胃肠病学。作者手稿；PMC 2012年12月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
PMCID公司：PMC3221932型
尼姆斯：美国国家卫生研究院32127
缺乏白细胞介素（IL）-10、IL-12p40和IL-13Rα2的小鼠加速、进行性和致死性肝纤维化
,1 ,2 ,1,§ ,1,† ,1 ,1和1,*
玛格丽特·曼汀·凯恩
1寄生虫病实验室屏障免疫与修复项目美国马里兰州贝塞斯达国立变态反应和传染病研究所国立卫生研究院，20892
艾伦·W·契弗
2马里兰州罗克维尔生物医学研究所，邮编：20852
马克·威尔逊
1寄生虫病实验室屏障免疫与修复项目美国马里兰州贝塞斯达国立变态反应和传染病研究所国立卫生研究院，20892
萨蒂什·马达拉
1寄生虫病实验室屏障免疫与修复项目美国马里兰州贝塞斯达国立变态反应和传染病研究所国立卫生研究院，20892
劳拉·梅根啤酒
1寄生虫病实验室屏障免疫与修复项目美国马里兰州贝塞斯达国立变态反应和传染病研究所国立卫生研究院，20892
Thirumalai R.Ramalingam公司
1美国马里兰州贝塞斯达国家过敏和传染病研究所寄生虫病实验室屏障免疫和修复项目，20892
托马斯·韦恩
1寄生虫病实验室屏障免疫与修复项目美国马里兰州贝塞斯达国立变态反应和传染病研究所国立卫生研究院，20892
1寄生虫病实验室屏障免疫与修复项目美国马里兰州贝塞斯达国立变态反应和传染病研究所国立卫生研究院，20892
2马里兰州罗克维尔生物医学研究所，邮编：20852
§当前地址：伦敦医学研究委员会分子免疫学部国家医学研究所（NIMR）。NW7 1AA。英国
†当前地址：俄亥俄州辛辛那提市肺内科辛辛那蒂儿童医院医疗中心，邮编：45229
*通讯作者：通信收件人：Thomas A.Wynn博士，美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所寄生虫病实验室免疫发病科主任，DHHS，50 South Drive，6154室，MSC 8003，Bethesda，MD 20892，301-496-4758（电话），vog.hin.diain@nnywt，301-480-5025（传真） - 补充资料
1
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摘要
背景和目标
进行性纤维化导致几种慢性疾病的发病率；它通常发展缓慢，因此控制其发展和解决的机制很难建模。细胞因子白介素-10、白介素-12p40和白介素-13Rα2调节寄生虫感染后的肝纤维化曼氏血吸虫我们检测了这些介质是否相互作用以减缓血吸虫病小鼠肝纤维化的进展。
方法
白介素-10−/−,IL-12/23（p40）−/−，和白细胞介素-13Rα2将−/−小鼠杂交产生三敲除小鼠（TKO）。我们对这些小鼠进行了研究，以确定这3种免疫反应负调控因子的同时缺失是否会加速感染后肝纤维化的死亡率曼索尼.
结果
炎症诱导曼索尼与野生型小鼠相比，TKO小鼠的肝纤维化和死亡率显著增加；100%的TKO小鼠在感染后10周内死亡。发病率和死亡率与门静脉高压、肝脾肿大、胃肠道出血、腹水、血小板减少、食管和胃静脉曲张、贫血和肝酶水平升高有关，所有这些都是晚期肝病的特征。IL-10、IL-12p40和IL-13Rα2降低了促纤维化细胞因子IL-13的产生和活性。抗IL-13的中和抗体降低了TKO小鼠的发病率和死亡率曼索尼感染。
结论
IL-10、IL-12p40和IL-13Rα2协同抑制感染曼索尼该模型快速重现了在晚期肝硬化患者中观察到的许多并发症，因此可用于评估正在开发的抗纤维化试剂对血吸虫病或其他与T-helper 2细胞介导的免疫反应相关的纤维化疾病的疗效。
关键词：Th2反应、小鼠模型、免疫调节、T细胞反应、寄生虫病
简介
肝纤维化发生在各种临床环境中，通常与慢性疾病有关，包括酒精中毒、持续或未经治疗的传染病（包括病毒性肝炎和血吸虫病）和自身免疫性肝炎。西方社会的许多肝纤维化病例与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）有关，并与肥胖和II型糖尿病的增加有关1虽然起始刺激不同，但肝脏中的炎症和脂肪变化会导致肝细胞损伤和死亡。这反过来又会产生免疫和组织修复反应。在慢性病中，组织修复反应导致胶原蛋白过度沉积和肝功能受损2–4.
在感染寄生虫的小鼠中建立了控制肝纤维化的免疫调节反应模型曼氏血吸虫5.寄生虫卵被困在肝门静脉，并诱发以CD4为特征的肉芽肿性炎症+产生IL-4、IL-5和IL-13的Th2细胞6肝肉芽肿反过来引发组织重塑反应，包括基质金属蛋白酶（MMPs）、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）和胶原蛋白的诱导7在未经治疗的人类血吸虫病中，组织损伤、炎症和纤维化的反复循环可导致严重的危及生命的并发症，如门脉高压、静脉曲张出血和最终死亡，通常是在感染数年后8.
除了血吸虫诱导的肝纤维化外，还开发了其他小鼠模型来帮助识别调节肝纤维化的因素。这些包括四氯化碳暴露、酒精诱导的纤维化和胆管结扎（BDL）9虽然这些模型对肝纤维化的发生提供了许多重要的见解，但它们往往无法复制与慢性肝纤维化相关的并发症，包括门脉高压的发展、食管静脉曲张的形成、腹水和贫血10这些共同病症的发展需要肝脏的反复损伤，并且通常会持续一段时间。事实上，除了慢性血吸虫感染模型外，很少有实验性纤维化模型能产生与慢性和进行性疾病相关的病理后遗症。因为我们研究肝纤维化的主要目的是预防或减缓这些危及生命的后遗症的发展11，血吸虫病小鼠模型提供了一个有用的系统来评估抗纤维化治疗在定义明确的慢性肝纤维化实验模型中的疗效12.
几项研究表明，Th2相关细胞因子IL-13是以下纤维化的主要驱动因素曼索尼感染13–15例如，与WT小鼠相比，IL-13缺乏的小鼠减少了纤维化，尽管其虫子负担和肉芽肿性炎症相似。因此，第13页−/−和白介素-13Rα1−/−小鼠在感染后的存活时间比WT大得多15,16我们一直在研究调节IL-13活性的机制17并确定了三种不同的负调控途径。其中包括IL-13Rα2——一种针对IL-13的高亲和力诱饵受体14; IL-12p40–Th1和Th17应答的关键驱动因素18IL-10是一种有效的免疫抑制细胞因子19在这里，我们交叉了IL-13Rα2−/−，IL-12/23（p40）−/−和IL-10−/−小鼠产生三重敲除小鼠（TKO），并检查在缺乏三种负调控机制的情况下是否加速了肝纤维化的进展。
材料和方法
老鼠
女性BALB/c，BALB/cIL-13Rα2−/−，BALB/c IL-10−/−，BALB/c IL-12/23（第40页）−/−，BALB/c IL-10−/−IL-13Rα2−/−，BALB/c IL-10−/−IL-12/23（第40页）−/−，BALB/c IL-10−/−IL-12/23（第40页）−/−白细胞介素13受体α2−/−（所有基因KO小鼠回交≥10代至BALB/c），6-8周龄，在位于Taconic（Germantown，NY）的NIAID动物设施中饲养。根据NIAID动物护理和使用委员会批准的动物研究提案，按照《实验动物护理和利用指南》中的程序，将所有小鼠置于美国国立卫生研究院（NIH）批准的AAALAC设施中的特定无病条件下。
感染和治疗
小鼠通过尾部经皮感染25-35株波多黎各毒株尾蚴曼索尼（NMRI）（生物医学研究所，马里兰州罗克维尔）。使用大鼠抗鼠IL-13单克隆抗体（CNTO 134；IgG2a同型，Centocor，Inc，Horsham，PA）进行抗IL-13治疗
RNA的分离、纯化和实时PCR
如前所述，从整个肝组织样品中制备总RNA16在ABI Prism 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）上进行实时聚合酶链反应。（Ramalingam、Pesce等人，2008年）。
组织病理学和纤维化
如前所述，将组织固定在Bouin-Hollande固定剂中，并嵌入石蜡中进行切片和染色16200 mg肝脏在5 ml 6N HCl中水解后，肝胶原蛋白被测量为羟脯氨酸。同一个人对所有组织学特征进行评分，但不了解实验设计。
血液学
EDTA处理的血液在NIH临床中心使用Vista Analyzer（西门子）进行自动计数。
隐匿的粪便血
Seracult单滑块（美国Propper制造公司）。在8 wk pi时获得单个小鼠的粪便颗粒，并使用Precellys 24组织匀浆器将其分散在盐水中（Bertin Technologies）。将0.10 mL粪便样本涂在载玻片上，并在60秒内读取过氧化物酶阳性活性。
细胞内细胞因子染色
用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（10 ng/ml）、离子霉素（1 mg/ml）和布氏菌素A（10 mg/ml）刺激感染小鼠肝脏分离的白细胞3 h。细胞表面用藻红蛋白-吲哚二碳菁-缀合的CD4抗体（抗CD4；H129.19）染色，在25%（wt/vol）多聚甲醛中于25℃固定20分钟，用0.1%皂苷缓冲液渗透30分钟，并用异硫氰酸荧光素-缀合的抗IFN-γ（XMG1.2）进一步染色藻红蛋白结合抗IL-13（C531；Centocor）、Alexa Fluor 647结合抗IL-4（11B11）和别藻蓝蛋白结合抗IL-5（TRFK5），然后在FACSCalibur（BD）上进行分析。抗体来自BD Pharmingen，除非另有说明。
统计
所有数据均使用GraphPad Prism（GraphPad-Software；版本5）进行分析，并使用95%置信区间的双尾非配对学生t检验确定统计显著性（P<0.05）。除非图形图例中另有规定，否则所有实验和分析都至少进行了两次。
结果
曼苏氨酸链球菌诱导的炎症、纤维化和TKO小鼠死亡率增加
小鼠感染曼索尼由于长期存活的成对蠕虫在肝脏中大量沉积卵子而导致肝病。尽管肝脏受损严重，曼索尼WT小鼠感染很少导致死亡。这种低死亡率归因于调节免疫反应潜在有害方面的宿主免疫调节机制12。我们有兴趣研究曼索尼特定下调机制被基因删除的小鼠感染。BALB/c小鼠和靶向缺失IL-10、IL-12/23（p40）和IL-13Rα2（IL-10/IL-12/23（p 40）/IL-13Rα2）的小鼠组−/−指定的“TKO”）暴露于25–35曼索尼尾蚴。如前所述，BALB/c小鼠存活曼索尼第12周感染()20相反，TKO小鼠在急性感染时表现出100%的死亡率。所有TKO小鼠在肝脏中出现卵子沉积后3-4周，即第10周死亡。我们检查了TKO小鼠的死亡率是否与肝纤维化增加相关。BALB/c和TKO小鼠组感染了曼索尼并在第8周献祭。采集部分肝脏以定量羟脯氨酸水平()和肉芽肿性炎症(). 两个年龄匹配组（BALB/c 1.51+0.20[平均+SD]和TKO 2.04+0.34[平均+SD]μmoles羟脯氨酸/肝脏）幼年小鼠肝脏中的羟脯氨酸水平无统计学差异。如前所示，感染BALB/c的小鼠在第8周时出现炎症和纤维化，但TKO小鼠的纤维化程度增加了一倍以上，新沉积卵子周围的肉芽肿体积显著增加。在黑色素瘤红染色的肝脏切片中，纤维化程度明显，在TKO小鼠肉芽肿周围和整个肝实质中观察到大量胶原沉积(). 用四氯化碳暴露肝纤维化模型进行的类似研究没有产生类似的结果(补充图S1)这表明不同的介质可能在每个模型中调节纤维化。
TKO小鼠的纤维化、炎症和死亡率增加（A）的存续曼氏迭宫绦虫感染BALB/c（11只）和TKO（13只）小鼠，代表5个独立实验。（B）肝羟脯氨酸含量以μmoles/gram肝组织、μmoles/总肝和μmoles/1000表示曼索尼鸡蛋（C）感染后8周肉芽肿大小13。每个圆圈代表一只单独的小鼠，并标出平均值±SEM。数据代表4个独立实验。(D类)8周龄Picrosirus红染石蜡包埋肝脏切片(电子)7.5wk pi时肝脏肉芽肿相关CD4+淋巴细胞产生的细胞因子。对两项独立研究进行了代表性分析。散点图描述了CD4+细胞因子分析（如电子)水平条显示平均值的两个组合实验。星星表示双尾学生的重要性t吨-测试**P（P）<0.005.
肝脏浸润CD4产生细胞因子+和CD4−细胞通过体外细胞内细胞因子染色。在这些研究中，小鼠在7.5周时被安乐死，并从肝脏中分离出肉芽肿相关淋巴细胞。正如所料，我们发现大量IL-4+，IL-5+和IL-13+表达CD4+感染BALB/c的淋巴细胞(). 然而，CD4的数量显著增加+在TKO小鼠中观察到表达Th2细胞因子的T细胞。这也伴随着IFN-γ表达细胞的减少，表明TKO小鼠的加速疾病是由更极化和过度的Th2型反应引起的。IL-17A未检测到（未显示）。
2型免疫受到三种补偿调节机制的抑制
IL-10研究的初步证据−/−，IL-12p40−/−或IL-13Rα2−/−小鼠认为，当单个调控基因被删除时，其他抑制机制会增加，以补偿缺失的途径20–22为了进一步研究这一点，我们制作了一组WT、单基因、双基因和三基因KO小鼠，并比较了感染后肉芽肿肝脏中IL-10、IL-13Rα2和IFN-γmRNA的表达曼索尼由于大多数TKO小鼠在第9周死亡，因此在第7周和第8周之间通过实时qPCR评估肝脏中的基因表达。虽然IL-10 mRNA在感染BALB/c后的肝脏中被诱导表达，但IL-13Rα2−/−，IL-12p40−/−和IL-12−/−/IL-13Rα2−/−每只小鼠的IL-10水平都显著增加(). 在IL-12诱导的细胞因子IFN-γ中观察到类似的模式，这表明IL-10的诱导作用增强−/−和IL-10/IL-13Rα2 dbl KO小鼠()同样，IL-10中的IL-13诱饵受体−/−/白介素-12−/−小鼠的表达量是WT小鼠的2倍()这种基因转录的差异调节强调了每个基因在感染曼索尼与它们在调节Th2效应器功能中的既定作用一致20–22IL-10、IL-12p40或IL-13Rα2的缺失导致Relm-α的表达增强(雷特纳)，一个标志性IL-13应答基因()23然而，双KO和TKO小鼠的Relm-α表达在曼索尼感染。IFN-γ诱导的MIG/CXCL9转录物在感染的WT小鼠中未诱导，但在IL-13Rα2中略有增强−/−在缺乏IL-10的情况下诱导30倍(). 这些结果表明，在缺乏一种或两种负调节因子的情况下，宿主利用额外的负调节因子来控制IL-13介导的信号传导。最后，在任何一组中，TGF-β1的表达几乎没有变化()证实了血吸虫病期间缺乏肝脏TGF-β1诱导24.
内源性负调控因子在肝脏中的代偿性表达(A类)BALB/c（N=9）、IL-13α在肝脏中的基因表达−/−（N=7），IL-10−/−（N=8），IL-12−/−（N=7），IL-10/IL-12（p40）−/−（N=8），IL-12（p40）/IL-13α2−/−（N=6），IL-10/IL-13Rα2−/−（N=7）和IL-10/IL-12（p40）/IL-13α2−/−（N=5）小鼠感染8周后曼氏迭宫绦虫基因表达根据HPRT标准化，并表现为相对于幼年BALB/c小鼠肝脏表达的“倍增加”。该分析代表了两个独立的实验。
IL-10、IL-12p40和IL-13Rα2协同抑制致死性肝病的进展
对WT、单基因和复合基因KO小鼠进行的一系列实验使我们能够检测特定基因型的肝纤维化和死亡率。尽管羟脯氨酸检测显示所有单次和双次KO小鼠的纤维化显著增加（IL-12p40除外−/−与同样感染的WT小鼠相比，TKO小鼠的肝纤维化（hypro/g肝脏/10000个卵子）增加了4倍以上（经Student t检验，p<0.003）(和补充图S2A和S2B). 与所有双KO小鼠相比，纤维化程度也增加了近2倍。我们检查了VI型前胶原(第6a1列)在血吸虫感染期间，肝脏中的表达上调，并且部分受IL-13信号调节16前胶原VI的表达与羟脯氨酸水平相关，在TKO小鼠的肝脏中诱导的表达几乎是WT小鼠的10倍(). 我们还检测了一组更大范围的纤维化相关基因，并观察到TKO小鼠与WT BALB/c小鼠相比，pro-Col I、pro-Col III、Timp1和Mmp12 mRNA的表达显著增加(补充图S3). 有趣的是，mmp13被假设可以抑制血吸虫病患者的肝纤维化25在TKO小鼠肝脏中的表达水平显著降低(图S3). 最后，生存研究表明，尽管大多数TKO小鼠在寄生虫卵沉积于肝脏后仅几周内死亡，但双KO菌株中的代偿机制降低了死亡率，导致慢性感染（>10周pi）(). 在单一KO菌株中，只有IL-10−/−和IL-13Rα2−/−小鼠通常表现出死亡率增加曼索尼感染，如前所示20TKO小鼠的纤维化和死亡率增加并不是由于感染强度增加().
缺乏一种、两种或三种IL-13内源性调节因子的小鼠肝纤维化加重（A）显示的小鼠感染了35只尾蚴曼氏迭宫绦虫然后处死wk8pi，测定肝组织羟脯氨酸含量。由于个体小鼠之间感染强度的差异，最后的hypro值进行了调整，以考虑到曼索尼卵子沉积在肝脏中。报告的hypro值为hypro/gram，调整为10000个组织鸡蛋。数据由两个独立实验组合而成，表示为盒子和胡须图，水平线代表中间值，胡须延伸至最高和最低值，圆圈处显示离群值。（异常值定义为低于第1个百分位，大于第99个百分位数）。与TKO小鼠相比，所有BALB/c WT、单KO和双KO菌株的肝脏羟脯氨酸值显著降低（所有组的p≤0.003）(B类)肝脏前胶原6a18wkpi的mRNA水平表现为相对于幼年小鼠肝脏表达的“倍增加”。(*,第页与所有七个对照菌株相比，TKO小鼠≤0.03。(C类)感染35条尾蚴后的存活率曼氏迭宫绦虫（每组≥9只）。与所有7个对照组相比，TKO存活率显著加快。数据是3个独立生存实验的代表性数据（未显示单个KO小鼠的数据，以清楚显示数字）。
表1
BALB/c、单个KO、dbl KO和TKO小鼠感染25–35只尾蚴曼氏迭宫绦虫8周时，处死小鼠并灌注，以定量（A）成虫和（B）肝卵负荷（以1000秒为单位）。显示了两个单独实验的平均值±SEM。
| A类 | BALB/c公司 | IL13Rα2−/− | IL10号机组−/− | IL12/23（第40页）−/− | IL10/12/33（第40页）−/− | IL12/23（第40页）−/−13Rα2−/− | IL10/13Rα2−/− | IL10/12/23（p40）13Rα2−/− |
|---|
| 平均值 | 2.94 | 3.07 | 3.38 | 2.73 | 2.69 | 2.47 | 2.50 | 1.54 |
| 扫描电镜 | 0.29 | 0.31 | 0.55 | 0.25 | 0.38 | 0.35 | 0.37 | 0.21 |
| B类 | | | | | | | | |
| 平均值 | 21.48 | 20.56 | 17.09 | 24.66 | 20.30 | 14.06 | 17.45 | 13.03 |
| 扫描电镜 | 2.56 | 2.14 | 2.21 | 3.08 | 3.13 | 2.18 | 1.57 | 2.22 |
TKO小鼠出现门脉高压症状：贫血、血小板减少和粪便潜血
对于许多生活在流行地区的人来说，慢性血吸虫病会导致严重的肝纤维化和门脉高压，最终导致额外的病理后遗症，包括肝脾肿大、贫血和腹水8在严重情况下，门脉高压会导致门体侧支血管的形成。胃底静脉曲张破裂会导致大量内出血，这是导致患者死亡的主要原因曼索尼感染8我们询问感染后高度纤维化的TKO小鼠是否出现类似的临床特征。从BALB/c和TKO小鼠8 wk pi获取全血，进行全血计数（CBC）。与BALB/c相比，感染TKO小鼠的红细胞、血小板、血红蛋白和红细胞压积均显著降低(). 相比之下，TKO小鼠的白细胞（WBC）计数显著升高。我们还观察到更明显的食管静脉曲张()经尸检分析，TKO小鼠肠系膜小静脉（未显示）与BALB/c相比增大，这种情况是唯一的曼索尼幼年小鼠未观察到静脉曲张感染。大约50%的TKO小鼠中也发现了腹水，而在此早期点，WT BALB/c小鼠中未检测到腹水。虽然在第8周pi时两组都观察到脾肿大，但在TKO小鼠中观察到脾脏大小显著增加(). 此外，TKO小鼠的肝酶升高，尤其是天冬氨酸转氨酶（AST），提示肝细胞损伤和细胞死亡增加(). 最后，由于TKO小鼠出现脾肿大和严重贫血并迅速死于感染，我们在6周和8周时检查了受感染小鼠的粪便中的潜血，作为胃肠道出血的迹象。在8周龄时，TKO小鼠100%的粪便潜血阳性，而WT小鼠为50%(). 尸检分析表明胃肠道出血可能是死亡的主要原因。
感染TKO小鼠贫血、血小板减少和脾肿大加重（A）8周血液中的红细胞、血小板、白细胞、血红蛋白和红细胞压积曼氏迭宫绦虫-感染小鼠（每组5-8只）。(B类)在感染8周的TKO小鼠中，沿着感染TKO的浆膜表面检测到的曲张静脉曲张和肠系膜小静脉充血更容易发生(C类)脾肿大描述为体重百分比（每组8只小鼠）和BALB/c和TKO小鼠的三个代表性脾脏图像。(D类)8wk pi时血清中的肝酶包括：天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶和碱性磷酸酶（ALK）（每次试验n≥4只小鼠）(电子)6和8WK pi.*的粪便潜血检测，P（P）≤ 0.02, **,P（P）≤ 0.002, ***,P（P）≤ 0.0002.
TKO小鼠提供了一种快速的临床前模型，用于测试新型抗纤维化药物治疗血吸虫病
由于被诊断为肝纤维化的患者通常已经有许多与晚期疾病相关的并发症，因此抗纤维化药物开发的主要目标是减缓疾病进展并降低发病率和死亡率。由于血吸虫感染的TKO小鼠迅速发展出许多与晚期肝纤维化相关的病理后遗症，因此它们为在更接近人类血吸虫病的加速模型中测试新型抗纤维化药物的疗效提供了理想的工具。我们和其他人之前已经证明血吸虫病肝纤维化的发展是IL-13依赖性的。肝纤维化在白介素13−/−和白介素-13Rα1−/−老鼠13,15以及用可溶性IL-13Rα2-Fc治疗的WT小鼠，其拮抗IL-13信号14因此，我们询问抗IL-13单克隆抗体的类似治疗是否可以减少感染TKO小鼠的严重纤维化和下游并发症。在这些实验中，BALB/c和TKO小鼠感染了曼索尼持续8周。从第5周开始，每周一次用抗IL-13抗体或对照IgG治疗一组小鼠，直到第8周26.抗IL-13抗体治疗显著降低WT小鼠的肝纤维化(和补充图S4A和S4B)此外，还减少了TKO小鼠出现的严重肝纤维化。肝纤维化的减少也与第6a列mRNA表达(). 在偏振光下观察，用苦果红染色的肝脏切片也显示抗IL-13处理的TKO小鼠的胶原沉积减少(). 在感染的TKO小鼠中观察到的肝肿大加重也可通过抗IL-13治疗逆转()但两组脾肿大均无变化（未显示）。此外，抗IL-13治疗逆转了感染TKO小鼠的贫血和血小板减少状态()抗IL-13治疗的TKO小鼠出现腹水的数量较少（数据未显示）。
阻断IL-13抑制肝纤维化并逆转贫血曼氏迭宫绦虫感染(A类)感染35只尾蚴的小鼠曼氏迭宫绦虫以及在第5周至第8周期间，以每只小鼠0.5毫克/周的剂量腹腔注射大鼠抗鼠IL-13（IgG2a）或对照（GL113）抗体。在第8周处死小鼠，用肝羟脯氨酸测定肝纤维化（每组6-9只小鼠）。(B类)整个肝脏前胶原6a1实时PCR检测mRNA表达。(C类)的存续曼氏迭宫绦虫用抗IL-13或cIgG治疗感染的TKO。（D）在5倍放大的偏振光下，云杉红色染色的肝脏切片。(电子)感染BALB/c和TKO小鼠，然后用对照IgG或抗IL-13和肝素化血液治疗，分析红细胞、血小板、血红蛋白和红细胞压积。
由于抗IL-13治疗成功地改善了肝纤维化并使感染TKO小鼠的CBC正常化，因此我们进行了最后一系列实验，以确定更长时间的抗IL-13mAb是否可以减缓致命疾病的进展。我们还研究了终止治疗是否会提供持续的保护或允许疾病进展。在这些研究中，大量TKO小鼠被感染曼索尼并且从第6周开始并在第14周结束，使单独的组未经治疗或用同种型匹配的对照IgG或抗IL-13治疗。正如预期的那样，未经治疗和对照免疫球蛋白治疗的小鼠在急性感染期间开始死亡，大多数小鼠在第9周死亡(). 与此形成鲜明对比的是，在此期间，经抗IL-13单克隆抗体治疗的小鼠死亡的比例不到25%。在对照IgG治疗组和未治疗组小鼠中观察到硬化的灰色肝脏，但在抗IL-13治疗组中未观察到(). 有趣的是，尽管在第14周终止了治疗，但50%的抗IL-13单克隆抗体治疗小鼠在第25周后仍然存活，尽管感染强度持续且相似，这表明相对较短的抗IL-14单克隆疫苗疗程可以提供持续的保护，使其免受致命疾病的侵袭。因此，阻断IL-13足以减少纤维化，防止贫血和血小板减少，并提高易受加速和严重肝纤维化影响的小鼠的存活率。
抗IL-13治疗使TKO小鼠免于死亡曼氏迭宫绦虫感染30只TKO小鼠暴露于25-35只尾蚴曼氏迭宫绦虫从WK5到WK12π，10只小鼠未经治疗（闭合圈）；10只小鼠接受cntrl IgG（开方形），10只小鼠接收大鼠抗IL-13抗体（闭方形）。以2×/周的剂量给小鼠注射0.5mg抗体，每周监测存活率。(B类)在8周pi的幼稚、对照IgG或抗IL-13治疗条件下，TKO的典型尸检图像。
讨论
纤维化发生于多种人类疾病，包括肝硬化、黄斑变性、动脉粥样硬化、脂肪酸肝病和肺纤维化27建模纤维化形成和识别调控纤维化进展的机制是许多研究的重点体内研究27在这里，我们确定了IL-10、IL-12p40和IL-13Rα2在寄生虫感染期间抑制肝纤维化中的不同但协同作用曼索尼在缺乏所有三种关键免疫调节因子的情况下，小鼠感染曼索尼肝纤维化迅速发展，导致鸡蛋沉积在肝脏后3-4周内出现贫血、血小板减少、胃肠道出血、腹水和死亡。引人注目的是，在急性感染期间观察到的TKO小鼠的病理学后遗症反映了慢性感染野生型小鼠（>36周）的正常病理学变化20这表明，这种加速的肝纤维化模型可用于更快速、更全面地评估实验性抗纤维化药物的疗效，尤其是那些靶向IL-13纤维化途径的药物。
免疫调节细胞因子及其同源受体已被确定为可能加剧或抑制纤维化过程的宿主因子。IL-10在纤维化发展中的作用一直存在争议，一些研究表明IL-10具有促纤维化作用28–30以及其他明确抑制作用的研究31–33一方面，已知IL-10可抑制促炎性趋化因子和细胞因子（MIG/CXCL9、TNF-α、IFN-γ、IL-12），否则会导致炎症、组织损伤并最终形成纤维化34另一方面，通过抑制IL-12和IFN-γ，这两种众所周知的抗纤维化细胞因子通常抑制成纤维细胞中胶原合成18,35，IL-10确实可能促进纤维化。因此，细胞来源（抗原呈递细胞、Th2细胞、CD4+CD25型+福克斯P3+T调节细胞）、IL-10的数量和表达模式可能影响IL-10是否具有促纤维化或抗纤维化活性。与这个假设一致，我们观察到IFN-γ在我们的曼索尼感染的IL-10−/−老鼠；然而，只有当IL-12p40同时缺失时，IL-10缺陷小鼠的纤维化才持续增加。这些发现表明，IL-10和IFN-γ诱导细胞因子IL-12相互作用，共同抑制纤维化的发展19.
在联合缺乏IL-10和IL-12p40的情况下，血吸虫感染小鼠产生高度极化和过度Th2反应。因为大量研究表明，Th2细胞因子IL-13是血吸虫病纤维化的关键驱动因素13–15,24，IL-10/IL-12p40中Th2反应增强−/−小鼠可能解释了纤维化增加的原因。有两种不同的受体与IL-13结合，IL-4Rα/IL-13Rα1异二聚体是IL-13的主要stat6激活受体，IL-13Rα2是IL13的高亲和力诱饵受体16,20在stat6激活后，诱饵受体在基质细胞（如成纤维细胞、上皮细胞和平滑肌细胞）上诱导表达36–38大多数研究表明，IL-13Rα2主要作为IL-4Rα/IL-13Rα1受体复合物的诱导性拮抗剂39,40有趣的是，虽然IL-10增加了Th2驱动的纤维化的发展−/−/白细胞介素-12p40−/−小鼠的IL-13Rα2表达也显著增加，表明IL-13诱饵受体是控制这些小鼠纤维化的另一种机制。事实上，与各种单、双、三敲除小鼠进行的比较研究证实了这一假设，并证明IL-10、IL-12p40和IL-13Rα2协同作用，减缓血吸虫病致死性肝纤维化的进展。从机制上讲，免疫抑制细胞因子IL-10和抗纤维化细胞因子IL-12分别通过减少和拮抗IL-13的产生和促纤维化活性来抑制纤维化，而IL-13Rα2通过直接阻止IL-13参与信号IL-4Rα/IL-13Rα1复合物而具有额外的抑制作用。这些发现很好地说明，当一个抑制性介质被删除时，其他负调控通路被增强以弥补缺失的通路。因此，一些代偿机制参与了致命性纤维化疾病的调节。
以前已经证明IL-4−/−和IL-4/10−/−小鼠对曼索尼感染19,41像TKO小鼠一样，IL-4−/−和IL-4/IL-10−/−老鼠屈服于曼索尼急性感染期间的感染。然而，与TKO小鼠相比，IL-4−/−和IL-4/10−/−小鼠出现了一种完全不同类型的致死性病理学，其特征是IFN-γ/TNF-α驱动的炎症、大的非嗜酸性肉芽肿、由于肠道损伤导致的严重肝纤维化和败血症15,19,42IL-4中也有类似的发现−/−/白介素-13−/−小鼠和动物出现Th1/Th17显性免疫反应曼索尼感染15,43–45所有这些小鼠的共同特点是没有显著的Th2细胞因子产生，这导致了急性致死的促炎性Th1/Th17型免疫反应。令人惊讶的是，TKO小鼠屈服于曼索尼感染时间相似，感染后第10周死亡率接近100%。然而，这些动物并没有产生急性致命的促炎Th1/Th17型反应，而是产生了高度夸大和急性致命的促纤维化免疫反应，其特征是IL-13信号增强，并形成了许多与肝硬化相关的并发症。
患有慢性和严重血吸虫病的患者通常会出现严重的肝纤维化（Symmer’s pipestem fibrosis），并伴有继发性门脉高压。门脉高压导致侧支血管和门体分流。沿食管和直肠粘膜形成的静脉曲张（迂曲和扩张的侧支静脉）与出血风险密切相关。直接和间接抑制造血以及胃肠道失血增加也会导致贫血。用TKO小鼠获得的结果表明，IL-10、IL-12p40和IL-13Rα2的联合作用可以预防或至少显著延缓血吸虫病中许多并发症的发生，这些联合作用共同抑制了IL-13的产生和活性。
IL-13发挥的关键作用在最后一系列实验中得到了证实，在这些实验中，用抗IL-13的中和单克隆抗体治疗感染的TKO小鼠。在一项研究中，仅用四种抗IL-13单克隆抗体治疗就能显著降低肝纤维化。我们还发现，较长的治疗过程可以使大多数感染小鼠免于严重发病和死亡。事实上，在感染的TKO小鼠中观察到的显著纤维化、贫血和肝脾肿大在抗IL-13治疗后恢复到接近WT水平。
总之，通过删除IL-13效应器功能的关键负调控因子，我们开发了一种高度加速的晚期肝纤维化模型。因此，这种新的小鼠模型强调了免疫调节的重要性和重叠水平，它控制着纤维化的发展。该模型可作为一种有用的工具来剖析Th2驱动的纤维化机制，并为快速评估靶向IL-13纤维化途径的新型抗纤维化药物的疗效提供了一种理想的方法。
致谢
作者感谢Sandy White、Anthony Tillry和NIAID动物设施的其他工作人员，以及Fred Lewis博士及其同事（马里兰州Rockville生物医学研究所）对血吸虫尾蚴的研究。我们还感谢我们的同事卢克·巴伦、凯文·范内拉、克里斯汀·金德拉丘克和罗伯特·汤普森（NIH）以及弗洛里安·里德博士（克利夫兰诊所消化疾病研究所胃肠病学和肝病学系）的有益讨论。最后，我们要感谢Anuk Das和Patrick Branigan（Centocor，Inc.）提供的抗IL-13单克隆抗体，以及Marion Kasaian和Mary Collins（辉瑞）提供的IL-13Rα2原始繁殖对−/−本研究中使用的小鼠。这项研究得到了NIH，NIAID的校内研究计划的支持。
曼汀·凯恩帮助研究概念和设计，获取数据，分析和解释数据，起草手稿。奇弗帮助进行数据采集和分析、数据解释和统计分析。Wilson、Madala、Beers和Ramalingam帮助进行了研究设计、数据采集和手稿的批判性修订。韦恩在研究概念、设计、数据解释方面提供了帮助；手稿的起草；对手稿进行批判性修订，获得资金，并提供研究监督。
NIAID/NIH内部研究计划资助的研究
使用的缩写
| 基质金属蛋白酶 | 基质金属蛋白酶 |
| CBC公司 | 全血细胞计数 |
| 白细胞计数 | 白细胞 |
| 重量 | 野生型 |
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
利益冲突声明：所有作者都承认不存在利益冲突。
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