磷脂酰乙醇胺及其几种生物合成的作用中的路径酿酒酵母

摘要

简介

两性离子磷脂磷脂酰乙醇胺（PtdEtn）具有形成非双层结构的强烈倾向真核细胞中丰富的这种磷脂（综述判定元件克鲁伊夫，1997). 高PtdEtn含量的膜对建议进行层-六方相变影响膜-膜接触和双层融合的过程囊泡形成和囊泡介导的蛋白质运输。在此外，非双层脂质可能会影响蛋白质与膜，它们在膜内的横向运动，以及折叠和某些膜蛋白复合物的稳定性。

提供遗传和PtdEtn在细胞功能中特殊作用的生化证据是大肠杆菌（审核人Dowhan，1997年). 在这个原核生物，PtdEtn的缺乏可以通过升高二价阳离子存在下的心磷脂（CL），因此保持双层到非双层相变的潜能薄膜(莫林等。, 1996). PtdEtn缺陷E.公司。大肠杆菌突变体表现出复杂的表型变化，包括丝状生长(米利科夫斯卡娅等。, 1998)和乳糖通透酶活性降低。后一个观察结果是归因于缺乏起作用的PtdEtn导致的渗透膜错误折叠作为这种转运蛋白的分子伴侣(博格达诺夫et（等）阿尔。, 1999).在体外，非双层脂质刺激重组细菌蛋白移位酶的活性(范德做等。, 2000).

PtdEtn的生物合成酿酒酵母可以是由磷脂酰丝氨酸（PtdSer）的两条新途径完成胞苷二磷酸的形成和脱羧肯尼迪途径的（CDP）-乙醇胺分支（图​（图1）。1). 在这个有机体中,PtdEtn公司主要通过两条从头合成途径合成达姆等。, 1998). PtdSer的脱羧磷脂酰丝氨酸脱羧酶1（Psd1p）发生在内部线粒体膜(辛塞尔等。, 1991)，而磷脂酰丝氨酸脱羧酶2（Psd2p）定位于高尔基体/液泡隔室(Trotter和Voelker，1995年). 甲基化PtdEtn通过PtdEtin甲基转移酶1（Pem1p）和2（Pem2p）产生磷脂酰胆碱（PtdCho），新生途径的最终产物氨基甘油磷脂合成。

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图1

PtdEtn生物合成途径。PtdEtn的生物合成酿酒酵母三点发生路径，即从头开始或CDP-DAG路径（粗箭头），通过1）线粒体Psd1p或2）Psd2p，和3）CDP乙醇胺肯尼迪通路的分支（细箭头）。

外源性添加到酵母中的乙醇胺（Etn）或胆碱（Cho）培养物或通过脂肪分解过程内源性形成的用于通过Kennedy合成PtdEtn或磷脂酰胆碱（PtdCho）通路。这个分支途径的初始酶，乙醇胺激酶（Eki1p）和胆碱激酶（Cki1pEki1p主要负责Etn的特殊性Cho磷酸化的磷酸化和Cki1p(基姆et（等）阿尔。, 1999). 这两种基因产物加在一起代表了总数细胞乙醇胺和胆碱激酶活性美国。酿酒。磷酸乙醇胺（Etn-P）和磷酸胆碱（Cho-P）通过与三磷酸胞苷（CTP）反应而活化，并且胞苷二磷酸乙醇胺（CDP-Etn）和胞苷二磷酸盐胆碱（CDP-Cho）最终与二酰甘油相连，生成PtdEtn和PtdCho。A类cpt1Δept1Δ双突变体，这条路径的最后一步有缺陷，是可行的，表明在酵母中肯尼迪途径不是必需的在标准生长条件下(麦基等。, 1994). 这个肯尼迪途径通过反应与鞘脂分解代谢有关由二氢鞘氨醇磷酸裂解酶（Dpl1p）催化。这种酶将磷酸化鞘氨醇碱裂解为长链醛和乙醇胺磷酸（Etn-P）(萨巴等。, 1997)允许通过肯尼迪将后一部分并入PtdEtn通路(曼德拉等。, 1998). 这一发现是一致的通过观察Hikiji公司等。(1988)那个cho1Δ磷脂酰丝氨酸缺陷的细胞合成酶在补充胆碱的培养基上积累了一些PtdEtn。

酵母PtdSer由胞苷二磷酸二酰甘油合成（CDP-DAG）和丝氨酸（Ser）通过PtdSer合酶Cho1p的作用（图​（图1），1)定位于内质网（综述通过达姆等。, 1998). 已删除个突变，共个CHO1公司做不含可检测到的PtdSer，对Cho或Etn，表明Cho1p是酵母中唯一的PtdSer合酶PtdSer不是必需的(阿特金森等。, 1980).虽然缺乏PtdSer的酵母细胞是可行的，但它们表现出一些色氨酸转运活性降低等缺陷(中村等。, 2000)空泡功能异常形态发生(哈马松等。, 1994). 缺失的突变体PtdSer脱羧酶，Psd1p或Psd2p，生长类似葡萄糖培养基上的野生型，但psd1 psd2双突变体Etn或Cho营养不良(Trotter和Voelker，1995年). 事实那个cho1号机组和psd1 psd2突变体可以通过仅Cho一人认为PtdCho是一种必需的脂质，而PtdEtn要么是不重要的，要么可以通过鞘磷脂分解提供的Etn-P。的重要性PtdCho得到了以下观察结果的支持：甲基转移酶Pem1p和Pem2p对Cho具有营养缺陷(萨默斯等。, 1988;Kodaki和Yamashita，1989年); 因此，PtdEtn单独使用并不完全替代甲基化磷脂。

线粒体中高水平的PtdEtn(图勒等。,1999)线粒体内膜中存在Psd1p提示该细胞器对PtdEtn的特定需求。收件人调查三者的贡献和相对效率上述PtdEtn合成途径，我们1）遗传分析了这些途径中的每一条，2）分析了线粒体PtdEtn的产生，以及3）研究了PtdEtn导入线粒体。我们证明因为PtdEtn对不可发酵的比可发酵的更严格碳源和PtdEtn仅通过中等效率。

材料和方法

结果

线粒体中PtdEtn水平限制非发酵性细胞的生长碳源

量化线粒体和线粒体外去甲肾上腺素的作用PtdEtn的从头合成，我们跟踪了缺陷突变体的生长液体YP介质中的PtdEtn合成（图​（图2）。2). 与观察结果一致在规定的固体培养基上，非发酵培养基需要的Etn比发酵培养基更多生物合成缺陷菌株的可发酵碳源Ptd等。Etn补充YPLac可促进psd1Δpsd2Δ和cho1Δ突变体与psd1Δ但不是更远。的增长psd1ΔEtn没有进一步增强YPLac补充，因为YPLac含有少量Etn和Cho。这些数据表明，在缺乏线粒体生成的情况下PtdEtn，即inpsd1Δ或cho1Δ菌株，PtdEtn向线粒体的转运成为生长限制。低于在这些条件下，增加的PtdEtn需求不能满足于供应线粒体外合成的PtdEtn。这个通过测定乳酸上生长的各种突变菌株的线粒体分离添加或不添加5 mM Etn（表​（表4）。4). 分析表明不同菌株对乳酸的生长速度与线粒体PtdEtn含量。在一个psd1Δ应变，线粒体PtdEtn减少到相应的约25%野生型水平；在里面psd1Δpsd2Δ和cho1Δ菌株，PtdEtn的减少更为显著达到明显的最低水平1–2%。PtdEtn的减少是通过升高的PtdCho、PtdSer和磷脂酰肌醇（PtdIns）。补充Etn没有线粒体PtdEtn含量显著增加，表明线粒体外空间中可利用的PtdEtn含量较低不是优先输入线粒体，而是用于通过甲基化途径产生PtdCho。占主导地位的Psd1p在线粒体供应中相对于总细胞的作用从PtdEtn的大量富集完整菌株线粒体中的PtdEtnPSD1型（表​（表4）。4). 相反，线粒体psd1Δ,psd1Δpsd2Δ，或cho1Δ突变体的PtdEtn水平与非线粒体亚细胞膜。

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图2

含缺陷菌株在PtdEtn中的生长生物合成。野生型（□），psd1Δ(○),psd2Δ(▵),psd1Δ psd2Δ（●），以及cho1Δ（▴）菌株在YPLac（A）、添加5 mM Etn（B）、YPD（C）、，YPD补充5 mM Etn（D）。

表4

PtdEtn缺陷菌株的磷脂生物合成

应变	生长培养基	磷脂线粒体和细胞匀浆（mol%）
		PA公司		PtdSer公司		铂族锡		PtdCho公司		PtdEtn公司		氯		其他
		M（M）	H（H）	M（M）	H（H）	M（M）	H（H）	M（M）	H（H）	M（M）	H（H）	M（M）	H（H）	M（M）	H（H）
野生类型	YPLac公司	1	2	1	6	13	17	51	53	25	18	7	三	2	1
psd1Δ	YPLac公司	1	2	6	7	13	21	67	58	6	8	5	三	2	1
	YPLac公司+埃顿	1	1	6	6	13	10	63	69	9	9	8	4	1	1
psd2Δ	YPLac公司	1	1	4	7	12	15	45	55	27	17	9	三	1	2
psd1Δpsd2Δ	YPLac公司	1	2	5	7	24	27	64	60	1	1	4	三	1	0
	YPLac公司+埃顿	1	2	9	10	1	11	67	69	三	三	9	4	1	1
cho1Δ	YPLac公司	1	2	ND（无损检测）	ND（无损检测）	25	28	64	61	2	5	6	2	2	2
	YPLac公司+埃顿	1	2	ND（无损检测）	ND（无损检测）	9	17	77	69	6	7	5	三	2	2

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M、 线粒体；H、 匀浆；ND，未检测到。 

显示了两个独立测量的平均值。平均偏差小于5%。 

在线粒体中psd1Δ和psd1Δpsd2Δ突变体，CL含量也降低到～50%补充Etn的控制（表​（表4）。4). 调查线粒体中PtdEtn含量低直接影响参与CL生物合成的酶，我们进行了体外酶CL合成酶和磷脂酰甘油磷酸（PtdGro-P）的测定合成酶。在不添加Etn的YPLac上生长后PtdGro-P合成酶的活性是psd1Δpsd2Δ（0.81±0.04 nmol/min×mg蛋白）与野生型（0.44±0.03nmol/min×mg蛋白质），而CL的比活性合成酶在两个菌株的线粒体中相似（0.081±0.011 nmol/min×mg蛋白质）。因此，观察到的CL减少不是由于参与这种磷脂的生物合成。

糖基磷脂酰肌醇需要PtdEtn（GPI）-锚合成，但不用于羧肽酶Y的分泌（CPY）和转化酶

PtdEtn是连接蛋白质羧基末端氨基酸的GPI锚定(梅农和史蒂文斯，1992年). 因此，PtdEtn的耗尽预计会影响GPI锚定蛋白的形成。为了测试这个预测，我们研究了GPI-锚定Gas1p在一个或两个缺失菌株中的成熟添加Etn的合成葡萄糖培养基上的PtdSer脱羧酶或Cho。Western blot分析（图​（图3A）三A）揭示了内质网的100-kDa Gas1p前体累计在psd1Δpsd2Δ双突变体。前体带最强，成熟带数量最多125-kDa高尔基体形式的Gas1p同时减少，当菌株生长时补充Cho，即当PtdEtn水平为降到最低，磷脂总量不到1 mol%而野生型为20mol%。Gas1p前体积累，虽然以不太明显的方式，在补充了Etn的psd1Δpsd2Δ突变体，支持以下观点Etn是维持PtdEtn池的更有效前驱体这个菌株。

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图3

在耗尽PtdEtn中处理Gas1p和CPY细胞。（A） 野生型（车道1）Gas1p的Western blot分析，psd1Δ（车道2），psd2Δ（车道3），以及psd1Δ psd2Δ（泳道4和5）单元格生长在合成培养基上。的增长psd1Δ psd2Δ补充了Etn（4号车道）或Cho（4号道5). （B） CPY在0、15和30分钟时从野生型中免疫沉淀和psd1Δ psd2Δ单元格合成培养基上细胞生长的脉冲相实验补充了Cho。

因为GPI-锚定-链接和未链接的Gas1p前体内质网不通过凝胶电泳分离上述分析并没有区分GPI-锚的生物合成或在分类或运输中的缺陷从内质网到高尔基体的GPI锚定蛋白。对于因此，我们调查了PtdEtn缺乏是否影响通过测定CPY的动力学得出一般分泌途径成熟度和转化酶分泌率psd1Δpsd2Δ生长在补充有乔。成熟CPY成立于psd1Δpsd2Δ和具有类似动力学的野生型（图​（图3B）。三B） ●●●●。外部和内部这两个菌株的转化酶活性也相似（图​（图4）。4). 这些结果表明一般来说，PtdEtn缺乏不会影响分泌。因此，PtdEtn似乎是GPI-锚生物合成所必需的，尽管我们不能排除GPI-锚定蛋白分类为分泌型小泡特别受脂质环境改变的影响这一过程中涉及的隔间。

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图4

在缺乏PtdEtn的细胞中分泌转化酶。野生型（A）的外部（□）和内部（▵）转化酶活性和psd1Δ psd2Δ（B） 菌种生长在在诱导后测定添加Cho的合成培养基（参见材料和方法）。

讨论

PtdEtn生物合成途径的空间分离和它们不同的效率解释了为什么不同的生物合成路线并不同样适合满足PtdEtn的要求酵母中的可发酵和不可发酵碳源。A最小值通过鞘脂周转形成的PtdEtn水平足够用于在葡萄糖上生长，前提是PtdCho是由Cho通过CDP-Cho（肯尼迪）途径。关于非发酵碳源需要较高水平的细胞PtdEtn，线粒体Psd1p合成PtdEtn变得至关重要。在这些条件下，psd1Δpsd2Δ和cho1Δ删除突变菌株对Etn严格营养不良，因为Dpl1p的内源性Etn-P不足以合成所需的PtdEtn。同样，仅Psd2p途径并不能提供足够的PtdEtn用于psd1Δ上的应变非发酵碳源和PtdSer生物合成增加（外源性Ser）或Kennedy途径（外源性Etn或Cho）变得至关重要。我们从这些结果中得出结论1）PtdEtn通过肯尼迪途径生产比Psd2p使PtdSer脱羧，和/或2）运输PtdEtn线粒体中存在生长速率限制，并且从Psd2p作用位点，而不是PtdEtn合成位点通过肯尼迪途径。然而，必须指出这些酶的步骤中，有一个已经明确定位。

在葡萄糖培养基上，肯尼迪途径只有在细胞缺乏时才是必需的Cho1p或Psd1p和Psd2p两者。在一个psd1Δpsd2Δ背景，删除CKI1号机组是致命的，而删除EKI1号机组只会导致更高的要求对于Etn，尤其是非发酵碳源。A类psd1Δcki1Δ双突变体没有有效地使用Cho作为PtdCho生物合成的来源，因为Eki1p似乎对Etn有特异性，并且Cho激酶相当差活动。此外，删除CKI1号机组(基姆et（等）阿尔。, 1999)，与删除EKI1号机组，减少Cho和Etn转运体Ctr1p的活性，因此可能有助于psd1Δpsd2Δcki1Δ三重突变体。与…对比psd1Δ和psd1Δeki1Δ，的psd1Δcki1Δ突变体无法生长含有不可发酵碳源的Ser补充介质。在psd1Δcki1Δ细胞，PtdSer增强由于有限的该菌株回收磷脂酶D形成的Cho的能力。这些结果也支持Eki1p具有低Cho激酶活性的观点，导致PtdCho水平下降psd1Δcki1Δ无法通过增加补偿的单元格其他脂质的形成。不考虑具体影响属于EKI1号机组和CKI1号机组删除Etn和Cho和PtdEtn通路的可能调控相互作用生物合成，我们可以定义酵母中不同的PtdEtn生物合成途径如下：Psd1p>Cki1p>Psd2p>Eki1p>Dpl1p。

本研究的第二部分重点关注PtdEtn的可能作用在酵母中，尤其是在线粒体中突变菌株显示线粒体需要PtdEtn功能。与PtdEtn的这种函数一致，我们发现生长缺陷psd1Δ,psd1Δpsd2Δ、和cho1Δ乳酸培养基上的菌株与线粒体中PtdEtn含量相关菌株。因为补充Etn从而刺激肯尼迪途径对PtdEtn含量没有显著影响线粒体的psd1Δ,psd1Δpsd2Δ，和cho1Δ突变菌株，我们得出的结论是，除了其有限的形成外，PtdEtn也是线粒体供应不足，从而生长当PtdEtn的线粒体合成缺失时，限制。这个观察结果与我们实验室以前的结果一致通过脉冲相位标记获得，表明PtdEtn由Psd2p或通过Kennedy途径可以导入线粒体，虽然速度很慢(比尔盖梅斯特等。,2000). 然而，线粒体外PtdEtn在缺乏即使在补充Etn，因为它更有效地甲基化为PtdCho比导入线粒体（我们未发表的结果）。

磷脂生物合成受到协调调节，以响应肌醇可用性。脂质生物合成的一些关键酶被外源肌醇抑制，当肌醇变得受限（审查人亨利和巴顿·沃格特，1998). 删除CHO1公司或PSD1型结果为磷脂生物合成基因的去表达与过度生产肌醇的排泄（Opi-表型）。补充Etn属于cho1Δ或psd1Δ缓解这种Opi表型并恢复对肌醇的调节(格里克，1997年).这一监管电路似乎解释了中的PtdInspsd1Δpsd2Δ和cho1Δ通过减压拉紧IN01、，编码肌醇-1-磷酸合成酶，也可能负责CL形成减少psd1Δ和psd1Δpsd2ΔYPLac上的突变体（表​（表5）。5). 像Ino1p，但不像CL合成酶、PtdGro-P合成酶在肌醇反应(格林伯格等。, 1988;沈和Dowhan，1998年). 这一规定解释了试管内增加的PtdGro-P合成酶活性，但CL活性不变合酶，在线粒体中psd1Δ和psd1Δpsd2Δ菌株（见结果）。中的差异CL形成相关酶的体外活性及其降低CL的内容可以解释为PtdIns合成酶、PtdSer合成酶和PtdGro-P合成酶底物CDP-DAG或通过非竞争性抑制PtdSer合成酶肌醇(凯利等。, 1988). 这个假设是与观察到的在cho1Δ细胞导致野生型水平的形成同时诱导了PtdIns的生物合成。此外psd1Δpsd2Δ在补充Etn的情况下生长的菌株显著高于不含Etn的细胞补充，即当CDP-DAG优先用于PtdIn时生物合成（表​（表4）。4). 因此，似乎没有直接联系乳酸缺陷突变体的生长表型PtdEtn生物合成和线粒体的CL含量（图​（图2；2; 表​表4），4)而是通过监管现象间接联系。它是然而，值得注意的是，CL和PtdEtn的总和可能很重要如前所示，用于维持酵母线粒体功能之前用于大肠杆菌薄膜(里特韦尔et（等）阿尔。, 1993). 这一假设得到以下观察结果的支持：CL合成酶基因突变的酵母菌株CRD1号机组表现出PtdEtn水平升高(图勒等。, 1998),以及删除CHO1公司和前列腺素S1（PtdGro-P合成酶）是合成致死的(门卫et（等）阿尔。, 1996).

线粒体形态、膜电位无明显缺陷，或PtdEtn低导致检测到呼吸酶内容。生长缺陷psd1Δ,psd1Δpsd2Δ、和cho1Δ非发酵菌株碳源至少部分是由于呼吸缺陷细胞。我们目前不知道线粒体基因组完全丢失（ρ⁰)或仅部分删除（ρ⁻)在这些菌株中。我们也只能推测这种缺陷是否是由于将核仁锚定到线粒体内部的效率或对复制/分配产生更直接的影响仪器本身。PtdEtn生物合成突变体的活性为未减少非发酵碳源，表明严重生长缺陷psd1Δpsd2Δ和cho1Δ菌株是由于生长急剧下降速率，但不会导致细胞死亡。这些结果支持报告的数据格里亚克等。(1996)，他观察到了类似的效果cho1号机组在没有Etn或Cho的情况下生长的突变体。这个生长停止可能是由PtdEtn的间接作用引起的消耗，例如ATP合成减少，或可能是更直接的影响，例如依赖于膜状态的控制生长机制。

使用ept1Δcpt1Δ双重删除突变体(梅农和史蒂文斯，1992年)揭示了PtdEtn而不是Etn，Etn-P或CDP-Etn是GPI-锚生物合成的前体。我们的数据支持这一结果，即PtdEtn的耗尽导致Gas1p的成熟缺陷。GPI-锚的生物合成在酵母(奥林等。, 1994)，这可能是PtdEtn最低水平的要求。然而，最引人注目的是一般分泌途径不受PtdEtn缺乏的影响（图​（图3B三B和​和4）。4). 这一发现令人惊讶，因为独特的生物物理PtdEtn形成非双层结构的特性被认为影响囊泡介导的蛋白质运输(德克鲁伊夫，1997). 它PtdEtn的残留量不太可能小于1 mol%总磷脂psd1Δpsd2Δ拉紧可以满足这种生物物理要求。相反，似乎在酵母PtdEtn作为膜，目前尚不清楚的代偿作用可能保持细胞所需膜的生物物理特性生存能力。

致谢

使用的缩写：

参考文献