介绍
真核细胞的标志性特征是细胞核，它是一种双膜结合的细胞器，含有遗传物质。细胞核的外核膜（ONM）与内质网膜相邻，而内核膜（INM）是独特的，包含一组独特的蛋白质，这些蛋白质与染色质和其他核因子相互作用。嵌入核膜的是多个核孔复合体（NPC），它们调节细胞质和细胞核之间的大分子运输[1].在生物体内，如酿酒酵母在整个生命周期中，被称为纺锤体极体（SPB）的中心体等效细胞器存在于核膜中[2]SPB组织参与核定位的细胞质微管和对染色体分离至关重要的核微管[3].
NPC和SPB都主要由可溶性蛋白质组成，这些蛋白质在细胞核或细胞质中部分组装成亚复合物（参见[1],[3]). NPC和SPB的进一步组装需要插入核膜中INM和ONM连接在一起的点。特定的完整膜蛋白与NPC和SPB的可溶性成分相互作用，并被认为将复合物固定在核膜中。Ndc1对鼻咽癌和SPB的插入至关重要[4]–[6]在NPC中，另外三种孔膜蛋白Pom33、Pom34和Pom152在NPC组装中发挥部分重叠作用[6]–[8]，而除了Ndc1外，还需要Nbp1、Bbp1和Mps2来将SPB插入核包层[9]–[12].
在酵母和后生动物系统中，NPC插入的机制已被广泛研究。结构研究表明，NPC的五个亚单位（Nup133、Nup120、Nup85、Nup170和Nup188）包含一个ALPS基序（A类射频GAP1我国际病历第页衬垫秒传感器），将它们靶向高度弯曲的膜[13]这些蛋白质被认为在核膜上形成外壳复合物以促进NPC的插入[14]–[17]此外，内质网织子等内质网膜结合蛋白在从头开始全国人大会议[17],[18]核膜小叶内的脂质改变也可能发生在鼻咽癌插入部位，以适应膜弯曲和融合。参与脂质合成和膜流动性的几种蛋白质与NPC组装有遗传联系[19]–[21]，尽管它们在鼻咽癌插入中的作用没有很好的特征。在脊椎动物细胞中，SUN（用于S公司广告1-联合国C-84同源性）蛋白Sun1也需要用于NPC组装[22],[23]最近的一项研究表明，需要hSun1和Pom121从头开始可能通过促进膜融合组装NPC[24].
与NPC相比，SPB插入核膜的机制尚不清楚。SPB复制可能需要许多相同的事件，例如膜弯曲、弯曲和脂质修饰，因为在SPB插入过程中也必须发生INM和ONM的融合。除了最近的一份报告表明Nbp1的两亲性α-螺旋有助于SPB插入外，SPB复制过程中从未直接涉及到具有这些功能的特定因素[12]可能SPB如何插入核膜的最佳线索之一来自编码SPB组分的基因和NPC亚单位之间的大量遗传相互作用，包括抑制SPB膜组分的完全缺失，MPS2（MPS2）和MPS3系统，由POM34型或POM152型删除[4],[25]–[27]虽然NPC可能通过其在SPB亚单位的核转位或mRNA处理中的作用参与SPB插入[25],[28]SPB复制可以在缺乏某些结构亚单位的情况下发生，这一事实表明NPC和SPB竞争共享插入因子（如Ndc1）的模型[4]或者，通过消除POM152型或POM34型可以改变核膜的某些方面，使SPB在缺乏其他必要成分的情况下复制。与这种可能性一致，删除POM152型与一起核电厂170导致核膜异常[29].
在本研究中，我们进一步研究了核膜在SPB复制中的作用，并首次表明，在没有Mps3的情况下，膜成分的变化足以进行SPB复制。此外，我们证明SUN蛋白Mps3在调节膜结构中的作用，并提供证据证明其在SPB复制的插入步骤中发挥作用。在SPB复制中，Mps3的这一作用与之前描述的Mps3功能不同。作为SPB亚结构的一个组成部分，Mps3是新SPB（称为半桥）组装模板的一个组件，用于启动SPB复制，并通过与膜蛋白Mps2的相互作用将半桥连接到可溶性核心SPB[30]–[32]这一功能与其他SUN结构域蛋白类似，由于它们在多种系统中心体、基底体和SPB的复制和膜系留中起作用，已被证明在准确的染色体分离和核定位中发挥作用[33]–[35]然而，我们目前的数据表明，SUN蛋白在膜稳态中具有新的功能，这涉及将蛋白复合物（如SPB）插入核膜。
结果
识别SPB复制所需的Mps3域
所有SUN蛋白（包括Mps3）的一个关键特征是存在许多结构基序，包括至少一个跨膜结构域、线圈区域和一个C末端SUN结构域[35]此外，Mps3含有一个N-末端酸性结构域、一个聚谷氨酰胺区和一个假定的P-环[30](). 为了确定它们在SUN蛋白定位和功能中的作用，我们使用定点突变在每个域中创建了缺失等位基因。就聚谷氨酰胺重复序列（pQ）而言，我们不仅删除了该区域，而且将其扩大了两倍，因为这种突变通常与疾病有关[36],[37]在假定的P-环的情况下，我们突变了预期参与核苷酸与具有不同化学性质的残基结合的关键残基[38],[39]为了测试各种突变体是否有功能，我们检测了mps3Δ使用质粒洗牌策略的突变体。虽然Mps3在细胞核内的染色体组织中起着多种非必要的作用[28],[40]–[49]，Mps3在有丝分裂酵母细胞中的主要功能是在SPB[30],[31]因此，该测试将使我们能够识别对SPB复制至关重要的Mps3域。
用于SPB复制的Mps3基本区域。（A） Mps3的示意图显示了N-末端酸性区域、跨膜结构域（TM）、P-loop基序、线圈（cc）、聚谷氨酰胺（pQ）重复序列和C-末端SUN结构域。P-loop共识序列与Mps3的186–194氨基酸的比对如下所示。（B） 对每个Mps3结构域内的所示突变体进行了测试，以确定其拯救缺失的能力MPS3系统（SLJ2039）.+和−分别表示在30°C下5-氟代甲酸（5-FOA）突变体的生长和死亡。进一步分析活的等位基因，以通过流式细胞仪测定DNA含量，并测试与其他SPB突变体的遗传相互作用，包括kar1Δ17（SLJ844），cdc31-2型（SLJ894），mps2-1型（SLJ718），sfi1-3型（SLJ1558）和CDC31-16型（SLJ907）。等位基因也与GFP融合，以使用共焦成像确定突变蛋白的亚细胞分布[41].*非功能突变体在野生型Mps3存在下定位。ND，未确定**这个mps3-S190A型依赖于拷贝数：单拷贝整合子是可行的，而多拷贝整合子则是致命的，如（D）中的系列稀释试验所示。（C） 一个代表性的单平面共焦图像，显示23°C下生长的细胞中Mps3-GFP（SLJ2571）和Mps3ΔTM-GFP（SLJ4308）（绿色）以及H2B-mCherry（红色）的定位。棒材，2µm。在使用之前，通过将细胞电镀到2-氨基-5-氟苯甲酸（5-FBA）板上，将覆盖质粒从SLJ2571中去除；由于mps3ΔTM-GFP是非功能性的MPS3型不会迷路的。（D） 不含插入物（-）的野生型SLJ2039系列稀释试验MPS3型，或mps3-S190A型整合在SD-URA和5-FOA上的1个拷贝或2个拷贝中，去除含有野生型的覆盖质粒MPS3系统。在30°C下培养板2 d。（E） 野生型（SLJ001），镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）细胞在30°C的YPD（葡萄糖）和YPGR（半乳糖）平板上生长能力的连续稀释试验中进行了测试。
mps3Δcc1,mps3Δcc2,mps3Δcc1Δcc2和mps3ΔpQ突变体分别缺乏第一、第二和两个线圈结构域或聚谷氨酰胺区域，在不同温度下没有表现出任何明显的生长缺陷(; 数据未显示）。为了进一步检查它们在SPB的Mps3功能中的作用，我们测试了与其他SPB成分中突变体的遗传相互作用：mps2-1型,cdc31-2型,CDC31-16型,kar1Δ17,spc42-11型,spc29-3型和sfi1-3型。这些突变体要么是不可感染的（合成致死），要么是生长缺陷增强的（合成病态）mps3-1型其SUN结构域中的丝氨酸472突变为天冬酰胺[30]。喜欢MPS3系统,KAR1标准和CDC31型编码SPB复制初始步骤所需的SPB半桥成分：Kar1是一种完整的膜蛋白，Cdc31是一种小的钙结合蛋白，也与SPB半桥蛋白细胞质侧的Sfi1结合。Spc42和Spc29是核心SPB的组成部分，而Mps2是一种连接蛋白，通过与Mps3的相互作用将半桥连接到核心SPB[3],[32]令人惊讶的是，在这组新的mps3（mps3）等位基因：合成致死率mps3Δcc2和kar1Δ17，以及抑制显性的温度敏感性CDC31-16型突变体mps3ΔpQ(). 然而，与mps3-1突变体[30]，Cdc31和Kar1在SPB的定位在mps3Δcc2或mps3ΔpQ突变体（数据未显示）。这很可能是因为mps3Δcc1-GFP、mps3△cc2-GFP和mps3δpQ-GFP以与mps3-GFP非常相似的模式定位于SPB和INM(). 总之，我们的数据表明，在SPB复制过程中，线圈结构域的突变或聚谷氨酰胺区域的缺失对Mps3的定位和功能影响最小。
聚谷氨酰胺区域的复制不影响细胞生长(). 然而，流式细胞术对DNA含量的分析表明mps3-2xpQ像素突变体表现出倍性增加()，这是SPB突变体中的一种常见表型，以前在许多mps3（mps3）等位基因[30],[32],[40]倍性的增加是完全隐性的，因为细胞含有mps3-2xpQ像素和的野生副本MPS3系统是单倍体（数据未显示），这表明尽管mps3-2xpQ蛋白可能只是部分功能，但它不会形成滴定其他SPB复制因子的复合物。我们观察到，与mps3-GFP相比，SPB的mps3-2xpQ-GFP水平降低()表明该突变体无法定位于SPB，可能是由于与SPB受体结合的改变。
类似于消除或影响SUN域的突变体[30]–[32]，跨膜结构域的缺失导致Mps3的非功能性版本(). 这很可能是由于突变蛋白定位错误，因为即使存在野生型未标记的mps3拷贝，mps3ΔTM-GFP也只能在细胞质和细胞核中以扩散模式出现，而不是在SPB和外周核膜（如mps3-GFP）上()[41]将Mps3跨膜结构域替换为其他几种膜蛋白，挽救了mps3Δ恢复SPB和外周核膜的定位(图S1A和S1B). 有趣的是，其中一些嵌合蛋白显示出与野生型Mps3-GFP显著不同的定位模式(图S1A). 事实上，这些蛋白足以将足够多的Mps3靶向SPB，以允许细胞增殖和维持基因组稳定性，这表明尽管在SPB复制期间膜定位对Mps3功能至关重要，但将SUN蛋白靶向SPB并不需要特定的跨膜结构域序列。
P-loop残基突变导致新的显性MPS3系统等位基因
当在P-loop区域内涉及核苷酸结合的潜在残基中构建点突变体时，我们发现大多数等位基因能够补体mps3Δ并作为以下文件的唯一副本MPS3型在牢房里(; 数据未显示），表明此域在ATP绑定中不起作用体内然而，P-环区中的一些突变体，例如mps3-S190A型显示出拷贝数敏感性，使得含有单个完整拷贝突变基因的细胞是活的，但含有两个或更多拷贝P-环突变基因的细胞是死的(). 这表明mps3-S190A型是一个弱剂量敏感的反形态等位基因。我们无法获得一个等位基因的转化子(MPS3-G186K系列)在多种条件下（数据未显示），这表明它是阻止细胞生长的显性突变。
使用半乳糖可调节GAL1-10型发起人，我们建立了一个系统，以便检查MPS3-G186K系列细胞生长和SPB复制。包含单个集成副本的单元格镀锌MPS3或GAL-MPS3-G186K型除了内源性野生型拷贝MPS3系统在30°C的连续稀释试验中分析其对生长的影响。在这些条件下，野生型的过度表达MPS3系统对细胞生长有轻微影响，而MPS3-G186K系列显著抑制细胞增殖(). 这证实了MPS3-G186K系列是一种新的显性致死突变体。
MPS3-G186K系列突变体在SPB复制中有缺陷
在用2%半乳糖诱导5小时后，通过流式细胞术分析DNA含量，并通过间接免疫荧光显微镜分别用抗α-管蛋白和抗γ-管蛋白抗体观察微管和SPB，以确定MPS3-G186K系列突变体影响SPB复制和纺锤体组装。我们发现细胞过度生产野生型MPS3型没有停止并进行SPB复制以形成双极有丝分裂纺锤体(). 然而，MPS3-G186K型过度生产导致大乳房细胞积聚，其2N DNA含量，这表明SPB复制和/或纺锤体形成失败(). 对微管结构的检查显示，66%的MPS3-G186K系列突变体，但只有14%镀锌MPS3包含单极纺锤体的细胞：与单个SPB和微管阵列相关的单个DNA团(; n> 200）。与之前描述的单极纺锤体表型不同mps3（mps3）gamma-tubulin的单个焦点与核DNA相关的突变体[30],[32]，40%MPS3-G186K系列细胞含有两个γ-微管蛋白病灶，其中一个病灶不使微管成核(). 这种表型表明SPB插入核膜中存在缺陷：未使微管成核的SPB未正确插入核膜并组装内斑块成分，这是形成核微管阵列所必需的[3]虽然未插入的SPB可能使细胞质微管成核，但由于每个SPB形成的微管数量很少，因此通常很难观察到这些微管。这种表型与SPB插入核膜缺陷的突变体非常相似，例如mps2-1型,ndc1-1型,nbp1-dg和bbp1-1型
[9]–[11],[50]并表明，与这些SPB组分一样，Mps3除了在SPB复制的启动中起作用外，还在SPB复制后期发挥作用。
MPS3-G186K系列由于SPB复制缺陷，表达导致有丝分裂阻滞。（A、B）镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）细胞在30°C的YEP和2%棉籽糖中培养过夜，然后添加2%半乳糖5小时以诱导表达。（A） 用流式细胞仪分析DNA含量，用相差显微镜测定出芽指数。显示大乳房细胞的百分比（n=300）。（B） 此外，使用抗α-微管蛋白（绿色）、抗γ-微管蛋白质（红色）和DAPI（蓝色）的间接免疫荧光显微镜检查纺锤体形态。每个菌株的双极性和两种单极性纺锤体的大泡状细胞百分比（n>200）显示。棒材，5µm。（C） SPB复制途径示意图显示了Spc110-GFP（绿色）和Spc42-mCherry（红色）组装的时间。（D） 使用Spc110-GFP（绿色）和Spc42-mCherry（红色）在镀锌MPS3（SLJ4859）和加仑-每加仑3克186k（SLJ4864）细胞在30°C的SC-HIS+2%半乳糖+2%棉籽糖中生长5小时。箭头指向仅包含Spc42mCherry的未重复的SPB，星号标记在MPS3-G186K系列，仅包含Spc110-GFP。这可能代表分层SPB，类似于在一些spc110型突变体[101]棒材，5µm。（E） 在两个独立的实验中，对大芽细胞中含有指定数量的Spc42-mCherry和Spc110-GFP病灶的SPB数量进行了量化（n>250）。我们还计算了在30°C的SC-HIS+2%棉籽糖+2%葡萄糖中生长5小时的SLJ4859细胞中的SPB病灶。（F–H）GAL-MPS3-G186K型在30°C的YPGR中诱导5小时后，也对（SLJ1797）突变体进行薄片EM处理，以检查SPB形态。收集15个细胞的细胞核的连续切片：（F）7个细胞核包含一个未复制的SPB，（G）4个细胞核包含SPB以及核膜细胞质表面上类似SPB前体的电子致密物质（箭头），（H）4个核包含重复和分离的SPB，形成一个短双极纺锤形。（G）中的插图显示了一个相邻的切片，其中有一个从SPB前体发出的细胞质微管（用箭头标记的位置）。（F，G）巴，100纳米。（H） 条形，200 nm。
MPS3-G186K系列突变体在SPB插入中有缺陷
为了使SPB的内部斑块成分（如Spc110）组装到新复制的SPB上，必须将新的SPB插入核膜(). 由于基因突变导致SPB插入缺陷的细胞MPS2（MPS2）或BBP1公司包含两个荧光标记的中心斑块成分Spc42病灶，该成分存在于旧SPB和复制斑块/新SPB，但只有一个荧光标记Spc110病灶[11],[25].英寸镀锌MPS3我们发现，在含有两个Spc42-mCherry病灶的80%的细胞中，这些病灶与两个Spc 110-GFP病灶一致，表明这些SPB已经复制并插入核膜(). 相比之下，只有61%的GAL-MPS3-G186K型这些细胞含有两个标记有Spc42-mCherry和Spc110-GFP的SPB。剩下的15%的细胞含有一个同时含有Spc42-mCherry和Spc110-GFP的SPB，表明存在未复制的SPB；12%的细胞含有两个标记有Spc42-mCherry的SPB（其中只有一个标记有共同标记的Spc110-GFP），表明SPB复制的中间步骤停滞；12%含有多个SPB病灶(). 因此，MPS3-G186K系列对SPB复制具有多效性影响，包括阻止SPB插入核膜。事实上，几乎所有野生型细胞都有两个重复的SPB，它们与Spc42mCherry和Spc110-GFP共同标记，我们在MPS3-G186K系列具有显著的统计学意义（p<0.01）。此外MPS3-G186K系列与在其他突变体中观察到的相似，例如mps2-1型和ndb1-dg，在SPB复制的后期步骤中失败（请参阅[25]).
我们使用电子显微镜（EM）进一步评估过表达细胞的SPB复制缺陷MPS3-G186K系列对整个细胞核的连续切片分析显示，所检查的15个细胞核中有11个含有单个SPB。在这11个单极纺锤体中，有4个具有SPB插入后期缺陷突变体的“死”极特征[9]–[11],[50]; 也就是说，与细胞核和细胞质微管相关但未插入核膜的电子致密结构(). 其余7个SPB似乎未复制，其末端形态与之前描述的相似mps3（mps3）等位基因()[30],[32].其余4个细胞含有短双极纺锤体(). 这种超微结构分析与我们的荧光和遗传数据一致，并表明MPS3-G186K系列影响SPB复制的多个步骤，包括SPB插入核膜。
我们测试了过度表达的SPB组分抑制突变对半乳糖毒性的能力，发现2μ-MPS3系统部分挽救了增长，证实了这一点MPS3-G186K系列是一个反形态等位基因(图S2). 大多数其他SPB组件未能挽救增长停滞。值得注意的例外是2μ-SPC42型Spc42是SPB中央斑块的组成部分，作为细胞器组装的支架，在核膜中起着锚定作用[51],[52]它的过度表达部分恢复了生长MPS3-G186K系列突变体与膜插入和栓系缺陷一致。
MPS3-G186K系列细胞有膜增殖缺陷
除了SPB重复缺陷外，在我们的EM分析过程中还发现了几个额外的表型MPS3-G186K系列阐明Mps3在SPB插入中可能作用的细胞。如所示,MPS3-G186K系列突变体似乎经历了核膜的大规模过度增殖，导致了2-8层核膜，细胞核似乎有多个叶和延伸。膜膨胀表型具有高度特异性和渗透性，96%（48例）的GAL-MPS3-G186K型检查的细胞()但没有（第0页，共34页）镀锌MPS3单元格(). 因此，很可能是由于MPS3-G186K系列突变，而不是由于过度表达MPS3系统或完整的膜蛋白（另请参见[31]). 事实上，我们观察到MPS3-G186K系列突变体表明，Mps3直接或间接参与细胞膜稳态。
核膜的过度增殖GAL-MPS3-G186K型.
镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）细胞在30°C的YPGR中诱导5小时后进行薄片EM处理。（A） Nuclei来自镀锌MPS3细胞呈现圆形或椭圆形形态（50%；n=17），与野生型细胞相似（参见[55])或（B）核形态异常（50%；n=17）。在所有原子核中镀锌MPS3细胞，仅观察到单个核膜双层。（C–F）核GAL-MPS3-G186K型所有患者（n=50）均表现出异常的核形态，包括多叶（C）和高度弯曲的突起（D）。存在多个核膜层，这通常导致（E）在包含单个核膜层的区域中聚集NPC。在其他情况下（F），观察到NPC堆积。（A–F）巴，200纳米。（G）加仑-兆帕3（SLJ5097）和GAL-MPS3-G186K型将含有Nup49-GFP和Net1-mCherry的（SLJ5098）细胞在YEP+2%棉子糖中生长至中对数期，然后将2%的葡萄糖添加到一半，将2%的半乳糖添加到另一半，并使细胞在30°C下生长5小时。Nup49-GFP（绿色）和Net1-mCherry（红色）的错误定位MPS3-G186K型半乳糖与电镜观察到的异常核形态一致，但在两个突变体的细胞质中均未观察到NPC。棒材，5µm。
细胞膜增殖GAL-MPS3-G186K型仅限于核；在其他细胞器上没有发现多余的膜，包括芽殖酵母中与ONM相邻的内质网(). 先前的工作表明，靠近核仁的膜容易形成膜耀斑[53]，但我们发现核膜的所有区域都发生了扩张，不仅仅是核仁膜。然而，我们确实观察到核仁区域经常被膜从核的主要部分隔开()或者通过叶的形成(). 有趣的是，在单个核内，膜增殖并不均匀，因为存在包含单个双层的区域和包含多个双层的其他区域(,). 对连续细胞核切片的分析表明，多余的细胞膜开始于细胞核内的小管，然后在现有的细胞膜下增殖，然后与相邻的小管融合()或者折叠起来继续在核内扩散(). 事实上，多余的膜只与现有的核膜紧密结合形成，而不在核内形成片层，这表明Mps3与核膜层的形成密切相关。
肾小管和核内膜的形成MPS3-G186K系列细胞。EM图像来自GAL-MPS3-G186K型细胞在30°C的YPGR中生长5h，显示核内小管的形成。（A） 在左边的细胞中，小管形成的位置用一个或两个星号表示，这些区域的高倍图像显示在右边。在中央图像中，核膜的外层似乎延伸到细胞质中，包围了一个胞浆区域。一个箭头指向一个小管，形成了右图中的第三个核层。（B） 所示的细胞至少有三个有趣的膜膨胀区域，这些区域在较高放大倍数下表示和显示。在区域1中，至少有两个脂质双层包围了胞浆区域。在区域2中，细胞核内的膜膨胀不均匀。这里，细胞核内发生膜增殖，将核仁与细胞核的其余部分分隔开来。在区域3中，膜也包围着细胞质区域，但很明显，膜正在折叠回来，在膜双层内形成小管。棒材，200 nm。
虽然多余的膜可能MPS3-G186K型抑制SPB插入，我们发现SPB和NPC通常与包含单个双层的膜区域相关(和). 然而，我们也在中间层和内层检测到NPC，尽管这些通常与相邻层中的NPC堆叠在一起()，最有可能促进大分子的核质运输，这种运输在MPS3-G186K系列(图S3). 与其他影响酵母核膜的突变体不同[18]–[21],[54]，我们没有在MPS3-G816K系列可能是由于核包膜中存在大量NPC导致NPC插入缺陷的突变体[55]以及显性突变体表达的相对较短的时间(和). 由于SPB和NPC都是在含有单个双层的核膜区域中观察到的，并且NPC插入没有明显缺陷，我们怀疑SPB组装缺陷与MPS3-G186K系列是膜组成的结果，而不是多余的膜。
MPS3-G186K系列突变体在核形态上有缺陷
细胞膜增殖MPS3-G186K系列突变体还伴有异常的核形态。在许多情况下，核膜完全包围细胞质区域，包住小泡和其他成分(). 在所有患者中均观察到膜延伸和突起GAL-MPS3-G186K型细胞（n=50）和50%镀锌MPS3不会过度增殖核膜的细胞（34个中的17个）(). 剩下的50%镀锌MPS3细胞的核形态为圆形或椭圆形，与野生型相似，这取决于细胞周期的阶段().
我们能够实时跟踪核形态缺陷的形成GAL-MPS3-G186K型突变体和镀锌MPS3对照细胞使用HDEL-dsRed显示细胞核和内质网膜，Pus1-GFP显示细胞核。时间推移图像分析表明MPS3系统过表达细胞的细胞核形状发生了微小变化——在整个3.5小时的时间过程中，几乎所有细胞核都是圆形或椭圆形的，只有在稍后的时间点，一些细胞核中才会形成一些延伸和突起（视频S1；). 此外，我们观察到细胞核和核膜变长，然后呈小时玻璃状时，细胞发生有丝分裂。相比之下，在大多数MPS3-G186K型细胞在添加半乳糖后1.5–2小时（视频S2）。在随后的时间点，突变体中发生了更严重的膜扰动，通常导致在一个细胞内形成数团核物质(). 尽管一些突变细胞核伸长，但没有一个完成有丝分裂形成两个不同的DNA团。因此，膜增殖似乎与异常的核形态和有丝分裂进程的抑制有关。
膜特性改变抑制MPS3-G186K系列.（A） 野生型（SLJ001），镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）细胞在30°C的连续稀释试验中，在YPGR、YPGR+0.2%苯甲醇、YPGR+5 mM油酸和YPGR+2.5µg/ml特比萘芬平板上生长。培养板培养2天。细胞也在16°C下培养7天，23°C培养3天，33°C培养2天，以测试温度对菌落形成的影响。（B）镀锌MPS3（SLJ4963）和GAL-MPS3-G186K型将含有HDEL-dsRed（红色）和Pus1-GFP（绿色）的（SLJ4965）在SC-LEU+2%棉籽糖中培养过夜，然后在30°C下添加2%葡萄糖、2%半乳糖、2%半乳糖+5 mM油酸、2%半乳糖+0.2%苄醇或2%半乳糖+1.25µg/ml特比萘芬，以观察对核形态的影响。棒材，5µm。（C–D）镀锌MPS3（SLJ4859）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ4864）细胞在SC-HIS+2%棉子糖中生长，然后按（B）处理。将含有2%半乳糖的样品移至33°C下6 h。（C）通过流式细胞仪分析DNA含量。（D） 在这些相同的细胞中，对含有指定数量的Spc42-mCherry和Spc110-GFP病灶的SPB数量进行了量化（所有样本的n>100）。
膜成分的改变减轻了MPS3-G186K系列
为了更好地理解Mps3在SPB插入和膜结构中所起的作用，我们筛选了酵母缺失集合中的突变体，以修复生长缺陷GAL-MPS3-G186K型如果如细胞学所示，该突变体中的SPB复制缺陷是膜组成缺陷的结果，那么应该有可能找到改变核膜脂质组成的突变体来弥补MPS3-G186K系列表达式。共发现93个突变体在SC-URA+2%半乳糖和pURA3-GAL1-MPS3-G186K(表S2). 由于这些基因中的许多可能影响显性等位基因的转录、翻译、翻译后修饰或半乳糖诱导，我们使用western blotting作为二级筛选，以确定表达高水平Mps3-G186K蛋白的突变体，类似于在野生型细胞中观察到的突变体（数据未显示）。37个突变体符合这一次要标准，如与野生型和加仑4Δ控件。加仑4编码一种转录因子，该转录因子是激活半乳糖反应基因所必需的，包括加仑1
[56]该突变体在我们的初步筛选中被鉴定，但正如预期的那样，未能通过我们对Mps3-G186K生产的二次测试，并作为对照(表S2).
的抑制器MPS3-G186K系列毒性。（A） 用pURA3-GAL-MPS3-G186K，并测试转化子在30°C条件下在SC-URA+2%半乳糖上生长3d的能力。然后通过western blotting进一步检查可能的命中，以确保与野生型对照相似，Mps3-G186K在高水平上表达。这里显示的是两个都挽救了MPS3-G186K系列并表达Mps3-G186K的野生型水平。此屏幕中恢复的基因的完整列表显示在表S2图中还显示了野生型菌株和加仑4Δ突变体，我们在一级筛选中分离出来，但在二级筛选中消除，因为它不表达MPS3-G186K系列。点击是使用GoSlim分析按功能组织的。在某些情况下，我们分离出一个突变，删除了重叠基因的一部分，如下括号所示。（B） 所示基因在GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797），并在30°C的连续稀释试验中对YPD（葡萄糖）进行2天和YPGR（半乳糖）进行3天的生长测试。
在37个缺失突变体中MPS3-G186K系列，许多基因编码参与转录或翻译的蛋白质。虽然这些并不影响Mps3-G186K的产生，但它们很可能通过影响未知靶点的表达来恢复突变株的生长。一个可能的候选目标是POM34型，其水平影响SPB插入缺陷突变体的生长，例如最大功率2,bbp1型和ndc1型
[4],[25],[26]有趣的是，我们还发现POM34型,POM152型和其他一些核孔蛋白被抑制MPS3-G186K型突变体(). 最近，一些相同的缺失突变体被证明可以拯救mps3Δ
[26]我们认为，核穿孔蛋白的缺失可以挽救缺乏核穿孔素的细胞的生长MPS3系统通过阻止NPC集合，从而释放SPB和NPC插入中涉及的共享插入因子。或者，删除它们可能会拯救mps3Δ细胞通过改变核膜的物理性质，如膜流动性，促进SPB复制而不产生Mps3。我们的发现MPS3-G186K系列突变体在核膜结构和SPB复制上有缺陷，被许多与之相同的核穿孔蛋白缺失所抑制mps3Δ强烈表明，核膜性质的改变，而不是插入因子的释放，可以缓解这两种情况下的生长缺陷。事实上，我们分离出多个核孔蛋白作为MPS3-G186K系列抑制器提示了一种常见的抑制机制。如下所示pom152Δ并推断其他核穿孔蛋白，核膜性质的改变似乎是抑制MPS3-G186K系列以及救援MPS3系统删除。
除了核穿孔蛋白缺失外，我们还发现两个与脂质代谢有关的基因的缺失，联邦航空局和环境保护部1，救援MPS3-G186K系列突变体。环境保护部1编码许多代谢基因的转录调节因子，包括参与磷脂生物合成的基因[57],[58].联邦航空局编码五种酰基辅酶A合成酶之一，在磷脂生物合成的第一步中催化脂肪酸转化为活化的酰基辅酸中间体。Faa1、Faa2、Faa3、Faa4和Fat1定位于不同的亚细胞隔室，并对中、长和超长链脂肪酸显示出不同的特异性在体外
[59].联邦航空局编码长链或超长链脂肪酰基辅酶a合成酶，该酶被认为与Fat1部分冗余体内
[60]–[62]然而，我们发现其他酰基辅酶A合成酶的缺失，包括脂肪1Δ，无法抑制的生长缺陷MPS3-G186K系列()这表明Faa3消除的作用是特异性的，它可能在调节核膜的脂质组成方面发挥作用。
脂质成分的变化挽救了小鼠的生长、细胞核形态和SPB复制缺陷MPS3-G186K系列
缺失或过度表达联邦航空局导致细胞脂质含量的改变[60],[63]，表明脂肪酸水平或组成的变化是拯救生长的原因MPS3-G186K系列细胞。为了验证这一想法，我们用改变细胞膜组成或流动性的化学物质处理细胞，并检查其对细胞生长和核膜形态的影响。我们发现MPS3-G186K系列通过添加膜流化剂苯甲醇、甾醇生物合成抑制剂特比萘芬和脂肪酸油酸来拯救YPGR上的突变体(). 此外，将温度提高到33°C，由于细胞能够通过增加饱和脂肪酸和长链脂肪酸的水平以及改变固醇的数量来调节脂质组成，因此增加了膜的流动性[64],[65]也抑制了MPS3-G186K系列，而将温度降低到23°C和16°C，这会降低膜的流动性，不仅会导致MPS3-G186K系列但也加剧了与野生型过度表达相关的表型MPS3系统(). 因此，这些数据与影响脂质成分以增加膜流动性足以抑制MPS3-G186K系列我们观察到野生型Mps3的过度生产在低温下是致命的，这表明镀锌MPS3由于Mps3在膜稳态中的直接作用，细胞的膜组成可能发生改变。
通过活细胞成像对细胞的进一步检查发现，其他缺陷与MPS3-G186K系列包括异常的核形态、细胞分裂和SPB复制，至少通过改变脂质成分而部分受到抑制。油酸在抑制核形状缺陷方面特别有效。大多数细胞核在3.5小时内保持圆形，几乎没有延伸或突起；然而，很少有核分裂(). 视频S3中显示了一个罕见的示例。此外，流式细胞仪DNA含量分析和SPB插入检测表明，大多数细胞在有丝分裂过程中保持停滞状态，可能是由于SPB复制缺陷所致(). 目前尚不清楚为什么油酸抑制MPS3-G186K系列虽然许多突变株（例如，[66],[67]).
治疗MPS3-G186K型含有其他化学物质的细胞对核形态的影响不如油酸深刻，可能是因为这些药物对核膜结构具有多效性作用(，视频S4和S5）。例如，先前的研究表明，加入苯甲醇会影响NPC的插入[20],[21].虽然它可以缓解因MPS3-G186K型苯甲醇的加入可能会导致NPC结构的缺陷，从而导致核形态的改变。
然而，尽管特比萘芬部分挽救了核形态，但它消除了细胞周期阻滞MPS3-G186K系列含有两个插入SPB的大乳细胞数量增加了一倍多(). 虽然这可能是由于特比萘芬相关的生长缓慢表型，因为没有观察到有丝分裂（视频S5和)，我们支持特比萘芬治疗影响甾醇生物合成的可能性，这反过来又影响SPB复制，因为我们还观察到，在培养基中添加其他甾醇抑制剂，如酮康唑，可以挽救MPS3-G186K系列(图S4).
苯甲醇治疗也仅部分挽救了MPS3-G186K系列，但它能够恢复SPB中间体的分布，类似于镀锌MPS3半乳糖中的细胞()这表明它减轻了与显性突变体相关的SPB复制缺陷。与这个想法一致，我们观察到细胞在苯甲醇存在下经历染色体分离和细胞分裂（视频S4）。重要的是，添加苯甲醇对细胞周期进展或SPB插入几乎没有影响镀锌MPS3单元格(). 我们还发现，添加化学品对MPS3系统和MPS3-G186K系列表达式(图S5). 因此MPS3-G186K系列通过使用遗传和化学方法改变细胞的脂质组成，可以挽救生长、核形态和SPB插入。
mps3-1型突变体在脂质稳态方面存在缺陷
我们的分析mps3（mps3）缺失和点突变表明大多数对苯甲醇或甾醇合成抑制剂不敏感（数据未显示），这表明我们观察到的这些治疗对MPS3-G186K系列突变体是由于Mps3功能的特定缺陷，这可能与SPB插入有关，因为MPS3-G186K系列而不是其他突变体，显示SPB复制缺陷（参见和). 为了支持这一假设，我们发现几乎所有的突变体都位于C末端SUN结构域，这是SPB复制所必需的[30]–[32]，对特比萘芬耐药，并发现这些突变体的一个子集，如mps3-1,mps3-A540D（mps3-A440D）和mps3-W477A，也对苯甲醇敏感(). 特比萘芬促进生长，抑制麦角甾醇生物合成[68]，表明包含mps3-1型,mps3-A540D（mps3-A440D）和mps3-W477A突变具有极强的液膜；苯甲醇等膜流化剂的生长对这些突变体具有毒性，因为它们已经改变了膜的组成。一些患者的表型更严重mps3（mps3）等位基因可能反映了核膜上更大的变化，尽管其中一些突变体也可能有其他缺陷[32],[40]有趣的是，许多（但不是全部）mps3（mps3）对苯甲醇敏感的突变体是自发二倍体化的等位基因。也许这些突变体的细胞核较大，需要更大的脂质合成需求，而这是两个突变体拷贝所无法满足的MPS3系统.
mps3（mps3）突变体对膜特性的变化很敏感。（A） 野生型（SLJ1779），mps-Q572LQ573L型（SLJ1783），mps3-W487A型（SLJ1785），mps3-W477A（SLJ1793），mps3Δ太阳2（SLJ1789），mps3-A540D（mps3-A440D）（SLJ1787），mps3-Y502H型（SLJ1781）和mps3-F592S型（SLJ1791）细胞，或（B）野生型（SLJ001），mps3-1（SLJ910），cdc31-2型（SLJ894），kar1Δ17（SLJ844），sfi1-3型（SLJ1558），mps2-1型（SLJ718），spc42-11型（SLJ715）和ndc1-39型（SLJ1740）细胞在YPD中生长到对数期，然后在23°C的连续稀释试验中测试其在YPD、YPD+0.2%苯甲醇和YPD+2.5µg/ml特比萘芬平板上生长的能力。in（B）细胞也在YPD+5 mM油酸上生长。
确定脂质组成的变化是否通常影响SPB复制过程，或是特定于mps3（mps3）我们比较了不同隐性突变体在含有油酸、苯甲醇和特比萘芬的平板上SPB复制的生长情况。大多数SPB等位基因测试，包括早期破坏的突变(cdc31-2型,kar1-Δ17,sfi1-3型)，中间(spc42-11型,spc29-3型)和较晚的步骤(mps2-1型,bbp1-1型,spc110-220型)SPB复制和SPB监管(mps1-1型,管4-1)[3]，在所有测试条件下以与野生型相同的速度生长(; 数据未显示）。值得注意的例外是ndc1-39型突变体，在SPB复制的后期和NPC组装中都有缺陷[5]。喜欢mps3-1型突变体，ndc1-39型细胞对油酸和苯甲醇的敏感性增加，对特比萘芬的敏感性降低(). 这表明ndc1-39型，比如mps3-1型由于膜成分的变化，突变体具有非常流动的膜。虽然膜缺陷的基础可能是ndc1-39型与SPB插入缺陷有关，我们怀疑这是由于它在鼻咽癌中的作用，因为其他SPB突变体，包括mps2-1型和bbp1-1型，不要共享此属性。事实上mps3（mps3）突变体，包括在SPB复制的早期阶段有缺陷的等位基因，并且未知会导致NPC组装或功能缺陷[30],[32]特别受影响脂质组成的化学物质生长的影响，强烈支持我们的假设，即Mps3功能与膜内稳态密切相关。
缺少细胞MPS3系统血脂异常
我们的发现MPS3-G186K系列突变体表现出严重的膜过度增殖表型，药物和影响脂质合成的突变体可以挽救这种表型，我们的观察结果表明mps3（mps3）突变体对膜流动性的变化很敏感，表明Mps3可能直接或间接调节细胞内的脂质组成。如果是这样的话，那么我们可以预计细胞缺乏MPS3系统与野生型细胞相比，脂肪成分会发生改变。为了验证这一假设，对五个野生型生物复制品的全细胞制剂中磷脂和中性脂质的水平进行了检测，pom152Δ和pom152Δmps3Δ通过电喷雾电离串联质谱（ESI/MS/MS），细胞在30°C的YPD中生长到中对数期。pom152Δmps3Δ突变体在细胞分裂中没有明显的延迟[26]因此，分析这些细胞中的脂质成分不会因温度变化、生长介质或与其他因素相关的细胞周期停滞而变得复杂mps3（mps3）等位基因。
缺少细胞MPS3系统，我们发现与对照组相比，极性脂质的总体水平没有统计学上的显著变化(). 然而，对磷脂的特定亚类的检查表明pom152Δmps3Δ突变株的磷脂酰丝氨酸（PS）水平是野生型和野生型的2.6倍和3.7倍，磷脂酰甘油（PG）水平是2.0倍和2.3倍pom152Δ单元格，分别(;表S3). 磷脂酸（PA）和磷脂酰乙醇胺（PE）的水平分别降低了1.5倍和1.3倍pom152Δmps3Δ突变体与野生型相比，尽管这些值并不十分显著（PA为p=0.11，PE为p=0.37）。其他磷脂的水平，如磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰肌醇（PI）在野生型中基本不变，pom152Δ和pom152Δmps3Δ样品。因此，极性脂质在缺乏Mps3功能的细胞中的分布受到影响。
缺乏Mps3功能的细胞中脂质水平异常。从5种独立生长的野生型中对数期培养物（SLJ001）中提取脂质，pom152Δ（SLJ4260）和pom152Δmps3Δ（SLJ4259）并通过ESI/MS/MS进行分析。计算每mg湿酵母细胞使用的每种类型的脂质总量，并将每类脂质的平均值与平均值的标准偏差一起制成表格。我们的脂质组学分析的完整总结见表S3（A）尽管总极性脂质水平没有变化，但不同类型的磷脂在pom152Δmps3Δ（白色）与野生型（黑色）或pom152Δ（灰色）。pom152Δmps3Δ细胞也显示TAG数量增加。（B） 缺少细胞POM152型只含有麦角固醇和DAG水平降低。删除MPS3系统在这些细胞中，麦角固醇和DAG的水平恢复到野生型细胞中观察到的水平。（A&B）黑色星号表示野生型的数值具有统计显著性，红色星号表示pom152Δ（p<0.05）。
对中性脂质的检查显示，细胞缺乏MPS3系统三酰甘油（TAG）含量是野生型和pom152Δ单元格(;表S3). 这些细胞还改变了三种酵母鞘脂的分布，包括肌醇磷酰神经酰胺（IPC）减少1.7倍，甘露糖醇磷酰肌酰胺（MIPC）增加2倍，尽管这些变化在统计学上并不十分显著（IPC为0.15，MIPC为0.08）。更重要的是，我们发现POM152型单独使用可使麦角固醇水平降低1.5倍，并降低二酰甘油（DAG），同时删除MPS3系统(;表S3). 这一发现至关重要，有几个原因。首先，它为我们的理论提供了生化支持，即核孔蛋白缺失导致核膜物理性质的改变([26]和以上）。第二，事实上，这些脂质组成的变化通过删除MPS3系统令人信服的证据表明，Mps3直接影响细胞膜稳态。根据我们的脂质组学数据，我们预测Mps3可能在脂质生物合成的多个步骤中发挥作用，影响中性脂质和磷脂水平。
缺乏细胞膜内稳态MPS3系统可以通过联邦航空局
我们预计核膜性质的改变将导致pom152Δmps3Δ如果SPB复制和细胞增殖需要改变脂质成分，则为突变体MPS3系统的确，我们发现pom152Δmps3Δ突变体对苯甲醇敏感，特别是在37°C时(). 虽然pom152Δ如我们的脂质组学分析所示，突变体发生了改变(;表S3)，单一缺失的生长不受苯甲醇或其他影响膜动力学的化学物质的影响(). 然而联邦航空局，但不是其他酰基辅酶A合成酶，部分挽救了pom152Δmps3高温下苄基醇板上的Δ突变体(; 数据未显示）。因此，Faa3似乎参与了从头开始核膜稳态所需的脂质合成，特别是Mps3引起的膜变化，这对SPB的插入至关重要。
缺乏细胞的膜缺陷MPS3型可以通过以下方式抑制FAA3型.（A） 野生型（SLJ001），pom152Δ（SLJ4260）和pom152Δmps3Δ（SLJ5247）细胞在23℃和37℃的连续稀释试验中，在YPD和YPD+0.2%苯甲醇上生长。平板在37℃下生长2天，在23℃下生长4天。（B） 用空质粒或GAL-FAA3型并在一系列稀释试验中测试其在37°C下在YPGR和YPGR+0.2%苯甲醇上生长2天的能力。
讨论
我们对Mps3功能域的分析使我们对其在SPB复制和核膜稳态中的作用有了新的认识。Mps3功能中跨膜结构域的要求扩展了先前的数据，表明Mps3是半桥的结构成分[30],[32]然而，我们观察到多个膜结构域可以替代Mps3跨膜结构域，这有力地证明了该蛋白质区域没有发生特定的分子内或分子间相互作用，包括通过NPC运输到INM和锚定在SPB。因此，我们测试了对其他保守结构域的要求，并惊讶地发现，至少在个别突变时，大多数结构域对野生型细胞SPB的Mps3功能并不重要。由于SPB复制在维持基因组完整性方面的关键重要性，Mps3可能具有多个结合伙伴和相互作用域。
通过对假定的Mps3 P-loop区域的突变，我们发现了一个新的显性等位基因，该等位基因揭示了Mps3在将新复制的SPB插入核膜中的作用。虽然我们可以检测到Mps3和ATP之间的结合在体外（数据未显示），甘氨酸186是P环中的保守残基，我们怀疑核苷酸结合缺陷是我们观察到的表型的潜在原因MPS3-G186K系列突变体。这是因为P环保守残基中也阻断ATP结合的其他突变体，如S190A、G192K和S194A，没有导致SPB复制和核膜内稳态的缺陷。此外，Mps3与其他真菌直系同源序列的比对表明，即使在酵母菌属血统。因此，MPS3-G186K系列很可能是一个偶然的反形态等位基因，而不是一个破坏ATP结合的突变就其本身而言.
尽管过表达MPS3系统在我们的菌株中，在30°C时几乎没有表型，在16°C和23°C时其过度生产会抑制细胞生长，并导致细胞核形态的细微变化（参见视频S1）。当Mps3过量生产时，温度依赖性对细胞活力的影响最简单的解释是，Mps3在膜内稳态中起着直接作用。在较低温度下生长时，饱和脂肪酸和长变化脂肪酸数量减少，固醇水平变化[64],[65]与Mps3过度生产导致的膜成分变化不相容。这种不相容性导致SPB插入失败以及核结构的其他变化。脂肪组成和核结构的变化在MPS3-G186K系列突变，使该等位基因在大多数条件下都有毒，包括在30°C下生长。此外，由于膜破裂是显著的，生长停滞是紧密的，所以这种等位基因可以进行遗传和细胞生物学分析。
膜过度增殖GAL-MPS3-G186K型但不是加仑-兆帕3强烈地表明，这不仅仅是由于整体膜蛋白的过度生产，而是由于过度表达突变版本的MPS3型我们建议，这种改变版本的Mps3滴定出核膜稳态和/或SPB复制所需的关键因素。最明显的候选基因是Mps3的内源性野生型拷贝，因为已知SUN蛋白会寡聚，并且纺锤体极Mps3减少会导致SPB复制缺陷[23],[32],[69]–[71]与此观点一致MPS3系统使用2微米质粒部分缓解了GAL-MPS3-G186K型在30°C下生长的细胞中(图S2). 其他候选因子包括核糖体生物发生因子Erb2和Rrs1，它们与Mps3相互作用，是核形态所必需的[48].
细胞膜的增殖是由于膜蛋白水平的增加而引起的，以前曾在多种细胞类型中有报道；然而，我们在表达MPS3-G186K系列在结构上有几种不同的方式。首先，与被称为果核的内质网膜扁平阵列不同，它是在细胞过度表达后形成的HMG1型，编码3-羟基-3-甲基谷氨酸辅酶A[72]–[75]，的MPS3-G186K系列-依赖膜似乎只存在于核内，很可能代表INM的过度增殖。第二，与Nup53过度生成形成的核内膜不同，Nup53缺乏NPC[54]，的MPS3-G186K系列膜含有至少部分起作用的NPC。在脊椎动物细胞中，Sun1定位于NPC并似乎在其组装中发挥作用[22]–[24]然而，尽管高度弯曲的膜参与了NPC和SPB复制，但酵母中的这种功能似乎并不保守，因为Mps3不与NPC共存[48]第三，形成以下核内阵列MPS3-G186K系列表达通常与核膜密切相关，这表明MPS3-G186K系列-诱导膜能够与其他核膜蛋白相互作用。这与核质内形成的核膜阵列形成对比，核膜阵列似乎与大面积的核膜无关[76],[77]第四，尽管由于外周膜蛋白Esc1水平的增加而形成的复杂的膜延伸（称为越轨）也包括NPC[78]，越轨中发现的多余膜起源于核空泡连接处，导致主要的细胞质延伸，而MPS3-G186K系列细胞膜开始于细胞核内的小管，然后融合成核内细胞膜。第五，与膜耀斑不同，膜耀斑是由参与PA和DAG生成的蛋白质的破坏形成的[53],[79]–[81]，膜增殖MPS3-G186K系列突变体并不局限于核仁区域，而是出现在细胞核内的多个位点。然而，有趣的是，在过度表达两者的细胞中，核仁通常在一个单独的叶中与细胞核分开MPS3-G186K系列以及MPS3型这与核膜的这一区域具有独特的分子组成的观点一致。细胞内过度表达MPS3系统或MPS3-G186K系列我们观察到，与野生型相比，大多数类型的极性脂质和麦角固醇的水平都有所增加（数据未显示）。DAG水平也在MPS3系统过度表达细胞，但在MPS3-G186K系列突变体，这可能是我们在这两个菌株之间观察到的膜形态和SPB复制的一些差异的原因。
在MPS3-G186K系列细胞，多余的膜在核质内形成小管，然后融合形成突变体中观察到的核内膜。目前尚不清楚这些小管是如何启动的，但它们似乎是核膜组装中的中间产物。奇怪的是，在过度表达的细胞中检测到类似的管状结构NUP53号机组在精子染色质周围的核膜形成过程中爪蟾卵母细胞[54],[82]我们观察到，脂质成分影响细胞活力、核形状和膜形态MPS3-G186K系列突变体表明，核内小管的特殊性质对其形成、融合和堆积形成完整的核膜至关重要。至少有一个重要参数是Faa3产生的脂肪酸量。这种酶催化长链和超长链脂肪酸的酰化在体外这对于形成高度弯曲的膜很重要，例如发生在NPC和SPB插入部位的膜[83],[84]。通过限制这些类别脂肪酸的数量，可能更难形成膜弯曲，这可能有助于限制由MPS3-G186K系列。我们没有发现任何一种mps3（mps3）然而，突变体(表S3; 数据未显示）。可能只有一小部分脂肪酸侧链被修饰，使得在群体分析中难以检测，或者Faa3可能具有不同的底物特异性体内此外，其他膜修饰，如固醇插入，可能是控制细胞内核膜结构的驱动力。酵母中参与甾醇生物合成的许多基因都由必需基因编码[85]因此，它们不存在于单倍体酵母缺失集合中，因此它们不会在我们的筛选中被发现。
NPC亚单位的缺失抑制与编码SPB成分的几个基因突变相关的SPB复制缺陷[4],[25]–[27]。我们发现删除POM152型与野生型细胞相比，麦角固醇和DAG水平降低，这表明核穿孔蛋白缺失可能影响核膜的脂质组成。这可能是通过参与脂质生物合成的基因的运输减少或相关信使核糖核酸的输出减少而发生的。膜组成的这些变化也可以解释pom152Δ以及与膜流动性、固醇合成、细胞器完整性和膜弯曲有关的基因[18],[20],[21],[86].
在pom152Δmps3Δ突变体、脂质组学分析表明，麦角固醇和DAG的平衡被重置为接近野生型水平，这可以解释为什么在双重删除中没有观察到SPB复制和核形态缺陷[26]。其他种类的脂质，如TAG，在缺乏MPS3系统表明Mps3在调节膜稳态中起着直接作用。细胞膜增殖和药物敏感性等位基因特异性缺陷的观察mps3（mps3）其他SPB突变体中未检测到的突变体进一步支持了这一假设。事实上，这些相同的等位基因MPS3系统SPB复制缺陷表明，核包膜中依赖于Mps3的变化对新SPB的形成很重要，可能在SPB组装的多个步骤中。酵母研究，粘液菌,秀丽线虫哺乳动物细胞表明SUN蛋白功能的丧失导致核形态异常[30],[32],[41],[48],[87]–[89]它们是直接参与核膜的合成或维持，还是通过与核膜的结合间接参与尚不清楚[90]关于SUN蛋白如何在膜内稳态中发挥作用的最好提示可能来自裂变酵母SUN蛋白Sad1的双杂交分析，该分析指出与乙酰辅酶A羧化酶Cut6的相互作用是从头开始长链脂肪酸的生物合成与有丝分裂进程[91],[92]很像SUN蛋白与其ONM结合伙伴（称为KASH蛋白）在核周间隙的结合[35]我们设想，像Mps3这样的SUN蛋白也可能与参与膜结构的因素有关。Mps3与参与膜重构的酶或其他蛋白质的结合可能是促进核膜特定部位（如复制SPB或NPC）膜弯曲和融合的机制。然而，Mps3也可以通过在核外周隔离参与脂质合成的因子，在转录水平上控制膜合成。未来旨在鉴定Mps3结合伙伴的研究将有助于我们更好地理解SUN蛋白在膜动力学和核形态中的作用，并阐明核膜中Mps3依赖性变化使复制的SPB插入核膜的机制。
材料和方法
酵母菌株和质粒
所有菌株都是W303的衍生物(ade2-1 trp1-1 leu2-3112 ura3-1 his3-11,15 can1-100)和列在表S1除了用于和表S2，在BY4741中(Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)和来自酵母缺失收集（Open Biosystems）。标准技术用于DNA和酵母操作。
删除MPS3系统，融合SPC110标准和NUP49号机组到GFP和融合HTB2型（其编码组蛋白2B的两个拷贝之一），SPC42型或网络1通过基于PCR的方法对mCherry进行检测[93],[94]PCR证实整合正确。
这个MPS3系统通过PCR扩增ORF和～500 bp启动子，并将其克隆到含有GFP的pRS306载体的XhoI和BamHI位点，以构建pSJ650（pRS307-MPS3-GFP系列)[41].pSJ148（pRS305）的建造-MPS3系统)已在前面描述过[32].过度表达MPS3系统，整个打开的阅读框被直接插入加仑1在pRS306中创建pSJ146（pRS30六-GAL1-MPS3型). 用BstEII或ApaI消化质粒，以靶向整合LEU2级或URA3公司分别是。副本数量MPS3系统用Southern印迹法测定整合度。使用快速改变突变试剂盒（Stratagene）在这些质粒中生成缺失和点突变以及跨膜插入。每个缺失突变体包含所示氨基酸的帧内缺失；在2xpQ突变的情况下，在pQ编码序列之后立即插入一个额外的pQ域拷贝。进行测序以确认进行了正确的碱基对替换或删除。
测试救援MPS3-G186K系列，从酵母平铺文库中提取含有指示SPB基因的质粒[95]并转化为SLJ1797。对于稀释分析，5 OD600细胞在无菌培养基中连续稀释10倍，并印在琼脂平板上。YPD含有2%的葡萄糖，YPGR含有2%的半乳糖和2%的棉籽糖作为碳源。从Sigma购买化学品，并按以下数量添加到培养基中：5 mM油酸、0.2%苯甲醇、1.25µg/ml特比萘芬和1µg/ml酮康唑。
细胞学技术
如前所述，Mps3-GFP、H2B-mCherry、核定位序列（NLS）报告子、HDEL-dsRed和Pus1-GFP的定位被可视化[41]简单地说，离心1 ml培养物，用1 ml ddH清洗2O、 在约100µL的ddH中再次悬浮2O和10µL置于25%明胶垫上进行图像分析。使用共焦显微镜（LSM-510-META；蔡司）进行荧光检测，共焦显微镜配备ConforCor 3模块和雪崩光电二极管探测器，允许使用100×1.46 NAα-平面Fluar物镜（蔡司）进行单光子计数。GFP用488nm氩激光线激发，而mCherry用561nm HeNe激光线和适当的滤光片组激发。发射的光子通过BP 505–540 nm和LP 580 nm过滤器收集，根据绿色通道，针孔尺寸为1.03艾里单位。使用AIM v.4.2软件（蔡司公司）获取数据。在室温下，通过细胞以0.3微米步长的8–10个图像堆栈收集图像。使用ImageJ软件（NIH）处理图像。在至少三个独立的实验中，通过荧光显微镜分析每个基因型的至少两个独立的转化子。N∶C比的计算如前所述[28].
时间推移图像分析镀锌MPS3或GAL-MPS3-G186K型菌株在30°C的YEP和2%棉子糖中培养过夜，然后稀释回OD600在30°C下添加2%半乳糖（无半乳糖）、0.2%苯甲醇、5 mM油酸、1.25µg/ml特比萘芬或1µg/ml酮康唑30 min。离心一ml培养液以浓缩细胞，并将5µL置于含有相同培养基和化学处理的1%琼脂糖垫上。在半乳糖诱导30分钟后的1小时至3小时内，使用相同的显微镜配置，但使用40×1.3 NA油物镜（蔡司）拍摄荧光图像。发射的光子通过BP 505–540 nm和LP 580 nm过滤器收集，根据绿色通道，针孔尺寸为1.03艾里单位。在室温下通过细胞收集17个图像堆栈，步长为0.7微米。512×512个图像在空间上分为2×2，每个Z切片应用最大投影。所有数据处理和视频生成均在ImageJ（NIH）中完成。
为了使用红/绿焦点分析表征SPB复制，使用100×1.4 NA油物镜在配备横河CSU-10旋转圆盘的200 m倒置蔡司上采集图像。GFP和mCherry分别使用488 nm激发和568 nm激发，发射分别通过BP 500–550 nm和BP 590–650 nm过滤器收集到哈马松EMCCD（C9000-13）上。对于每个通道，使用0.6或0.7微米的间距获取Z堆栈。共获得13个切片，并创建最大投影图像，用于使用ImageJ（NIH）分析病灶。
如前所述，通过流式细胞仪、EM和间接免疫荧光显微镜进行DNA含量分析和蛋白质定位[30],[32],[96].聚乙烯（A）+就地如前所述，使用Cy3标记的寡核苷酸（dT）50探针进行杂交[97]用蔡司Axioimager和100×蔡司平面模糊透镜（NA=1.45）对细胞进行检查，用哈马松Orca-ER数码相机拍摄图像并用ImageJ（NIH）进行处理。
蛋白质印迹
使用以下一级抗体稀释液：1∶1000抗Flag（Sigma）和1∶1000葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH；Sigma。荧光偶联二级抗体以1∶10000的比例使用Odyssey系统（Li-Cor）进行分析和定量。
ESI-MS/MS脂质分析
酵母细胞在30°C的YPD中培养过夜，稀释至OD600在相同的培养基中生长6–8小时。记录样品的湿重，并通过以下程序提取脂质。使用玻璃珠和水均质颗粒细胞，并将水均质细胞转移到15 ml聚四氟乙烯内衬玻璃管中。向0.8份（1.6 ml）均质细胞的水溶液中添加1份（2 ml）氯仿和2份（4 ml）甲醇。振荡浆液，加入1份（2毫升）氯仿和1份（2毫升）水。摇匀后，将浆液低速离心5–10分钟，并去除下层。加入一部分氯仿，摇匀，离心，再次去除下层。重复这一过程，并用小体积的1M KCl洗涤合并的下层一次，用小体积的水洗涤一次。在液氮下干燥合并的氯仿提取物和洗涤后的氯仿萃取物，并将其储存在−20°C的2 ml衬有特氟隆的玻璃瓶中。
使用自动电喷雾电离串联质谱法（ESI-MS/MS）分析这些样品中的脂质成分，并如前所述进行数据采集和分析[98]经过修改。从每个1 ml脂质样品中使用5至20µl的氯仿提取物小份。如前所述获得并量化的内部标准的精确数量[99]，添加量如下：0.3 nmol di12:0-PC，0.3 nmol di24:1-PC，0.3nmol 13:0-lysoPC，0.3nmol19:0-lysoSoPC，0.3 nmoldi12:0-E，0.3nmole di23:0-PE，0.3nmoli 14:0-lyso-PE，0.3nmrol 18:0-lyso PE，0.3nm ol di14:0-PG，0.3nmOL di20:0（植酸基）-PG，0.3 nmole di14:0-PA，0.3 nmoli di20:00（植酸根基）-PA，0.2 nmol di14-0-PS，0.2 nmol di20:0（植酸基）-PS、0.46 nmol 16:0-18:0-PI、0.33 nmol di18:0-PI，3.1 nmol tri17:1 TAG和4.6 nmol di15:0 DAG。将样品和内标混合物与溶剂结合，使氯仿/甲醇/300 mM醋酸铵在水中的比率为300/665/35，最终体积为1.4 ml。
通过在三重四极杆质谱仪（4000QTrap，Applied Biosystems）上连续输注ESI源，将未分馏的脂质提取物引入ESI源。使用自动采样器（LC Mini PAL，CTC Analytics AG，Zwingen，Switzerland）引入样品，该自动采样机配备采集时间所需的注射回路，并以30µl/min的速度将样品提交给ESI针。
提取物的连续前体和中性丢失扫描产生一系列光谱，每个光谱显示一组含有共同头部组片段的脂质物种。通过以下扫描检测脂质种类：PC和lysoPC，[M+H]+前驱体为184.1的正离子模式离子（184.1前）；PE和lysoPE，[M+H]+正离子模式下的离子，中性损耗（NL）为141.0（NL 141.0）；PG，[M+NH4]+PG为NL 189.0的正离子模式；PI，[M+NH4]+在NL 277.0的正离子模式下；PS，[M+H]+在NL 185.0的正离子模式下；PA，[M+NH4]+在NL 115.0的正离子模式下；IPC，[M−H]−负离子模式下，前驱体为259.0；MIPC，[M−H]−负离子模式下，前驱体为421.0；M（IP）2C、 【M−H】−负离子模式下，前驱体为663.1；（lysoPG，[M−H]−处于负离子模式，前体152.9用作IPC、MIPC、M（IP）的标准2C） ●●●●。碰撞气体压力设置为2（任意单位）。碰撞电池中氮的碰撞能量为：PE为+28 V，PC为+40 V，PA、PI和PS为+25 V，PG为+20 V，IPC为-72，MIPC为-80，M（IP）为-752C、 lysoPG为-57。所有阳性模式扫描的去集群电位为+100 V，IPC、MIPC和M（IP）的去集群电位为-1802C、 lysoPG为-100。PE的入口电位为+15 V，PC、PA、PG、PI和PS为+14 V，IPC、MIPC和M（IP）为-13 V2C、 lysoPG为−10。PE的出口电位为+11 V，PC、PA、PG、PI、PS为+14 V，IPC、MIPC和M（IP）为-10 V2C、 lysoPG为−14。扫描速度为50或100 u/s。将质量分析仪调整为0.7 u全宽半高分辨率。对于每个光谱，在多通道分析仪（MCA）模式下平均9至150次连续扫描。使用一系列中性损失扫描检测麦角固醇酯、DAG和TAG物种，如[M+NH4]+离子。扫描将各种脂肪酸的损失作为中性氨化片段：NL 285.2（17∶1，TAG内标）；NL 259.2（DAG内标为15∶0）；NL 271.2（16∶1）；NL 273.2（16∶0）；NL 299.2（18∶1）；和NL 301.2（18∶0）。扫描速度为100 u/s。碰撞能量为+25 V，入口电位为+14 V，出口电位为+14V。在MCA模式下，对50次连续扫描进行平均。源温度（加热雾化器）为100°C，界面加热器打开，向电喷雾毛细管施加+5.5 kV电压，幕气设置为20（任意单位），两种离子源气体设置为45（任意单位。
减去每个光谱的背景，对数据进行平滑处理，并使用自定义脚本和Applied Biosystems Analyst软件整合峰面积，并对数据进行同位素变体重叠（a+2峰）校正。第一次，通常每11次第个仅在内标混合物上获得了一组质谱。确定了这些光谱中与目标脂质相对应的峰，并计算了摩尔量，将其与相同脂质类别的两个内标物进行比较。为了校正样品中的化学或仪器噪声，从每组样品光谱中计算的每种代谢物的摩尔量中减去“仅内部标准”光谱中检测到的每种脂质代谢物摩尔量。每个“仅内部标准”光谱组的数据用于校正以下10个样品的数据。最后，对所分析样品的分数进行校正，并将其归一化为毫克湿重，以生成单位为nmol/mg的数据，DAG、TAG和麦角甾醇酯除外。对于这些类别的分析，电离效率存在差异[100]因此，内标物MS响应的比率不能提供与每个物种含量成正比的值。因此，DAG、TAG和麦角甾醇酯量表示为相对质谱信号/mg湿重，其中1.0的信号表示等于1 nmol tri17:1 TAG或1 nmol di15:0 DAG（内部标准）的信号。
支持信息
图S1
Mps3定位或SPB功能不需要特定的跨膜结构域序列。（A） 其他完整膜蛋白的跨膜区被用来取代Mps3的跨膜区域，这些蛋白定位于在mps3ΔTM（Heh1TM2）-GFP（SLJ4320）的情况下，由于该等位基因是非功能性的，因此使用覆盖质粒进行成像。棒材，2µm。（B） 用于替代Mps3的其他膜蛋白的Mps3跨膜结构域和跨膜区域的序列。总结一下每个嵌合结构的互补能力mps3Δ（SLJ2694），根据30°C.++下5-FBA的生长情况进行评分，表示强劲增长，与野生型相当MPS3系统；+，表明生长良好，菌落大小小于野生型，倍性没有增加；+/-，表示生长不良和/或倍性增加；−，表明没有类似于空载体的生长。此外，每个嵌合蛋白的定位如（A）所示。对每个基因型的30多个细胞进行了检查，并总结了主要的定位模式。那些标有星号的包含覆盖质粒。还显示了基于TMpred的Mps3和嵌合蛋白的预测拓扑结构[102]：这里，i-o表示内部到外部，而o-i表示内部的反面。在某些情况下，拓扑预测不明确。在大多数情况下，有一个强有力的预测，即嵌合蛋白将具有类似于Mps3的i-o拓扑结构，这表明嵌合蛋白的补体失败不一定是由于膜取向的逆转。
（每股收益）
图S2
抑制MPS3-G186K系列SPB成分过度表达的毒性。GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）在2μ-LEU2级酵母平铺文库中的质粒[95]并在一系列稀释试验中检测生长情况。在SC-URA-LEU+2%葡萄糖上生长的细胞在30°C下培养3d，而在SC-URA-LEU+2%半乳糖+2%棉籽糖上生长的电池在30°C下培养5d。
（每股收益）
图S3
年核进出口受到重大影响MPS3-G186K系列.（A–B）野生型（SLJ5384），镀锌MPS3（SLJ5093）和GAL-MPS3-G186K型将含有H2B-mCherry和cNLS-GFP的菌株（SLJ5094）在SC-LEU+2%棉子糖中培养过夜，然后将培养物分成两组：一组添加2%葡萄糖，另一组添加2%半乳糖，培养物在30°C下培养2h。通过活细胞成像（A）分析cNLS-GFP在细胞核和细胞质中的分布，然后定量cNLS-GFP蛋白（B）的核质比（N∶C）。（C–D）镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）菌株也在YEP+2%棉子糖中培养过夜，然后将培养物分为两组：一组添加2%葡萄糖，另一组添加2%半乳糖，培养物在30°C下培养4小时。收集细胞，并使用Cy3标记的寡核苷酸（红色）通过荧光原位杂交分析polyA定位。DNA用DAPI（蓝色）（C）染色。定量细胞核和细胞质中mRNA的分布，以生成N∶C比（D）。n> 所有样品150；显示了与葡萄糖样品相比的统计学显著性。棒材，5µm。
（每股收益）
图S4
甾醇生物合成抑制剂抑制MPS3-G186K型.（A）野生型（SLJ001），镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）细胞在30°C的连续稀释试验中，在YPD、YPGR和YPGR+1µg/ml酮康唑平板上生长的能力进行了测试。培养平板2天。（B）此外，GAL-MPS3-G186K型添加2%半乳糖+1µg/ml酮康唑后，在30°C下6 h分析含有HDEL-dsRed（红色）和Pus1-GFP（绿色）的（SLJ4965）在SC-LEU+2%棉子糖中过夜生长，以确定对核形态的影响。棒材，5µm。（C） 用流式细胞仪分析DNA含量。
（每股收益）
图S5
油酸、特比萘芬和苯甲醇处理后的Mps3和Mps3-G186K水平。在YPGR中用不同的化学物质处理6小时后，或YPGR转换至33°C 6小时后（如). 用抗FLAG抗体检测印迹，以检测Mps3或Mps3-G186K蛋白水平，并用抗G6PDH作为负荷控制。生长在葡萄糖和半乳糖中的细胞分别被赋值为0和1，并显示了典型实验中处理细胞的水平。
（每股收益）
表S2
的抑制器GAL-MPS3-G186K型.
（XLS）
表S3
缺乏细胞的脂质组学分析MPS3系统.
（XLS）
视频S1
的增长镀锌MPS3在YPGR中。HDEL-dsRed标记核膜和ER，而Pus1-GFP突出显示包含镀锌MPS3在23°C条件下，在YEP和2%棉子糖和2%半乳糖中生长。从~75-90分钟，左上角细胞进行有丝分裂，观察到细胞核形成沙漏形，然后在母子细胞之间伸长。有丝分裂完成后，细胞核再次变圆。在~130–160分钟之间，在右下方的细胞中观察到了另一次有丝分裂。在随后的时间点，观察到了核形态的一些变化，但总体而言，核在整个3.5小时的时间过程中基本上保持了相对正常的形状。棒，5µm。
（移动电话）
视频S2
的增长GAL-MPS3-G186K型在YPGR中。HDEL-dsRed标记核膜和ER，而Pus1-GFP突出显示包含GAL-MPS3-G186K型在23°C条件下，在YEP和2%棉子糖和2%半乳糖中生长。在时间进程的开始，右上角的第二个细胞呈椭圆形，表明它开始有丝分裂。细胞核伸长，两个肿块分离为母细胞和子细胞，但在整个时间序列中，仍可以在两个细胞核之间的一个薄区域检测到Pus1-GFP信号。大约150分钟，原子核的变形开始变得明显；在某些情况下，如右上角的细胞，细胞核区域似乎形成叶，然后这些叶可以相互萌芽并融合。棒材，5µm。
（移动电话）
视频S3
的增长GAL-MPS3-G186K型YPGR中添加5 mM油酸。HDEL-dsRed标记核膜和ER，而Pus1-GFP突出显示包含GAL-MPS3-G186K型在23°C条件下，在YEP和2%棉子糖和2%半乳糖中生长。此外，添加了5 mM油酸，抑制了核形状的大多数动态变化。底部中心的细胞在～195 min时进入有丝分裂。Bar，5µm。
（移动电话）
视频S4
的增长GAL-MPS3-G186K型YPGR加2%苯甲醇。HDEL-dsRed标记核膜和ER，而Pus1-GFP突出显示包含GAL-MPS3-G186K型在23°C条件下，在YEP和2%棉子糖和2%半乳糖中生长。此外，添加2%苯甲醇。尽管这些细胞的核形态有些异常，但在延时过程中观察到三次有丝分裂，这表明添加苯甲醇抑制了与显性突变体表达相关的中期阻滞。棒材，5µm。
（MOV）
视频S5
的增长GAL-MPS3-G186K型在YPGR中加1.25µg/ml特比萘芬。HDEL-dsRed标记核膜和ER，而Pus1-GFP突出显示包含GAL-MPS3-G186K型在23°C条件下，在YEP和2%棉子糖和2%半乳糖中生长。此外，添加1.25µg/ml特比萘芬。虽然一些细胞核像进入有丝分裂一样伸长（上中央细胞），但在时间过程中或随后的图像分析中未观察到核分裂。细胞核似乎也包含一些延伸，类似于缺乏特比萘芬的细胞。棒材，5µm。
（移动电话）
