯蒂等., 2004;卡佩蒂尼等., 2008). nNOS在调节肌源性张力中具有生理相关作用(弗莱明，2003年)，全身动脉压(栗原市等., 1998)和脑血流(下冈（Hagioka）等., 2005).

最近，我们发现nNOS在小鼠主动脉内皮中组成性表达，除NO外，还产生过氧化氢（H2O（运行）2) (卡佩蒂尼等., 2008;2010;). H（H）2O（运行）2被认为是肠系膜内皮衍生超极化因子（EDHF）(马托瓦等., 2000;2002;), 冠状动脉(三浦等., 2003;雅达等., 2003)和大脑动脉(索贝等., 1997;Iida和Katusic，2000年). 在小鼠主动脉中，nNOS衍生H2O（运行）2与eNOS衍生NO同样有助于内皮依赖性血管舒张(卡佩蒂尼等., 2010).

nNOS最近被认为是一种新的抗动脉粥样硬化因子(筑井，2004;库伦科特等., 2006;斯科德尔等., 2009)颈动脉结扎模型中防止新生内膜形成(森下等., 2002). 在人类和小鼠模型中，发现具有动脉粥样硬化斑块的电导血管中nNOS表达增加(威尔科克斯等., 1997). 此外，载脂蛋白E缺陷小鼠的nNOS基因缺失（ApoE−/−)加速主动脉根部和降主动脉粥样斑块的形成(库伦科特等., 2006;斯科德尔等., 2009).

动脉粥样硬化小鼠模型的内皮依赖性舒张功能受损(Busse和Fleming，1996年;布卢米等., 1997;Luscher和Barton，1997年;Deckert公司等., 1999;拉贝洛等., 2003;司马等., 2009). 化学灭活和NO生物合成减少被描述为动脉粥样硬化动物主动脉内皮功能障碍的关键机制(布卢米等., 1997;劳尔森等., 2001;东（Higashi）等2009年b). H的作用2O（运行）2到目前为止，nNOS对动脉粥样硬化中内皮功能障碍的影响尚不清楚。本研究的目的是研究nNOS衍生H的贡献2O（运行）2在动脉粥样硬化小鼠模型中，内皮依赖性舒张功能受损。我们假设nNOS/H受损2O（运行）2轴可能导致ApoE中的内皮功能障碍−/−老鼠。

方法

动物

所有动物护理和实验程序均符合实验动物人道使用指南，并得到了米纳斯杰拉斯联邦大学动物伦理委员会的批准（方案#155/10）。我们使用12周龄男性纯合子ApoE−/−（29.7±0.4克；n个=22）小鼠和年龄匹配的野生型C57BL/6J（28.0±2.6 g；n个=25）只小鼠。阿波（ApoE）−/−这些小鼠最初是从美国马萨诸塞州巴尔港的杰克逊实验室获得的，并在米纳斯杰拉斯联邦大学的动物设施中繁殖。C57BL/6J小鼠取自CEBIO/ICB（巴西UFMG）。所有动物均采用非致动脉粥样硬化饮食。有关动物的代谢特征以及主动脉的形态和组织学特征，请参阅在线支持信息和图S1.

同时测量NO、H2O（运行）2和血管功能

同时测量血管扩张、NO和H2O（运行）2如前所述，进行ACh诱导的生产(卡佩蒂尼等., 2010). 简言之，从胸主动脉获得环，安装在器官浴系统中，在Krebs–Henseleit溶液中清洗（单位：mmol·L−1：110.8氯化钠、5.9氯化钾、25.0氯化钠三，1.07毫克硫氧化物4，2.49氯化钙2，2.33 NaH2人事军官4和11.51葡萄糖，pH 7.4），并稳定60分钟。在预收缩至相同张力水平（约2.5 mN.mm）的血管中构建对ACh的浓度-响应曲线，其中苯肾上腺素的次最大浓度（0.03–0.1µmol·L−1). 等长张力的测量值由力传感器（美国佛罗里达州萨拉索塔市World Precision Instruments，Inc.）记录，并输入放大器-记录器（TBM-4型；World Predicision Inst鲁ments，Inc）和配备模数转换板的个人计算机（AD16JR；World精密仪器公司）。使用WinDaq数据采集软件（Dataq®Instruments，Akron，OH，USA）分析等长张力的变化。带有NO和H的碳微传感器2O（运行）2在ACh（0.001–300µmol·L）之前，将渗透膜（分别为ISO-NOPF100和ISO-HPO100；World Precision Instruments Inc.）放置在血管腔旁边−1)测量刺激和电流（nA）。NO和H2O（运行）2通过已知浓度的S-亚硝基-n-乙酰青霉素（SNAP，0.2至500 nmol·L−1; 世界精密仪器公司）或H2O（运行）2（0.001至10µmol·L−1; 德国达姆施塔特默克公司）。

反义寡核苷酸

反义寡核苷酸（AS-ODN）被用于击倒体内野生型和ApoE中的eNOS（eNOS-KD）和nNOS−/−老鼠(卡佩蒂尼等., 2008;2010;). 基于小鼠序列构建了19-基硫代磷化AS-ODN。我们使用了以下特定序列：5′-CTCTCAAGTTGCCCATGT-3′用于eNOS，5′-AACGTGTCTTCCATGG-3′用于nNOS（GenBank登录号NM 008713和NM 00871），购自Eurogentech North America Inc.（加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。碱基组成为5′-GTCTTGAACTTCCGATCT-3′的硫代磷错配ODN（MM-ODN）序列被用作对照ODN。

体内AS-ODN对nNOS和eNOS的治疗

实验前24和48小时，小鼠静脉注射2 nmol AS-ODN或MM-ODN(卡佩蒂尼等., 2008;2010;). 将AS-ODN和MM-ODN溶解在总体积为200µL的生理盐水中，并在阴茎静脉中注射26 gauge针头。通过Western blot分析和ACh诱导的血管舒张功能测定评估AS-ODN阻断nNOS和eNOS表达的效率。

蛋白质印迹分析

如前所述进行蛋白质印迹，并进行了一些修改(卡佩蒂尼等., 2008). 解剖主动脉环并在Krebs–Henseleit溶液中稳定15分钟。ACh（100µmol·L−1)然后涂抹，8分钟后收集主动脉，并立即在−80°C下冷冻。非模拟主动脉用于基础状况分析。冷冻主动脉在溶血缓冲液中均质（mmol·L−1)：150 NaCl、50 Tris–HCl、5 EDTA.2Na和1 MgCl2含有1%Triton X-100和0.5%SDS以及蛋白酶抑制剂（SigmaFAST®，Sigma，St.Louis，MO，USA）和磷酸酶抑制剂（20 mmol·L−1氟化钠；0.1毫摩尔·L−1纳三VO（旁白）4); 50µg蛋白质在变性SDS/7.5%聚丙烯酰胺凝胶中变性和分离。将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上（Immobilon P；Millipore，MA，USA）。在室温下用2.5%的PBS中的无脂奶粉加0.1%的吐温20封闭斑点，然后与兔多克隆抗nNOS（1:1000）、小鼠单克隆抗nNO S Ser852（1:1000或兔抗β-肌动蛋白多克隆（1:3000），室温下。使用Immobilon Western化学发光HRP底物（Millipore，Billerica，MA，USA）检测免疫反应带。兔多克隆抗eNOS抗体购自Sigma。其他抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。

共焦显微镜

来自野生型和ApoE的胸主动脉的30%蔗糖（PBS中）固定冰冻切片（6µm）−/−将小鼠在洗涤缓冲液（在PBS中的3%BSA+0.3%Triton X-100）中漂洗。经过适当的阻断程序（PBS中3%的BSA；30分钟），二级抗体与交替的一级抗体的交叉反应性被消除。将载玻片与小鼠单克隆抗GAPDH（1:100；Santa Cruz Biotechnology）和兔抗nNOS（1:50；Santa Cruz Bintechnologies）或兔抗eNOS（1:150；Sigma）在4℃孵育过夜，然后与与Alexa Fluor 633（1:500；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）偶联的山羊抗兔二级抗体孵育和山羊抗鼠二级抗体与Alexa Fluor 488（1:500；Invitrogen）偶联1h。用蔡司LSM 510共焦显微镜（美国纽约州桑伍德）对切片进行检查，激发波长为488/633nm，发射波长为505-530/650nm。使用ImageJ®软件1.42q（美国国家卫生研究院韦恩·拉斯班德）测量荧光（任意单位）强度。测量了每片内皮层和介质层的十个场。使用GraphPad Prism 4（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA）绘制并分析每张幻灯片的荧光平均值。ApoE中的荧光强度−/−与野生型动物相比，主动脉表现为折叠增加。

统计分析

结果表示为平均值±SEM。双向方差分析通过Bonferroni的多重比较，使用事后测试来比较浓度-反应曲线。学生的t吨-在其他实验中使用了测试。当P（P）< 0.05.

材料

ACh、过氧化氢酶、Nω-硝基-我-精氨酸甲酯盐酸盐二氧化氮-我-Dbu-NH公司22TFA和苯肾上腺素购自Sigma。

结果

nNOS在ACh诱导的血管舒张以及NO和H中的作用2O（运行）2ApoE的生产−/−小鼠主动脉

ApoE的主动脉环−/−小鼠对ACh的反应表现出血管扩张减少(E类最大值= 54.0 ± 4.1%;P（P）<0.001），与野生动物相比(E类最大值= 95.04 ± 1.55%;图1A、B). ApoE血管舒张反应受损−/−动脉伴有严重的NO损伤(图1A)和H2O（运行）2生产(图1B). 非选择性抑制NOS我-名称（300µmol·L−1)消除血管舒张反应(图2A)和NO生成(图2B)野生型和ApoE−/−老鼠。H（H）2O（运行）2年几乎完全废除了生产我-野生型船舶中的名称。然而，在ApoE中−/−动物，H的生产2O（运行）2非常低，不受影响我-名称(图2C). 有趣的是，1µmol·L对nNOS的选择性抑制−1我-精氨酸二氧化氮-我-Dbu，一种抑制nNOS而不影响eNOS的浓度(黄等., 1999)，减少了ACh诱导的野生型弛豫，但在ApoE中没有−/−主动脉(图2D)，表明nNOS功能和或ApoE表达减少−/−船只。在野生型动物中，nNOS抑制适度降低NO(图2E)但废除了H2O（运行）2生产(图2F). 在ApoE中−/−动物，NO和H2O（运行）2nNOS选择性抑制不影响产量。过氧化氢酶（2400 U·mL−1)，专门分解H2O（运行）2在氧气和水中，野生型动物的血管扩张减少，与nNOS抑制所获得的比例相同。然而，过氧化氢酶对ApoE没有影响−/−主动脉(图S2). H引起的血管舒张反应2O（运行）2菌株之间没有差异(图S3).

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同时测量血管扩张（A、B）、NO（A）和H2O（运行）2（B） ACh刺激野生型和ApoE主动脉的生成−/−老鼠。连续线表示血管扩张（左轴）；虚线：NO（A）和H2O（运行）2（B） 测量值（右轴）。数据显示为至少五个实验的平均值±SEM***P（P）< 0.001.

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（A–C）的影响我-名称（300µmol·L−1)ACh诱导的血管舒张作用（A）、NO（B）和H2O（运行）2（C） 野生型和载脂蛋白E在主动脉中的产生−/−老鼠。（D–F）nNOS的选择性药理抑制我-精氨酸二氧化氮-我-Dbu（1µmol·L−1)野生型血管舒张功能降低，但ApoE没有−/−小鼠（D）。在野生型小鼠中，我-精氨酸二氧化氮-我-Dbu使NO生成量（E）略有减少，并废除了H2O（运行）2（F） ●●●●。NO（E）和H2O（运行）2（F） 未被修改我-精氨酸二氧化氮-我-ApoE中的Dbu−/−老鼠。数据表示至少五个实验的平均值±SEM***P（P）< 0.001.

eNOS和nNOS的表达与定位

Western blot分析显示，ApoE的主动脉中eNOS和nNOS的表达增加−/−老鼠(图3A，D). 免疫定位eNOS和nNOS的共聚焦实验表明，在野生型动物中，这两种酶都存在于内皮细胞中，但在培养基层中不存在(图4A和​和5A）。5A级). 在ApoE中−/−动脉，eNOS(图4C)和nNOS(图5C)与野生型动物相比，内皮细胞的免疫染色增强。此外，在ApoE中−/−血管，这两种酶也显示存在于主动脉的平滑肌层(图4A、B和5A、B级).

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野生型和载脂蛋白E在主动脉中的eNOS（A）和nNOS（B）表达−/−老鼠。乙酰胆碱诱导eNOS-Ser1177（B）、eNOS-Thr495（C）和nNOS-Ser852（E）磷酸化的变化。（F） 脑内nNOS阳性对照。用100µmol·L刺激血管−1ACh公司。直方图表示四个实验的平均值±SEM***P（P）< 0.001; **P（P）< 0.01. 图像是来自四个单独实验的代表性斑点。

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野生型（A，高面板）主动脉环eNOS的免疫荧光检测，ApoE−/−（A，中面板）和eNOS-KD（A，下面板）小鼠。野生型内皮细胞（箭头）中存在eNOS免疫染色，ApoE中表达增加−/−船只。注意eNOS KD（敲除）动物的eNOS免疫染色显著下降。（B，C）来自野生型ApoE的动脉壁（B）和内皮细胞（C）中相对eNOS荧光的图示−/−eNOS-KD动脉。GAPDH用于控制装载目的。图片代表每组五只动物***P（P）与野生型血管相比<0.001。

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免疫荧光法检测野生型（A，高面板）主动脉环中的nNOS，ApoE−/−（A，中面板）和nNOS-KD（A，下面板）小鼠。ApoE的内皮细胞（箭头）中nNOS的免疫染色增强−/−与野生型血管相比。nNOS-KD（敲除）动物的染色明显减少。（B，C）来自野生型ApoE的动脉壁（B）和内皮细胞（C）中相对nNOS荧光的图示−/−和nNOS-KD动脉。GAPDH用于控制装载目的。图片代表每组五只动物***P（P）与野生型血管相比<0.001。

蛋白质印迹法测定eNOS和nNOS磷酸化

我们通过Western blot分析了eNOS和nNOS丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）位点的磷酸化状态。在野生型动物中，ACh使eNOS激活位点Ser1177的磷酸化增加(图3B); 相反，Thr495上酶失活位点的磷酸化状态降低(图3C). 在ApoE中−/−与野生型血管相比，ACh诱导的小鼠eNOS-Ser1177磷酸化和eNOS-Thr495去磷酸化的增加较小(图3B、C). 注意，在基础条件下，ApoE−/−与野生型动物相比，主动脉eNOS-Ser1177的磷酸化水平较低，eNOS-Thr495的磷酸化程度较高。

Ser852上nNOS的失活位点在ApoE的主动脉上显示较高的磷酸化水平−/−小鼠在基础条件下与对照动物进行比较。用ACh刺激后，野生型主动脉中酶失活部位的磷酸化水平降低，但ApoE没有变化−/−船只(图3E).

血管舒张反应，NO和H2O（运行）2eNOS和nNOS击倒动物的生产

eNOS和nNOS对血管反应的个体贡献，以及NO和H2O（运行）2ApoE生产−/−小鼠，通过使用体内eNOS和nNOS表达的AS-ODN敲除。野生型eNOS-KD小鼠显示ACh诱导的血管舒张功能降低(图6A)伴随着NO生成量的大幅下降(图6B)，H无变化2O（运行）2(图6C). ACh诱导的弛豫和NO生成在ApoE中减弱−/−eNOS-KD小鼠(图6D、E). H（H）2O（运行）2ApoE的生产已经受损−/−eNOS-KD动物的主动脉未被修饰(图6F). 野生型nNOS-KD小鼠的主动脉对ACh的血管反应降低(图7A)与其他人的比例相同在体外nNOS和过氧化氢酶的药理抑制，伴随NO生成的少量减少(图7B). 然而，H2O（运行）2这些动物的合成能力大大降低(图7C). 在ApoE的主动脉中−/−动物，nNOS敲除并没有改变对ACh的松驰反应(图7D)或NO和H的生成2O（运行）2(图7E、F). Western blot分析证实AS-ODN治疗能够降低eNOS和nNOS的表达，如图S4.

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的影响体内反义寡核苷酸eNOS敲除（eNOS KD）对血管舒张（A，D）、NO（B，E）和H的影响2O（运行）2野生型（A–C）和载脂蛋白E在主动脉中的（C，F）生成−/−（D–F）小鼠。数据表示至少五个实验的平均值±SEM***P（P）< 0.001.

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的影响体内反义寡核苷酸nNOS敲除对血管扩张（A，D）、NO（B，E）和H的影响2O（运行）2野生型（A–C）和载脂蛋白E在主动脉中的（C，F）生成−/−（D–F）小鼠。数据代表至少五个实验的平均值±SEM***P（P）< 0.001.

讨论和结论

这项工作的主要发现是内皮细胞nNOS在ApoE中的功能−/−小鼠主动脉减少，导致H缺乏2O（运行）2这有助于ApoE中的内皮功能障碍−/−鼠标。

众所周知，在心血管系统中，eNOS衍生NO在调节血管张力中起着重要作用(加兰等., 1995;乌拉卡米·哈拉萨瓦等., 1997). 然而，越来越多的证据表明nNOS在血管内稳态控制中具有生理相关作用。血管平滑肌和内皮细胞中nNOS的表达通常与脑血流的控制有关(世界环境学会等., 1999;阿托钦等., 2003;下冈（Hagioka）等., 2005;基塔拉等., 2007). 此外，在eNOS中−/−小鼠，nNOS在控制冠状动脉循环中起主要作用(黄等., 2002;塔卢克等., 2004;赫洛皮茨基等., 2005). 最近，我们发现nNOS在小鼠主动脉内皮中组成性表达，并有助于ACh诱导的内皮源性血管舒张(卡佩蒂尼等., 2008). 这些发现与nNOS发现的主动脉血管扩张减少相一致−/−老鼠(南格尔等., 2004). 有趣的是，我们已经表明，除了NO，nNOS还产生H2O（运行）2在生理条件下。使用药物抑制剂和反义nNOS敲除，同时测量NO，H2O（运行）2和血管功能，我们证明nNOS衍生的H2O（运行）2是小鼠主动脉中主要的内皮依赖性舒张因子，对小鼠主动脉中内皮依赖性血管舒张有重要作用(拉贝洛等., 2003;卡佩蒂尼等., 2008;2010).

众所周知，动物体内的高脂血症和动脉粥样硬化会减弱内皮依赖性血管扩张(Busse and Fleming，1996年;南格尔等., 2003;拉贝洛等., 2003)和人类(东（Higashi）等2009年;托马等., 2009). 动脉粥样硬化中的内皮功能障碍通常与eNOS衍生NO生物利用度的降低有关；nNOS和H的参与2O（运行）2在动脉粥样硬化中内皮功能障碍尚未阐明。在这项工作中，我们提供了一致的证据，证明nNOS衍生H2O（运行）2ApoE也导致主动脉内皮功能障碍−/−鼠标。根据这一建议，nNOS的选择性药理学抑制降低了ACh诱导的对照组舒张反应，但不降低ApoE的舒张反应−/−鼠标。这些结果被显示类似结果的特异性反义nNOS敲除进一步证实。这些数据表明ApoE中nNOS的功能和/或表达降低−/−动物。然而，ApoE中nNOS蛋白水平增加−/−通过蛋白质印迹分析评估的小鼠主动脉。从ApoE增加nNOS在介质层的表达−/−以前曾报道过小鼠主动脉(斯科德尔等., 2009).

我们的共聚焦数据显示，对照动物的内皮细胞层中存在nNOS免疫染色，这与以前使用不同分析的报告一致(Loesch和Burnstock，1998年;卡佩蒂尼等., 2008). 有趣的是，我们发现nNOS免疫反应在平滑肌细胞层以及ApoE的内皮细胞中增加−/−小鼠主动脉。尽管如此，本研究的一个重要发现是，不同菌株之间nNOS-Ser852磷酸化状态的差异。在野生型主动脉中，ACh使酶失活部位的磷酸化降低，而在ApoE中−/−血管nNOS-Ser852在ACh刺激下保持不变。总之，这些数据表明内皮细胞nNOS功能降低，并表明该酶在ApoE导致的主动脉血管舒张受损中起作用−/−鼠标。

氧化应激与动脉粥样硬化中内皮依赖性舒张功能受损有关。血管壁中活性氧（ROS）水平的增加导致钙处理、电压依赖性表达的改变我-Ca型2+通道、四氢生物蝶呤可用性降低和我-内皮细胞中的精氨酸(劳尔森等., 2001;Katusic和d'Uscio，2004年;弗朗桑等., 2008;埃尔德利等., 2010;傅等., 2010). 因此，我们推测氧化应激可能会导致nNOS功能降低，导致H2O（运行）2-诱导性放松。

据报道，eNOS在载脂蛋白E的主动脉中的表达也增加−/−尽管NO生成减少(布卢米等., 1997;Loesch和Burnstock，1998年;劳尔森等., 2001;库伦科特等., 2004). NO生成的减少与eNOS磷酸化状态的改变有关(费尔南德斯·埃尔南多等., 2007;王等., 2010;山城等., 2010). 与这些数据一致，我们发现ApoE主动脉中eNOS的表达增加−/−这伴随着血管舒张反应降低、eNOS功能降低和NO生成严重受损。

总之，我们的数据表明，过氧化氢酶、nNOS敲除或药物性nNOS抑制可使野生型动物的血管扩张减少一半。ApoE中的内皮功能障碍−/−船只被废除了H2O（运行）2过氧化氢酶、nNOS敲除或选择性药理性nNOS抑制均不影响其生成和血管舒张。相反，eNOS敲除可消除ApoE的血管舒张作用−/−并将野生型动物的血管扩张减少一半。外源性H的血管舒张反应2O（运行）2菌株之间没有差异。这些结果表明（i）H2O（运行）2ApoE抑制主动脉的生成−/−并可能导致动脉粥样硬化中的内皮功能障碍；（ii）虽然严重受损，但NO可解释ApoE中残留的血管舒张作用−/−老鼠。

总之，我们的数据表明ApoE中内皮nNOS活性降低−/−小鼠主动脉。nNOS活性降低导致H受损2O（运行）2导致内皮依赖性血管舒张反应减弱的产物。这些结果表明，内皮功能障碍的一种新机制显示了nNOS衍生H的关键作用2O（运行）2动脉粥样硬化血管舒张反应受损。nNOS可能代表了一个新的靶点来阐述血管动脉粥样硬化的治疗策略。

致谢

本研究得到了FAPEMIG（Fundaço de Apoio a Pesquisa do Estado de Minas Gerais）、CNPq/巴西（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico）和CAPES（Coordenaço de-Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior）的支持。

词汇表

缩写

阿波（ApoE）−/−载脂蛋白E缺乏小鼠
组件ODN反义寡核苷酸
EDRF公司内皮衍生舒张因子
电子NOS内皮一氧化氮合酶
iNOS系统诱导型一氧化氮合酶
杜兰特击倒
低密度脂蛋白低密度脂蛋白
MM-ODN公司错配寡核苷酸
无操作系统神经元NOS

利益冲突

提交人表示没有利益冲突。

支持信息

其他支持信息可以在本文的在线版本中找到：

图S1野生型和ApoE主动脉弓（A）和胸主动脉（B）结构的形态学分析−/−老鼠。来自5个实验的代表性H&E染色切片。比例尺：10µm。

图S2过氧化氢酶的作用（2400 U·mL−1)ACh对野生型和ApoE的血管舒张作用−/−小鼠主动脉。数据代表五个实验的平均值±SEM***P（P）< 0.001.

图S3外源性H的血管舒张作用2O（运行）2野生型和ApoE的主动脉−/−老鼠。实验在50 mmol·L的存在下进行−1氨基三唑（Sigma）抑制内源性过氧化物。数据表示五个实验的平均值±SEM。

图S4西部片分析体内野生型和载脂蛋白E中的反义eNOS（eNOS-KD；A）和nNOS（n-NOS-KD；B）敲除−/−小鼠主动脉。（C） eNOS-KD动物中nNOS的对照实验和（D）nNOS KD主动脉中eNOS的Western blot对照实验。图像是四个实验的代表。条形图表示四个实验的平均值±SEM***P（P）< 0.001.

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文章来自英国药理学杂志由以下人员提供英国药理学学会