获得性激素非依赖性乳腺癌细胞的基因表达特征表明MYC是抗雌激素抵抗的介质

LTED细胞基因表达芯片分析

基因表达总览（GEO；GSE19639）上提供了原始数据。如前所述，使用Affymetrix HG_U133_Plus2微阵列分析在10%DCC-FBS中培养24小时后从细胞中获取的RNA[(6); 详细信息请参见补充方法]. 我们比较了每次LTED/父母比较中改变的探针组列表（≥1.5倍，FDR-调整第页≤0.05,图1A). LTED基因签名中包括了在≥3个LTED系中通常解除管制的探针组。

在单独的窗口中打开

图1

来自获得性雌激素非依赖性细胞系的基因表达特征与鲁米纳B型乳腺癌相关。A） 微阵列探针设置下调或上调≥1.5倍(第页≤0.05）。指示了探针组的数量。B） 热图描述了每根LTED线的平均折叠变化，与118个探针组（通常在≥3条LTED线中解除管制）的各自父母对照相比。C） 计算230例乳腺肿瘤的LTED评分（队列POPOVICI230）；根据PAM50分类法对肿瘤进行分型。通过方差分析比较每种亚型的LTED得分，然后进行事后比较t吨-子类型之间的测试。

LTED特征基因与阿那曲唑反应的相关性

该患者队列（SMITH69）如前所述(7). 在治疗前收集核心活检（详见补充方法). 用阿那曲唑治疗激素受体阳性疾病患者。14天后再次进行核心活检。在活检的4μm福尔马林固定石蜡包埋切片上进行Ki67免疫组织化学评分。这项研究得到了招聘中心的机构审查委员会和研究与道德委员会的批准。

使用Illumina HumanWG-6 v2 Expression BeadChips（详见补充方法). 为了检查患者肿瘤中99基因LTED特征和Ki67评分之间的相关性，从肿瘤数据集中提取了104个映射到79/99基因的可用探针集。对微阵列数据进行过滤，以提取每个基因的最大可变探针集（在R软件中使用软件包：genefilter）。接下来，所有产生的信号强度（log₂-对于LTED细胞中上调的基因，transformed）乘以（-1）；对于LTED电池中下调的基因，乘以（+1）(表S1-S2系列). 然后计算每个患者肿瘤所有基因的总和，生成一个未标度的LTED“分数”，该分数概括了与LTED细胞的相似程度。因此，较高的肿瘤LTED评分对应着与雌激素剥夺抵抗高度一致的特征。通过减去队列的平均得分，然后除以队列得分的标准偏差，将LTED得分标准化为Z得分(表S3). 因此，任何给定队列的Z得分平均值为0，标准偏差为1。在线性模型中评估Z评分，并与两周治疗后的Ki67评分进行比较。69名患者的基因表达和Ki67数据可用。

LTED特征基因与来曲唑反应的相关性

此患者数据集（MILLER48）在前面进行了描述(8). 本研究得到了当地道德委员会的批准（LREC；2001/8/80和2001/8/81）。使用新佐剂来曲唑治疗绝经后ER+乳腺癌患者。肿瘤基因表达数据（.CEL文件）从GEO（GSE5462）下载。如上所述进行Ki67 IHC评分。48名患者的基因表达和Ki67数据可用。主成分分析揭示了微阵列数据中的批量效应。如上所述计算LTED得分（使用78/99个可用基因），并在线性模型（包括批次）中与治疗后Ki67值进行评估。

LTED特征基因与三苯氧胺反应的相关性

三个队列（LOI164、LOI181、MDACC298）中使用辅助三苯氧胺治疗五年的ER+乳腺癌患者的肿瘤基因表达数据（.CEL文件）和患者特征(9,10)已从GEO下载。来自GUYT站点的患者(n个=87，GSE6532）和GUYT2(n个=77，GSE9195）包含LOI164，在Affymetrix U133+2微阵列上进行分析(9). 来自KIT和OXFT站点的患者(n个=181，GSE6532）包含LOI181，在Affymetrix U133A和U133B微阵列上进行分析。在Affymetrix U133A微阵列（GSE17705）上进行MDACC298分析。包含LOI181和LOI164的患者的加入人数标注在表S10、和分析在中进行了描述补充方法LTED得分按上述方法计算（分别使用LOI164、LOI181和MDACC298中的99/99、97/99和78/99可用基因）。根据LTED评分中位数将患者分为两组，并通过log-rank检验比较Kaplan-Meier生存曲线。采用Cox比例风险（PH）回归分析LTED评分与无复发生存期（RFS）的相关性。

使用PAM50分类器对临床微阵列数据集进行分子分型，使用R包：genefu(11). 230例混合亚型乳腺癌的基因表达数据[GEO GSE20194(12)，POPOVICI230队列]用于使用稳健标度确定LTED评分与分子亚型的关联。由于所有肿瘤均为ER+，因此对上述三苯氧胺治疗的队列进行了类似的分子分型。

基因集分析（GSA）是基因集富集分析算法的变体，在别处有描述(13,14). 从分子特征数据库下载Curated（c2）基因集(14). 使用两类配对算法进行GSA，将每个LTED细胞系与R中各自的亲代对照进行比较（包：GSA；1000排列）。观察到正调控基因集（即LTED细胞中上调）。确定了两个MYC激活特异性基因集，将其组合形成一个联合集（231个基因），并通过GSA筛选出得分>1.0的基因；这产生了46个基因。为了测试与临床参数的相关性，表达式值（log₂-转化）对每个肿瘤的所有46个基因进行汇总，得出的MYC评分标准化为上述每个队列中的Z评分。

反向蛋白质阵列（RPPA）分析

47份早期激素受体阳性原发性乳腺肿瘤样本（MDACC47）来自M.D.Anderson癌症中心的乳腺组织冷冻肿瘤库。这些数据来自于接受辅助三苯氧胺治疗五年的未确认患者。根据IRB批准的方案采集样本。如前所述，从肿瘤中提取蛋白质并通过RPPA使用MYC抗体（细胞信号）进行分析[(6,15,16); 详细信息请参见补充方法).

LTED特征预测芳香化酶抑制剂的临床反应

接下来，我们研究了LTED细胞中的表达谱是否与新佐剂来曲唑的反应相关。在48例ER+乳腺癌患者的原发肿瘤样本微阵列数据集中[MILLER48队列(7)]，我们计算了每个肿瘤治疗前和治疗后（2周）的LTED评分。据我们所知，目前尚无法获得AI患者肿瘤微阵列数据的长期随访。然而，治疗后Ki67评分较高，这是肿瘤细胞高增殖的标志(19)在接受AI治疗2周的原发性癌症患者中，已显示出预测不良的长期疾病预后(1). 因此，我们对来曲唑治疗2周后获得的肿瘤活检进行了Ki67 IHC(图2A). 治疗前和治疗后LTED评分较高的肿瘤在治疗后（2周）Ki67评分显著较高(图2B-C; 预处理LTED评分第页=0.27，批量调整第页=0.047; 治疗后LTED评分第页=0.32，批量调整第页=0.014). 因此，在来曲唑未抑制细胞增殖的肿瘤中，LTED细胞上调或下调的基因分别以较高或较低水平表达。值得注意的是，通过基因本体分析，只有4/99个基因被归类为“细胞生长/增殖”基因(20)这表明LTED特征预测AI早期反应的能力（由Ki67确定）不仅基于细胞增殖基因的量化。因此，LTED评分可能反映了对雌激素缺乏不敏感的肿瘤细胞群的潜在生物学特性，而不是肿瘤的增殖状态。因为我们之前的分析表明，B管腔肿瘤的LTED评分高于A管腔肿瘤(图1C)，这些结果进一步证实了我们的论点，即LTED评分捕获的表达模式表明对ER通路（即管腔B肿瘤）的增殖依赖性降低。

在单独的窗口中打开

图2

LTED评分预测芳香化酶抑制剂的早期肿瘤反应。A） 48名ER+乳腺癌患者接受了为期2周的新佐剂来曲唑治疗（队列MILLER48）。对治疗前后（2周）的肿瘤活检进行Ki67评分。B-C）根据治疗前（B）和治疗后（C）活检计算（A）患者肿瘤的LTED评分。在2周时，将LTED得分与Ki67得分进行比较。数据通过线性回归分析，并调整肿瘤微阵列批量效应。D） 69名ER+乳腺癌患者接受新佐剂阿那曲唑治疗14天（队列SMITH69）。对治疗前后的肿瘤活检进行Ki67评分。计算（D）中肿瘤的E-F）治疗前（E）和治疗后（F）LTED评分，并与（B-C）中2周的Ki67评分进行比较。

为了证实这些结果，我们评估了LTED特征是否可以预测另一组69例ER+乳腺癌患者对阿那曲唑的反应[SMITH69组(7)]. 使用AI治疗14天后获得的肿瘤活检进行Ki67评分(图2D). 预处理LTED评分与Ki67评分（2周时）的比较显示，LTED评分高的肿瘤Ki67评分明显更高(图2E,第页=0.43,第页=0.0002). 然而，治疗后LTED评分与Ki67的相关性较弱(图2F,第页=0.19,第页=0.11），表明治疗前LTED评分可能是雌激素缺乏反应的更强预测因子。

LTED特征预测佐剂他莫昔芬治疗后的疾病结局

为了确定LTED特征是否可以预测辅助内分泌治疗后的长期预后，我们评估了两组接受辅助三苯氧胺治疗五年的ER+乳腺癌患者的肿瘤前LTED评分与无复发生存期（RFS）之间的相关性[n个在队列LOI164中=164，n个在LOI181队列中=181，随访中位数分别为8.94年和5.11年(9)].

根据PAM50分类法，LOI164由77（47%）管腔A、74（45%）管腔B和13（8%）HER2阳性肿瘤组成。LOI181由156个（86%）管腔A、21个（12%）管腔B、3个（2%）HER2阳性和2个（1%）正常肿瘤组成。在单变量Cox PH模型中，LTED评分与LOI164中的RFS相关(第页=0.0065），并在LOI181中显示出趋势(第页=0.085). 通过单变量分析，LTED基因特征对RFS的预测效果优于随机生成的10000个RFS中的95.9%和92.6%。在多变量Cox PH模型中，对有协变量数据的患者的年龄、肿瘤分级、肿瘤大小、淋巴结状态和分子亚型进行调整，LTED评分是LOI164中RFS的独立预测(第页=0.0018,n个=128,表S5)但不在LOI181中（p=0.175，n个=149,表S6). 值得注意的是，在LOI164中存在分子亚型时，LTED评分是RFS的独立预测指标。我们强调分子亚型与临床结果相关(18)但通常被排除在预测乳腺癌预后的大多数多元模型之外。为了可视化LTED评分高与低的患者之间RFS的差异，我们根据LTED评分中位数将患者分为两组，并生成Kaplan-Meier生存曲线。LOI164的分析表明，携带高LTED评分肿瘤的患者（那些与LTED细胞特征高度一致的患者）在辅助他莫昔芬后的预后明显较差(图3A; 对数秩检验第页<0.01). 同样，LOI181的相似分层并没有产生统计上不同的RFS曲线(图3B;第页=0.19).

在单独的窗口中打开

图3

LTED评分预测辅助三苯氧胺治疗后的长期疾病结局。A-C）根据LTED中位数得分将LOI164（A）、LOI181（B）和MDACC298（C）患者分为两组，并使用log-rank检验比较Kaplan-Meier生存曲线。D-F）LOI164（D）、LOI181（E）和MDACC298（F）中的患者在五年时间点进行审查，并按（A-C）进行分析。

基于先前的结果，我们推测队列LOI181包含一个我们无法识别的混杂因素，该混杂因素可能影响该队列LTED特征的预测能力。LOI181与长期随访的乳腺癌患者的大型数据集的比较进一步表明了这种可能性。例如，在>2500个ER+肿瘤中，Cheang等通过分子分型发现59%的管腔a、33%的管腔B和9%的HER2阳性分布。在他们的研究中，887名接受佐剂三苯氧胺治疗的患者的五年RFS率，A管腔为83%，B管腔为72%(21). 相比之下，LOI181显示异常高的管腔A代表性（86%），与55%的异常低的五年期RFS率相关。尽管LOI181的结果不佳，但该队列显示的淋巴结阳性率与LOI164相似（分别为47%和57%）

鉴于这种差异，我们在第三个队列（MDACC298）中测试了LTED评分的预测能力，该队列由298名ER+患者组成，这些患者接受了5年的辅助性三苯氧胺治疗[中位随访8.17年(10)]. 根据PAM50分类，MDACC298由168（56%）个A管腔、91（31%）个B管腔、9（3%）个HER2阳性、26（8%）个正常样肿瘤和4（1.3%）个基底样肿瘤组成。因此，MDACC298的管腔A/B分布与LOI164相似。我们发现，在单变量Cox PH模型中，LTED评分再次强烈预测RFS(第页=0.004). MDACC298（所有患者的淋巴结状态）的临床数据有限。研究发现，在存在节点状态的情况下，LTED评分与RFS保持显著相关(第页=0.0004). 通过Kaplan-Meier分析（log-rank），LTED评分也可以预测RFS第页=0.0096;图3C).

由于三个队列中的每一个队列在服用他莫西芬五年疗程后都有一部分肿瘤复发，因此治疗后复发似乎不是由于他莫西酚耐药所致（即，可能需要他莫西芬来抑制肿瘤生长）。因此，我们进一步分析了五年治疗期间LTED评分和复发之间的相关性，以更好地评估固有耐药性（LOI164、LOI181和MDACC298中分别有24、48和42名患者在五年内复发）。在这种情况下，高LTED评分对所有三个队列的早期复发具有显著预测作用(图3D-F和表S5-S6系列; 单变量Cox PH模型第页=0.0019,第页=0.025，以及第页分别为0.0055）。因此，携带反映雌激素非依赖性的基因表达谱的原发性肿瘤患者在五年治疗期间和之后更有可能复发。

LTED模型的基因集分析揭示了激活的MYC特征对治疗结果的预测

LTED特征似乎既包含预后因素（用三苯氧胺辅助治疗后的长期结果），也包含预测因素（用AI进行短期治疗后，在辅助治疗期间复发和肿瘤细胞增殖，即Ki67）。尽管这些因素中的每一个都可能有助于告知临床结果，但都不能直接用于确定与内分泌治疗耐药性相关的治疗靶向机制。目前的临床标准是在疾病进展和/或抗雌激素治疗耗尽时，在治疗方案中增加化疗。然而，针对导致这种耐药性的分子或途径的合理治疗是可取的。因此，我们接下来评估了LTED基因表达模式是否可以用于识别不同的分子改变或通路激活特征，从而告知新的药物靶点。

为此，我们使用了基因集分析（GSA）。在使用GSA算法将每个LTED细胞系与其亲代对照进行比较的情况下，调用配对设计。这一分析可能对识别协调调控和生物相关的基因集更有帮助。在LTED系富集的基因集中(表S7)，我们发现MYC激活的两个特征[COLLER_MYC_TARGETS_UP和MYC_ONCOGENIC_SIGNATURE(22,23)]. 这个MYC公司15%的乳腺癌中癌基因扩增(24). 此外，由于翻译后机制，乳腺癌细胞可能过度表达MYC(25). 鉴于之前的报告已确定雌激素应答基因和MYC应答基因存在较大重叠(26,27)，我们假设MYC协调的基因表达通过克服雌激素缺乏对基因组ER信号传导的抑制作用来促进对内分泌治疗的抵抗。我们从上述两个确定的基因集中创建了一组由MYC激活的基因，共产生231个基因(表S8). 然后，我们确定了这231个基因中的哪些在LTED细胞中与亲代系相比特异性上调，并对与活化的MYC信号的相关性做出了最有力的贡献[基因评分(s）>1]. 我们鉴定了46个这样的基因(表S9)，其中只有一个与99-gene LTED特征重叠，表明46-gene活化的MYC特征提供了独特的生物信息。日志₂对队列LOI164中每个患者这46个基因的信号强度进行汇总，以创建激活的MYC评分。MYC评分高与RFS差相关（单变量Cox PH模型第页=0.004). 当数据被分层为“高”、“中”和“低”MYC三分位数时，很明显，最高的三分位数代表了复发时间差的患者的明显比例（未显示）。因此，我们将患者分为“高”和“低/中等”MYC评分组，并通过对数秩检验比较RFS曲线(图4A;第页=0.0068). 删除贡献后MYC公司基因本身，MYC评分与MYC公司mRNA水平(图4B;第页=5×10⁻¹⁰). 有趣的是，MYC公司仅mRNA水平不能显著预测RFS（未显示）。LOI181和MDACC298数据集（如下）证实了这一点，表明MYC激活的特征，更好地反映MYC转录产物，可能比MYC公司仅基因表达。

在单独的窗口中打开

图4

来自LTED细胞的活化MYC信号预示辅助三苯氧胺治疗后的不良结果。A） MYC评分应用于队列LOI164，并按三分位数分层。生成Kaplan-Meier生存曲线，并通过对数秩检验将高三分位数与中、低三分位数组合进行比较。B） MYC得分（不包括MYC公司自身）与MYC公司通过最小二乘回归分析（A）患者的mRNA水平。C-D）队列LOI181（C）和MDACC298（D）如（A）中所分析。E） 对47例ER+早期乳腺肿瘤（队列MDACC47）中MYC蛋白表达进行量化。数据分析如（A）所示。

我们还测试了激活的MYC信号在LOI181和MDACC298队列中预测结果的能力。虽然在单变量Cox PH模型中，MYC评分与LOI181或MDACC298中的RFS并不线性相关，但Kaplan-Meier分析比较了高、中、低三分位数与结果之间的关系(图4C-D; 对数槽第页=0.0029和第页分别为0.0017）。因此，对Cox PH模型缺乏重要性的另一种解释可能是，MYC介导的内分泌阻力可能表现为二元“开/关”特征，而不是一个连续变量，其中MYC激活程度与抗雌激素抵抗程度呈线性相关。测试是否MYC公司我们利用Kaplan-Meier绘图仪工具，在一个大型多研究数据集中，表达可以预测内分泌治疗的反应(28). 在399名ER+乳腺癌患者中，MYC公司在接受内分泌治疗的患者中，表达与RFS相关(图S1，对数秩第页=0.00069). 相反，当分析仅限于609名未接受辅助治疗的患者时，RFS曲线没有差异。这一分析强烈表明MYC公司表达可预测内分泌治疗的反应，而不仅仅是一个预后指标。在以下各项之间找到了相关性MYC公司和HER2型基因共扩增与乳腺癌预后不良(29,30)，但其他研究只报道了罕见的共扩增(31,32). 同样，我们发现MYC评分与HER2型MDACC298数据集中的mRNA水平（来自微阵列数据）(第页=0.01,第页=0.14），但不在LOI164或LOI181中。因此，MYC和HER2过度表达之间的关系需要进一步研究。

接下来，我们使用RPPA对47名接受辅助性他莫昔芬治疗五年的早期ER+乳腺癌患者的MYC蛋白水平进行了量化（队列MDACC47，中位随访7.75年）。MYC水平与佐剂他莫昔芬治疗后的RFS显著相关（Cox PH模型第页=0.019). MYC高表达与低表达/中等表达患者的分层显示出类似的关联(图4E; 对数槽第页=0.017).

最后，由于来自LTED细胞的两个基因签名（“LTED”和“MYC激活”）没有明显重叠，我们假设每个签名可能提供独特的生物信息。因此，我们询问根据这两个因素（高LTED评分和/或高MYC评分）进行分层是否可以更好地预测结果。事实上，在所有三个队列中，两个签名得分高的患者（MYC+LTED）的RFS最短，而两个签名分数低的患者（NONE）的结果最好(图5). MYC评分高或LTED评分高（MYC/LTED）的患者RFS发生率中等。

在单独的窗口中打开

图5

MYC激活模式和雌激素独立性的共同表达预示着辅助他莫昔芬治疗后的不良结果。LOI164（A）、LOI181（B）和MDACC298（C）患者按照MYC评分（三分位数）和LTED评分（中位数）分层图3-​-4.4将两项得分均不高（NONE）、两项得分（MYC/LTED）或两项得分都不高（MYC+LTED）的患者分组，并通过对数秩检验比较Kaplan-Meier生存曲线。

基金这项工作得到了美国国立卫生研究院F32CA121900（T.W.M.）、乳腺癌卓越研究专业计划（SPORE）P50CA98131、范德比尔特-英格拉姆癌症中心支持基金P30CA68485、M.D.安德森癌症中心支持金P30CA16672的支持；乳腺癌研究基金会（C.L.a.）的拨款；ACS临床研究教授奖学金CRP-07-234（C.L.A.）；Lee Jeans乳腺癌转化研究项目（C.L.A.）；挺身而出抗癌赠款“针对女性癌症中的PI3K”（C.L.A.&G.B.M.）；突破性乳腺癌和皇家马斯登NIHR生物医学研究中心（M.D.、Z.G.和A.D.）。