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白血病。作者手稿；PMC 2012年9月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
白血病。2012年3月；26(3): 481–489.
2011年8月23日在线发布。 数字对象标识：10.1038/leu.2011.225
预防性维修识别码：项目经理3227767
尼姆斯：NIHMS313327
PMID：21860432

这个JAK2V617F系列癌基因需要表达诱导型磷酸果糖激酶/果糖二磷酸酶3以促进细胞生长和提高代谢活性

马马莎·雷迪，博士。，1,2 玛格丽特·费尔南德斯，博士。，1,2 阿纳加·德什潘德，博士。，1,2 埃伦·魏斯伯格，博士。，1,2 黑格V.英圭利赞,4 奥马尔·阿卜杜勒·瓦哈布医学博士。，5,6 安德鲁·L·孔医学博士。，三，4 罗斯·L·莱文医学博士。，5,6 詹姆斯·格里芬医学博士。，1,2和马丁·萨特勒，博士。1,2
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补充资料

摘要

骨髓增生性肿瘤（MPNs）的特点是骨髓系细胞过度增殖，经常发生致癌JAK2V617F激酶突变。调节这些疾病能量需求的分子机制尚不清楚。转化细胞倾向于依靠发酵而不是更有效的氧化磷酸化来产生能量。我们在JAK2V617F转化细胞中的数据表明，生长和代谢活动严格依赖于葡萄糖的存在。葡萄糖的摄取和葡萄糖转运蛋白谷氨酸1的细胞表面表达需要致癌酪氨酸激酶。重要的是，JAK2V617F和活性STAT5增加了诱导性速率限制酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3）的表达，该酶通过6-磷酸果果糖-1-激酶控制糖酵解通量。PFKFB3是JAK2V617F依赖性乳酸生成、氧化代谢活性和葡萄糖摄取所必需的。靶向敲除PFKFB3还限制了细胞在常氧和低氧条件下的生长，并阻断了其生长体内小鼠肿瘤形成。总的来说，这些数据表明，诱导型PFKFB3是增加生长和代谢活性所必需的，并通过活性JAK2和STAT5进行调节。因此，特异性阻断PFKFB3活性或表达的新疗法有望抑制JAK2/STAT5依赖性恶性肿瘤和相关癌症。

关键词：髓样瘤，酪氨酸激酶癌基因，信号转导，PFKFB3，JAK2

简介

激活的JAK2V617F点突变存在于大多数骨髓增生性肿瘤（MPN）患者中，包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化，以及其他髓系恶性肿瘤，包括急性髓系白血病，很少出现于骨髓增生异常综合征1JAK2也可以通过其他位点的点突变激活，例如患有急性淋巴细胞白血病的唐氏综合征儿童中的JAK2R683突变2或作为致癌融合的一部分，如PCM1-JAK2融合，作为复发性t（8；9）（p21；p24）的结果三JAK2的这些致癌形式之间的信号机制可能存在实质性重叠。尤其是STAT5（STAT5A/5B，信号转导子和转录激活子5A/5B）转录因子是JAK2的已知靶点，可以参与正常信号传导以及髓系祖细胞的肿瘤生长和扩张，并可能在其他疾病中发挥作用4,5JAK2V617F转化细胞扩增所需的分子机制知之甚少。增殖细胞对能量的需求增加，需要能量来提供合成代谢反应。即使不是所有的癌细胞，大多数也与葡萄糖消耗增加和糖酵解产生能量有关，即使在常氧条件下也是如此（Warburg效应）6这种能源效率低下的机制的重要性和规律还没有得到很好的理解。

在有氧条件下，正常细胞中葡萄糖产生能量的主要途径是线粒体氧化磷酸化。增殖的癌细胞对能量需求的增加与线粒体数量和功能的减少形成对比7以及低能耗发酵6虽然对导致转化细胞糖酵解增加的信号机制知之甚少，但这些途径中的酶及其对催化活性的调节具有相当好的特征。一种关键的速率限制酶是双功能6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶（PFKFB），它催化果糖-6-磷酸磷酸化为果糖-2.6-二磷酸，以及在不同催化位置的反向反应82,6-二磷酸果糖本身不是糖酵解中间体，而是6-磷酸果糖-1-激酶（磷酸果糖激酶-1；PFK-1）的关键变构激活剂9PFK-1将果糖-6-磷酸转化为果糖-1,6-二磷酸本质上是糖酵解过程中不可逆的一步。高细胞ATP或柠檬酸盐水平阻碍PFK-1活性，这可以通过2,6-二磷酸果糖来克服10,11PFKFB家族本身由四个成员组成（PFKFB1-4），亚型3和4水平的增加与实体和液体肿瘤有关。此外，诱导细胞生长的正常刺激已被证明能暂时升高PFKFB3水平，其意义尚不清楚8.

调节Warburg效应的信号机制没有很好的特征，并且可能因癌症类型而异。我们的数据表明，JAK2V617F足以在细胞系模型中诱导糖酵解乳酸的产生。这种代谢变化可能部分由STAT5转录因子的激活引起，STAT5是JAK2V617F的直接靶点。我们提供的数据表明，JAK2V617F/STAT5通路足以诱导PFKFB3的表达。靶向PFKFB3导致增殖和肿瘤生长降低体内证明了JAK2活性形式在转化中的重要作用。在常氧条件下，活性氧（ROS）水平升高也需要PFKFB3，这暗示着通过此代谢途径对线粒体电子传递链活性进行额外调节。总的来说，我们的结果表明靶向PFKFB3的小分子可能是与激活JAK突变相关疾病的一种新的治疗策略。

材料和方法

细胞

人类细胞系KU812（Ph+；CML）和Molm13（FLT3-ITD+；AML）在含有10%胎牛血清（FBS；Lonza，Walkersville，MD）的RPMI 1640（Mediatech，Manassas，VA）中生长；HEL细胞（JAK2V617F+；红白血病）在含有额外丙酮酸钠（1mM；Invitrogen，Carlsbad，CA）的培养基中生长。如前所述，维持小鼠BaF3前B细胞系、表达BCR-ABL、JAK2V617F或FLT3-ITD的BaF3细胞和具有多西环素诱导的构成活性STAT5的BaF4细胞12,13在不含小鼠白细胞介素-3的情况下，用1µg/mL多西环素（西格玛，圣路易斯，MO）诱导STAT5表达。除非另有说明，否则电池应保持在20%O以下2大气。在一些实验中，用激酶抑制剂处理细胞，包括伊马替尼（1µM；Gleevec，Novartis，Basel，Switzerland）、Jak抑制剂I（1µM；Calbiochem，Gibbstown，NJ）和中柱糖苷（50nM；Tocris Bioscience，Ellisville，MO），或生长在不含谷氨酰胺或葡萄糖的培养基中（Mediatech；Gibco/Invitrogen；Teknova，Hollister，CA）。HEK293T细胞在添加10%FBS的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM；Mediatech）中生长。细胞生长通过台盼蓝（Sigma）排除法测量。人类真性红细胞增多症标本是在知情同意的情况下获得的，并得到斯隆-凯特琳纪念癌症中心机构审查委员会的批准。健康献血者标本是从废弃的血小板分离衣领中分离出来的（卡夫家族献血者中心/Dana-Farber癌症研究所）。

葡萄糖摄取的测量

荧光葡萄糖类似物2-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBD-葡萄糖）（Invitrogen）用于流式细胞术测量葡萄糖的相对摄取量。电池（1×106)在37°C的PBS（Mediatech）中与2-NBD-葡萄糖（30µM）孵育20分钟，然后在冷PBS中洗涤两次，并通过流式细胞仪进行分析。抑制剂治疗后葡萄糖摄取的变化被计算为相对于未染色细胞的荧光差异。

乳酸产生量的测量

根据制造商的指示，使用乳酸测定荧光试剂盒（加州山景城BioVision）测量乳酸产量。简单地说，电池（1×106)在无血清培养基中培养3h，测定上清液中的乳酸量。计算相对于对照细胞的乳酸生成变化。

谷氨酸1流式细胞术

使用人（Abcam，Cambridge，MA）和鼠（R&D Systems，Minneapolis，MN）细胞的特异性抗体测定Glut1的细胞表面表达。使用FACSCanto II流式细胞仪和FACSDiva细胞分析软件（BD Biosciences，San Jose，CA）通过流式细胞术分析细胞。抑制剂治疗后葡萄糖摄取的变化被计算为相对于未染色细胞的荧光差异。

免疫印迹法

如前所述，使用标准化学发光技术进行免疫印迹14.兔抗PFKFB3多克隆抗体（加利福尼亚州圣地亚哥Abgent；加利福尼亚州伯灵盖姆Epitomics）、HIF1α（马萨诸塞州丹弗斯Cell Signaling）、HIF2α（DFCI Kaelin博士善意提供）、MYC（印第安纳波利斯罗氏应用科学）、STAT5（加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz Biotech）、磷酸-STAT5（Y694-细胞信号转导）和小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体（AC-15；Sigma）用于检测蛋白表达。

使用慢病毒方法进行靶向击倒

使用含有针对PFKFB3的shRNA慢病毒和一个加扰对照进行PFKFB2的敲除。在六个结构中，使用了两种不同的结构（RNAi筛查设施，Dana-Farber癌症研究所）（C和D）。使用病毒包装载体pMD2.GVSV-G和pCMVΔ8.91（RNAi筛选设施）和使用TransIT（Mirus，Madison，WI）试剂的shRNAs共同转染HEK293T细胞，产生慢病毒。HEL细胞在聚布雷（5µg/mL；Millipore，Temecula，CA）存在下感染，并在含有嘌呤霉素（3µg/mL；Sigma）的培养基中选择一周。对于长期体内实验中，将三个不同的克隆群体与靶向敲除组合在一起。免疫印迹法证实了敲除的有效性。

细胞内活性氧的测定

如前所述，使用细胞可渗透氧化还原敏感荧光色素DCF-DA（2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯；钙生物化学）通过流式细胞术测定ROS的相对细胞内水平13简单地说，电池（1×106)与DCF-DA（20µM）在37°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育5分钟，然后在冷PBS中洗涤两次。计算相对于对照细胞的ROS变化。

半定量实时PCR

PFKFB3基因表达通过半定量实时PCR测量，使用特异性引物（正向5’-GGGAGTTGGTCAGCTTTG-3’；反向5’-AAGAGCGTTGGAACTGA-3’）和人60S酸性核糖体磷蛋白P0（hRPLPO）对照引物（正向5’-GTGAGGTGCAGCTGATCAAGACT-3’；反向5’-GAGAGGCCCAAACTG-3’）。PCR产物经DNA测序确认（未显示）。提取总RNA（RNeasy kit，Qiagen，Valencia，CA）以合成cDNA（Taqman逆转录试剂，Applied Biosystems，Foster City，CA），用于使用7500 real-time PCR系统（Applied生物系统）进行半定量实时PCR（Power SYBR绿色PCR主混合，AppliedBiosystes）。

2,6-二磷酸果糖的测定

如前所述，通过刺激马铃薯焦磷酸依赖性果糖-6-磷酸激酶，在细胞的加热碱性提取物中测量细胞内2,6-二磷酸果糖的水平。15

体内小鼠研究

使用靶向敲除PFKFB3的HEL细胞，并与含有干扰shRNA的细胞进行比较。动物研究在Lurie家庭成像中心（Dana-Farber癌症研究所）按照Dana-Fabber癌症研究院动物护理和使用委员会批准的方案进行。对于体内给药，5×106将细胞洗涤，重悬于70µL PBS（Mediatech）中，并与30µL BD Matrigel Matrix（BD Biosciences，Bedford，MA）合并。将细胞悬液皮下注射到雌性SCID/米色小鼠（8只/组；5-6周龄；马萨诸塞州威尔明顿Charles River Laboratories）的右侧。肿瘤可触及后，每3-4天测量一次肿瘤体积。当肿瘤达到任何尺寸的2 cm或溃疡时，处死小鼠。

统计分析

对于组间的统计比较，学生的t吨-使用了测试。体内实验采用单因素方差分析（ANOVA）/Tukey多重比较检验进行分析。第页小于0.05的值被认为是显著的。误差条表示至少三个独立实验的SEM（平均值的标准误差）。

结果

JAK2V617F激酶活性是增加葡萄糖摄取和代谢所必需的

骨髓增生性肿瘤通常与激活JAK2V617F突变有关，导致生长增加，从而提高能量需求。一般来说，转化细胞被认为通过增加糖酵解和低能量发酵来满足其对细胞能量的需求。JAK2V617F转化的细胞中调节代谢变化的机制尚不清楚。使用JAK2V617F转化的HEL细胞，我们发现抑制JAK2激酶活性显著降低葡萄糖摄取（对照组的60.6±2.7%）(图1A，左侧面板）。用伊马替尼处理的BCR-ABL转化细胞株KU812（对照组的40.1±16.0%）和用米多糖处理的含FLT3-ITD的Molm13细胞（对照组36.3±4.0%）也观察到类似的葡萄糖摄取变化(图1A（右面板），以及通过BCR-ABL（对照的34.1±7.4%）、JAK2V617F（对照的54.5±2.5%）或FLT3-ITD（对照的53.7±4.1%）转化的BaF3细胞，以响应其各自的酪氨酸激酶抑制剂(补充图S1). 此外，与亲代BaF3细胞相比，表达JAK2V617F（增加371.2%）的小鼠BaF3。EpoR细胞以及表达BCR-ABL（增加371.7%）或FLT3-ITD（增加465.7%）的BaF3(图1B). 酪氨酸激酶介导的葡萄糖摄取增加可能在这些癌基因中共享。接下来，我们检查了HEL细胞中葡萄糖的生长需求，并将其与另一种潜在的能量来源谷氨酰胺进行了比较。细胞在有无葡萄糖、谷氨酰胺或其组合的情况下生长。与正常血清（未显示）相比，这些实验所需的透析血清本身并没有显著改变细胞生长。我们的数据表明，在这些实验条件下，培养基中缺乏葡萄糖会完全阻止细胞生长并导致生存能力丧失，而缺乏谷氨酰胺会将生长降低到对照的48.3±4.1%(图1C，左侧面板）。在表达BCR-ABL的K562细胞系（未显示）和表达JAK2V617F、BCR-ABL或FLT3-ITD的BaF3细胞中也观察到类似的葡萄糖依赖性(补充图S2). 重要的是，HEL细胞还需要JAK2V617F激酶活性来增加乳酸水平，这是糖酵解增加的迹象。在存在Jak抑制剂的情况下，乳酸积累降至对照组的53.2±1.0%(图1C，右侧面板）。此外，与葡萄糖依赖性生长类似，在没有葡萄糖的情况下，乳酸的生成几乎完全消失（对照组的4.6±0.3%），而谷氨酰胺的额外缺乏并没有进一步改变乳酸水平（对照组4.0±0.5%）。在表达JAK2V617F、BCR-ABL和FLT3-ITD的BaF3细胞中发现了类似的结果(补充图S3). 葡萄糖摄取增加、乳酸生成增加以及对葡萄糖的依赖性与糖酵解在JAK2V617F转化中的重要作用一致。

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JAK2V617F表达细胞中的葡萄糖代谢受到刺激

A和B，通过流式细胞术在KU812、HEL和Molm13细胞中测量2-NBD葡萄糖摄取的变化，以响应其各自致癌酪氨酸激酶的抑制剂（A），并且在BaF3细胞中与含有BCR-ABL、JAK2V617F或FLT3-ITD（B）的细胞相比（n＝3）。典型实验如左面板所示。C、 通过台盼蓝排除法测定HEL细胞的生长（左面板），并测量乳酸生成的变化（右面板），以响应对照培养基、Jak抑制剂（1µM）或缺乏（△）谷氨酰胺（Q）和/或葡萄糖的培养基（n=3）。*，表明对照细胞和处理细胞（A、C）或亲代BaF3细胞与其转化的含有致癌酪氨酸激酶的对应细胞（B）之间存在显著差异（p<0.05）。

JAK2V617F增加谷氨酸1和PFKFB3的表达

为了进一步了解与葡萄糖摄取和糖酵解增加相关的生化变化，我们首先寻找参与此代谢途径的基因表达异常。流式细胞术检测Jak抑制剂对HEL细胞中谷氨酸1的表达。尽管HEL细胞对谷氨酸1呈阳性染色，但细胞表面的表达因JAK2激酶活性的抑制而降低(图2A，左图），类似于在Jak抑制剂处理的表达JAK2V617F的BaF3.EpoR细胞中观察到的变化(图2A，中间面板）。与缺乏生长因子的亲代细胞相比，在BaF3.EpoR细胞中，JAK2V617F的表达导致细胞表面谷氨酸1的表达显著增加(图2A，右侧面板）。其他实时PCR数据显示，尤其是HEL细胞中的速率限制性HK2（己糖激酶2）和PFKFB3（磷酸果糖激酶3）受到Jak抑制剂的调节（未显示）。由于糖酵解在缺氧（0.1%O2)与常氧（20%O2)，我们测量了正常和低氧压力下PFKFB3的表达。发现PFKFB3的蛋白表达在低氧条件下增加，在Jak抑制剂的作用下降低。(图2B). 据认为，Myc以及低氧诱导蛋白HIF1α和HIF2α参与调节参与葡萄糖代谢的基因16,17所有三种蛋白均被Jak抑制剂部分抑制，而只有Myc在常氧条件下表达，在缺氧条件下表达降低(图2B). 这表明JAK2V617F诱导的PFKFB3的表达在常压条件下不依赖HIF1α或HIF2α，并且由于这两种蛋白的差异表达，预计MYC不足以在缺氧条件下表达PFKFB。在BaF3细胞中，JAK2V617F的表达足以诱导PFKFB3水平，这与表达BCR-ABL和FLT3-ITD的细胞相当(图2C). 为了进一步证实这些数据，我们还通过实时PCR观察了JAK2V617F+真性红细胞增多症样本（n=6）中粒细胞与健康供体（n=4）相比PFKFB3 mRNA表达的变化。与健康献血者的平均表达水平相比，PFKFB3表达显著增加（增加9.1倍，p<0.05）(图2D). 因此，这些数据表明致癌酪氨酸激酶活性与PFKFB3表达之间存在潜在联系。

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JAK2V617F与谷氨酸1和PFKFB3的表达增加有关

A、 流式细胞术检测细胞表面谷氨酸1的表达。将BaF3细胞与表达JAK2V617F或HEL和BaF3.EpoR的细胞进行比较。如图所示，JAK2V617F细胞未经处理或用Jak抑制剂处理（1µM，18 h）（典型实验显示）。B、 通过免疫印迹法测定在常氧（20%O）下维持的HEL细胞中PFKFB3、MYC、HIF1α、HIF2α和β-肌动蛋白的表达2)缺氧（0.1%O2)条件。C、 通过免疫印迹法测定亲代BaF3和含有BCR-ABL、JAK2V617F或FLT3-ITD的细胞中PFKFB3和β-actin的表达。D、 比较健康献血者（HD）和真性红细胞增多症患者（PV）标本中PFKFB3的mRNA表达。计算与健康献血者PFKFB3平均表达相关的变化。

活性STAT5足以诱导PFKFB3表达

STAT5转录因子通过JAK2V617F磷酸化激活，并需要转化。活性STAT5对PFKFB3的影响尚不清楚。我们研究了STAT5在PFKFB3表达和代谢功能调节中的潜在作用，使用之前生成的具有多西环素诱导的活性转化STAT5的BaF3细胞。通过强力霉素治疗诱导活性STAT5的表达，增加磷酸化STAT5（磷酸化-Tyr694)以及PFKFB3的表达(图3A). PFKFB3的诱导也与代谢活性增加有关。我们观察到活性STAT5表达细胞葡萄糖摄取增加（38.6±2.0%增加）(图3B)但变化小于表达JAK2V617F的BaF3细胞(图1B). 此外，活性STAT5导致乳酸生成量增加了8.7倍(图3C)这与糖酵解增加一致。因此，这些数据意味着活性STAT5足以诱导PFKFB3的表达并增加代谢活性，但很可能体内其他因素可能在JAK2V617F的糖酵解调节中发挥作用。

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STAT5通路的激活足以增加新陈代谢

使用含有强力霉素诱导的成分活性STAT5（−）的未经处理的BaF3细胞，并与含有1µg/mL强力霉素（DOX）的细胞（+）进行比较。通过免疫印迹法（A）测定活性STAT5、PFKFB3和β-肌动蛋白的表达。根据活性STAT5的表达测定葡萄糖摄取（B）和乳酸生成（C）的变化（n=3）。*，表明活性STAT5表达细胞与对照细胞之间存在显著差异（p<0.05）。

JAK2V617F转换需要PFKFB3

为了证实PFKFB3在增加代谢和糖酵解中的作用，我们使用有针对性的方法来抑制其酶活性。克莱姆等人。18最近发现了几种具有抗PFKFB3活性的小分子药物，包括3-（3-吡啶基）-1-（4-吡啶基）-2-丙烯-1-酮（3PO）。我们发现，3PO以剂量依赖的方式有效地降低了HEL细胞中的乳酸生成，治疗18小时后，从10µM 3PO开始，乳酸的相对生成受到显著抑制（对照组的76.7±1.0%，n=3，p<0.05）(图4A). 众所周知，小分子药物经常抑制其他靶点，因此我们也使用基于慢病毒的shRNA方法来抑制PFKFB3的表达。在测试的六种shRNA结构中，有两种结构与含有扰乱序列的结构相比，显著降低了HEL细胞中PFKFB3的蛋白质水平(图4B). 实时PCR也证实了PFKFB3敲除的有效性（未显示）。此外，使用PFKFB3靶向结构体C（7.8±2.5%的对照，n=3，p<0.005）和D（9.9±2.5%对照，n=3，p<0.05）的HEL细胞中发现2,6-二磷酸果糖水平显著降低。接下来，通过测量葡萄糖摄取和细胞内ROS的变化来确定PFKFB3敲除对葡萄糖代谢的影响，作为线粒体电子传递变化的指标。与PFKFB3在葡萄糖和能量代谢中的重要作用一致，敲除降低了HEL细胞的乳酸生成（对照的62.9%–68.7%）以及细胞内ROS（对照的65.9%–67.8%）和葡萄糖摄取（对照的47.7%–55.6%）(图4C). 这些数据表明PFKFB3在HEL细胞的过度活跃葡萄糖代谢中起着关键作用。

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PFKFB3与代谢增加有关

A、 用3PO处理HEL细胞18小时，并测量乳酸生成。如图所示，使用了B和C、含有干扰shRNA（Scr）的HEL细胞或两种不同的PFKFB3靶向结构体C和D。B、 免疫印迹法检测PFKFB3和β-肌动蛋白的表达。C、 根据PFKFB3敲除（n=3），测量乳酸生成（左面板）、细胞内ROS水平（中面板）和2-NBD-葡萄糖摄取（右面板）的相对变化。*，表明对照组和处理组细胞之间存在显著差异（p<0.05）。

PFKFB3对肿瘤生长至关重要体内异种移植小鼠模型

此外，还测试了PFKFB3抑制剂3PO对细胞生长的影响。HEL细胞48h处理导致细胞生长的剂量依赖性减少，EC503µM(图5A). 从这些数据来看，尚不清楚3PO是否对PFKFB3活性产生特定影响，或者是否存在导致细胞生长减少和活力丧失的额外靶点。为了澄清这一点，我们使用了PFKFB3基因敲除的HEL细胞，并在常氧和低氧条件下测量了细胞生长。与常氧相比，缺氧条件下含有干扰shRNA的细胞的生长总体下降44%(图5B). PFKFB3基因敲除的细胞在缺氧条件下表现出与正常氧条件下的对照细胞相似的细胞生长进一步减少（减少43%–53%）。此外，PFKFB3基因敲除显著降低细胞生长，与氧压无关。生长变化的部分原因是PFKFB3基因敲除后细胞凋亡增加。我们发现，这两种结构均显著增加了膜联蛋白V/丙二醛阳性细胞的比例8.2–15.2%（n=3；p<0.05）(补充图S4). 相反，我们只观察到细胞周期分布或跨阱迁移的微小但不显著的差异在体外（未显示）。最后，将含有扰乱shRNA的HEL细胞皮下注射到SCID/米色小鼠（n=8）中，并与含有靶向PFKFB3的两种不同shRNA构建体中的任一种的细胞进行肿瘤生长比较。令人惊讶的是，PFKFB3敲除的HEL细胞不支持体内肿瘤生长程度与在体外细胞生长。含有PFKFB3-C的细胞可触及的肿瘤体积显著减少（76.3±40.6 mm三，n=8，p<0.0001）或PFKFB3-D（87.2±22.7 mm三，n=8，p<0.0001）shRNA构建，与含有干扰shRNA的细胞可触及的肿瘤体积（728.4±132.1 mm）相比三，n=8；第18天）(图5C). 总的来说，这些数据表明PFKFB3是具有活性JAK2/STAT5通路的细胞转化的重要调节因子。

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增加增长需要PFKFB3

A、 用不同浓度的3PO处理HEL细胞48h，并测定细胞生长。B、 使用含有干扰shRNA或PFKFB3靶向结构体C和D的HEL细胞来测量在常压（20%O2)或缺氧（0.1%O2)条件（n＝3）.*，表明对照组和处理组细胞之间存在显著差异（p<0.05）。C、，体内在SCID/米色小鼠（n=8）中测定了靶向敲除PFKFB3（■，△）或打乱shRNA（●）的HEL细胞的肿瘤形成。首次注射后18天测量并比较皮下肿瘤的体积。**，表明打乱和PFKFB3靶向结构体C和D（肿瘤细胞注射后11、14和18天）之间存在显著差异（p<0.0001）。

讨论

转化细胞通常被认为与糖酵解通量增加有关，并倾向于将大部分葡萄糖导向乳酸发酵，从而覆盖部分或大部分细胞能量（ATP）需求。这种明显低效的能量生产方式，通常在缺氧条件下激活，即使在常氧条件下也会发生（沃伯格效应）6这些代谢变化中涉及的分子开关以及这些事件的意义才刚刚开始阐明。对我们的细胞系数据的一个令人惊讶的观察是，细胞生长和存活完全依赖葡萄糖，提示糖酵解是具有活性JAK2/STAT5通路的细胞转化的关键途径。我们的结果表明，代谢变化不仅仅是癌细胞的固有活动，而是可由JAK2V617F致癌酪氨酸激酶特异性诱导的协同事件。调节糖酵解酶表达变化的信号机制主要与转录因子有关，这些转录因子对表达具有相当大的全局影响，包括Myc和Hif1α/Hif2α16在我们的模型中，STAT5转录因子被发现是PFKFB3的强诱导剂。目前尚不清楚STAT5是否可以直接增强PFKFB3的表达，或者是否通过其他机制实现，例如活性STAT5上调MYC或HIF2α12,19MYC和HIF蛋白被认为是转化细胞代谢重编程的关键调节因子16,17另一种可能性可能是STAT5的下游效应物参与调节PFKFB3的表达。应该强调的是，PFKFB3不仅可以在转录水平上调节，而且也是泛素化和蛋白酶体降解的靶点20，可选拼接21,22以及丝氨酸磷酸化激活21这些都可能对该酶的功能表达产生额外的影响。

STAT5在含有酪氨酸激酶癌基因的血液恶性肿瘤中经常激活，但并非唯一激活，也可在肺癌、前列腺癌和乳腺癌中发现23–25与这一观察结果一致，PFKFB3的高水平也经常出现在各种实体肿瘤中，包括脑癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和甲状腺癌26,27因此，STAT5可能参与这些疾病中PFKFB3的调节。尽管我们的研究集中在具有活性JAK2/STAT5的细胞上，但不能排除独立于该途径的机制也可能参与PFKFB3的调节。如前所述，PFKFB3的一个主要功能是允许通过PFK1的高糖酵解通量，即使在ATP水平升高的情况下也是如此。转化细胞对能量的需求本来就很高，因此限制了过量的ATP水平。酪氨酸激酶致癌基因转化的细胞尤其如此，这导致细胞蛋白质大量磷酸化。最近，Fang等人。28描述了癌症细胞中与解除调控的PI3K通路相关的ATP调节机制。定位于内质网的UTPase ENTPD5（外核苷三磷酸二磷酸水解酶5）的过度表达与ATP消耗和糖酵解增加有关。ENTPD5促进蛋白质N-糖基化和折叠，并与胞苷单磷酸激酶1和腺苷酸激酶1协同作用，将ATP水解为AMP。因此，在缺乏足够的JAK2/STAT5激活的情况下，该途径可能构成PFKFB3调节PFK-1的替代机制，或者它可能通过降低细胞ATP水平来补充PFKFB对PFK-1调节。

高糖酵解通量和Warburg效应并不排除癌细胞中线粒体活性增加的可能性。例如，我们之前已经证明，BCR-ABL转化细胞中葡萄糖代谢的升高与细胞内ROS水平的升高有关29,30这些活性氧的大多数是线粒体电子传递链反应的副产物13这将支持这样一种观点，即糖酵解通量和丙酮酸产量的增加不仅会提高乳酸水平，还会刺激线粒体电子通量。然而，线粒体在转化细胞中可能表现出功能性降低，并且可能不是提供细胞能量的重要因素7但葡萄糖代谢增加与这些活动变化之间的因果关系尚未建立。我们的结果表明，PFKFB3基因敲除后细胞中的活性氧降低，这表明该酶可能也是调节线粒体活性氧的关键分子。这种途径与疾病过程特别相关，因为活性氧可能不仅仅是一种副产品。活性氧参与调节细胞信号事件，可能是DNA损伤的主要原因，并有可能导致基因组不稳定31在慢性粒细胞白血病中，活性氧与BCR-ABL激酶结构域的点突变引起的DNA损伤和耐药性有关32预计这种耐药的基本机制对所有糖酵解活性高和细胞内活性氧升高的癌症都有广泛的影响。因此，限制PFKFB3的功能可能有助于维持基因组的稳定性，并有望延缓耐药性的发生和疾病的进展。

我们使用慢病毒shRNA方法的数据表明PFKFB3对体内肿瘤生长和扩展以前的数据33通过将其调节至少部分地与JAK2/STAT5通路的激活联系起来。JAK/STAT信号通路在糖代谢失调中的作用尚未得到充分认识，其调控的靶向机制可能为新的治疗方法开辟了一条途径。我们使用了小分子药物3PO，这是一种以前被鉴定为PFKFB3有效抑制剂的化合物18，有效地抑制乳酸的产生和细胞长期接触该药物导致细胞生长急剧下降。目前尚不清楚3PO是否有额外的非靶向效应，但这些结果与我们的遗传方法一致。针对糖酵解机制，作为碳代谢的中心途径，显然值得关注。已知PFKFB3基因敲除小鼠具有胚胎致死性34，表明这种酶不仅在转化细胞中，而且在增殖或分化组织中发挥着至关重要的作用。PFKFB3在成年小鼠中的功能作用尚未研究，可能存在很大差异。然而，PFKFB3抑制剂3PO在小鼠模型中表现出有效性，没有引起明显的副作用18，表明该方法的可行性。在人类中，PFKFB3靶向PFK-1有三种亚型。肌肉特异性PFKM亚型缺陷会导致糖原贮积病7型（GSD7或Tarui病），其特征是不同程度的运动不耐受、肌病、肌肉和红细胞PFK活性丧失或先天性非球细胞溶血性贫血35人们预计，以PFKFB3为靶点会导致副作用的风险有所增加，类似于该病的症状。现在，重要的是要看看不同的肿瘤是否对PFKFB3有类似的依赖性，以及靶向其表达对肿瘤生长的影响是否与我们的模型相似。

补充材料

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致谢

财政支持：这项工作得到了国家卫生研究院拨款（CA134660-03，M.S.）的部分支持。R.L.L.是Geoffrey Beene初级主席。

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