α-连接的双半乳糖苷与人半乳糖凝集素-1结合的结构方面

MD模拟

为了进一步了解分子识别过程，我们对gal-1单体和这些α-二糖进行了MD模拟。在所有情况下，我们都从每种二糖的对接协议开始，通过使用gal-1的X射线晶体结构（PDB访问代码1gzw）关注碳水化合物识别位点。对于Galα（1→3）Gal和Galα。也考虑了其他初始姿势，但它们与实验STD数据不一致，参见表位映射部分。对于Galα（1→6）Gal，选择了两个不同的起始复合物，两个环相对于蛋白质的相对取向不同。这些对应于对接协议中发现的两个人口最多的集群。对于Galα（1→4）Gal，考虑了一个额外的起始几何结构，配体位于最近报道的非乳糖相互作用域，即α-半乳甘露聚糖Davanat结合区(Miller、Klyosov等人，2009年). 所有模拟在100 ps的平衡期后运行3 ns。在所有模拟过程中，蛋白质结构稳定，双糖保持在结合位点，没有扩散到溶剂中。图6显示了当与gal-1结合时，所有三种α-二糖在能量上最有利的结构（图6B和C），以及乳糖（Galβ（1→4）Glc）（图6D） 。在此基础上，图7A–D通过更详细的配体结合腔视图说明了结合模式。有关这些模拟的其他信息，请参阅补充章节其中显示了RMSD和扭转角与轨迹的变化，以及描述氢键相互作用和碳水化合物-芳香族残基接触的结构图示，如表位映射所述。

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图6。

从MD模拟中，结合到每一种二糖的gal-1的最有利单体亚基结构被阐明：galα（1→3）gal(A类)，加仑α（1→4）加仑(B类)，Galα（1→6）Glc(C类)和Galβ（1→4）Glc（乳糖）(D类). 根据HSQC化学位移图¹⁵N–¹如文中所述，在每种gal-1结构上，纯gal-1和gal-1在存在这些二糖的情况下的H加权化学位移变化（超过2 SD）以蓝色突出显示。

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图7。

相同结构的碳水化合物结合位置如图所示6对于结合的每种糖：Galα（1→3）Gal，都有更好的说明(A类)，加仑α（1→4）加仑(B类)，Galα（1→6）Glc(C类)和Galβ（1→4）Glc（乳糖）(D类). 潜在的氢键用虚线表示，虚线连接蛋白质及其碳水化合物配体上的接触对。

在用Galα（1→3）Gal单体模拟的过程中，糖苷扭转角的变化表明了构象之间的相互转化。在这方面，Φ角始终为负值，与反计量效应一致(Batchelor等人，2001年)，并且不同的构象与不同的Ψ角值共存（负值或正值），每个都保持在双糖的最小能量区域内。显然，自由Galα（1→3）Gal在能量上受欢迎的构象不会因与Gal-1的相互作用而改变，即使在MD轨迹中Galα。事实上，这些波动似乎主要与gal-1残基的瞬时分子间相互作用有关。此外，在模拟过程中，除了H44和Gal O4′之间的典型氢键（定义半乳糖苷被半乳糖凝集素识别）之外，似乎只有一个额外的氢键存在，即N61和Gal O3′之间的氢键，在Gal残基和Gal-1之间瞬时形成的其他几个氢键（参见补充章节).

与乳糖相比，α-糖苷键在还原端的糖-蛋白质氢键模式中产生了显著变化，这是对异序性的影响进行检查的结果。在这种模型糖的情况下，Glc O3与Glu71和Arg48之间有很强的氢键(López-Lucendo等人，2004年). 由于α-键（而非β-键）和1→3键的存在，还原端残基的取向大不相同，在E71和该糖的羟基OH1和OH2之间只观察到瞬时氢键。图中所示的结构显示了各种相互作用6A和​和7A，7A、 和其他内容在补充章节与乳糖相反（图6D和​和7D），7D） 例如，R48现在远离α-连接的半乳糖残基。

除了形成氢键外，gal-1还建立CH-π晶体和溶液中显示的相互作用(Siebert等人，1997年;López-Lucendo等人，2004年). 它们形成于核心半乳糖的非极性B面和适当定位的Trp残基的吲哚环之间（W68表示gal-1）。在定量方面，MD模拟期间这种相互作用的发生频率似乎小于乳糖。综上所述，我们的MD结果根据表位映射，定义了α-半乳糖苷结合的结构模型，也与在竞争结合分析中观察到的Galα（1→3）Gal与Gal-1的结合较弱相一致，与实验测定的乳糖相比，在10-25倍范围内(Sparrow等人，1987年;Ahmed等人，1990年).

对于Galα（1→4）Gal，糖苷扭转角和整体构象在轨迹期间也保持相当稳定，平均Φ和Ψ扭转角分别约为−38°和0°，且波动较小。特别是，Ψ-角度在零值附近显示正值或负值。总的来说，这两个角度都对Φ，Ψ-构象图的能量定义明确的区域进行了采样（总是在最低能量区域内），这是两个主要构象的特征。显然，能量特权构象体被选择用于结合，这对于各种类型的凝集素来说是常见的(Gabius等人，2011年)，对于gal-1结合二糖，支链五糖或高度柔性C类-乳糖(Asensio等人，1999年;Alonso-Plaza等人，2001年;Siebert等人，2003年). 关于氢键，同样，观察到的模式与观察到的乳糖模式不同。事实上，二糖在结合位点内的取向是相当不同的，非还原端现在指向乳糖结合位点。这种α-异构体连接妨碍了非还原端在乳糖部位的正确定位，并且似乎没有与W68发生堆积。此外，Galα（1→4）Gal的非还原Gal′部分似乎没有与Gal-1形成稳定的极性相互作用，甚至没有涉及Gal′O4和H44的典型极性相互反应。相比之下，H44似乎与Gal O1形成氢键，而还原半乳糖的两个羟基（O2，O3）似乎与N61和E71形成短暂的分子间氢键。因此，对于这种二糖，似乎很少有稳定的分子间相互作用（见图6B和​和7B，7B、 和中提供的材料补充章节)与实验检测到的相对较弱的结合亲和力一致。

原则上，Melibiose（Galα（1→6）Glc）比具有α（1～3）或（α1→4）连接的两个双半乳糖苷更灵活，因为存在额外的扭转自由度，即ω围绕C5–C6键的角度将糖苷键转变为三键系统。我们最初的对接研究表明，在碳水化合物结合位点中存在两种不同取向的蜜二糖，表现出相似的Φ、Ψ和ω二面角，但具有CH–拓扑π半乳糖环和W68之间的相互作用。因此，我们对这两个复合体进行了MD模拟。在第一种情况下，复合体在MD运行期间保持相当稳定，扭转角由Φ−50°、Ψ−75°和ω−56°，并围绕这些值有明确的波动。在这个方向上，半乳糖与W68的非极性表面的氢键模式和堆积在整个轨迹中持续存在。在半乳糖环的E71和羟基OH3和OH4之间以及Asn33和羟基OH1′和OH2′之间均观察到氢键。替代二糖/gal-1复合物在模拟过程中也保持稳定，二糖扭转角约为Φ−43°、Ψ−45°和ω−51°. 对于这种构象，CH-πW68吲哚环与半乳糖质子H1、H2和H6之间保持相互作用。从图中可以明显看出，Glc单位与蛋白质组没有任何显著接触6C和​和7C7C（以及补充部分). 从实验方面来看，Galα（1→6）Glc/Gal-1络合物的STD光谱显示了涉及非还原Gal单元的接触。此外，HSQC滴定显示W68存在显著的化学位移扰动，支持基于MD模拟的模型构建。

因为最近通过测试α-半乳甘露聚糖发现了与碳水化合物有亲和力的第二个位点(Miller等人2009b)，我们还使用MD探索了Galα（1→4）Gal在该位置的反应性。我们对替代结合位点进行了对接研究，然后进行了MD模拟。由于对接过程预测了残基90–113周围区域中Galα（1→4）Gal的第二个簇（常规配体结合位点除外），因此选择了该区域的最佳对接方向，以便使用显式溶剂进行额外的MD模拟。轨迹分析表明，在整个模拟过程中存在两个处于平衡状态的构象，Φ角保持为负值，与反计量效应一致。最重要的是，双糖和gal-1之间没有显著的相互作用，可以克服替代几何结构的能量屏障。和以前一样，这两种构象都保持在这种双糖的最低能量区。为了使实验观察与MD模拟相一致，我们仔细研究了Galα（1→4）Gal和几种氨基酸之间的各种分子间距离。特别是，对HSQC实验中光谱变化最大的残基91、92、95、104、112和113的距离进行了监测。综上所述，Galα（1→4）Gal在MD模拟期间未显示任何主要构象变化。但在模拟过程中，它相对于gal-1的位置发生了显著变化。事实上，Gal残基和这些氨基酸之间的距离仍然很大，始终大于6º。

分子建模

单体形式gal-1的起始坐标来自蛋白质数据库(网址：www.rcsb.org)，即PDB代码1gzw（1.7°分辨率）。在对接研究之前，该结构是用Schrödinger软件包的Wizard工具准备的，用于分子建模(薛定谔2005)，乳糖被去除，极性氢被添加，科尔曼充电(Weiner等人，1984年)分配给所有原子。手工检查组氨酸残基的质子化。对于双糖ϕ/ψ在Macromodel中使用MM3力场评估势能面(薛定谔2005). 得出的最小值与CERMAV数据库中的双糖值完全一致。高斯03(Frisch等人，2004年)用于执行从头计算-基于HF/6-31G理论水平的双糖几何优化。使用高斯函数和6-31G（d）基组函数将原子部分电荷分配给分子。

AutoDock 4.0.1(Garrett等人，2009年)用于对接研究，首先通过关注gal-1的碳水化合物识别域进行。三维网格（60×60×80°^三)中心位于W68的NE1，即凝集素位点的中心残基，间距为0.375º。基于先前的NMR监测，特别是半乳甘露聚糖的NMR监测，额外的对接研究集中在测试二糖的gal-1的假定替代位点上(Miller、Klyosov等人，2009年;Miller，Nesmelova等人，2010年). 在这种情况下，对接网格大小为40×40×50º^三并居中以包含由残基序列90–105定义的区域。对于这两种对接协议，应用了以下限制：二面体ϕ/ψ扭转角度被调整到最低能量构象，而ω非还原性半乳糖寡糖与半乳糖凝集素的相互作用中，半乳糖残基的扭转角固定在gt构象中。选用拉马克遗传算法进行配体构象搜索。对于每种化合物，对接参数如下：100个对接试验，100个种群大小，随机起始位置和构象，平移步长2.0°，旋转步长60°，精英1，突变率0.02，交叉率0.8，局部搜索率0.06，能量评估250000。最终对接构象通过使用1.5º根-平方偏差（RMSDs）的公差进行聚类。

对于MD模拟，使用GLYCAM的琥珀力场(Kirschner等人，2008年)采用ff99EP参数集描述gal-1/双半乳糖苷复合物。所有MD模拟均使用砂光机琥珀色模块10(Case等人，2008年). 三个Na⁺加入反离子以中和该系统。然后使用TIP3P水溶解每个系统(Jorgensen等人，1983年)在一个立方体盒子中，复合体周围至少有10度的距离。Shake算法适用于所有含氢键(Ryckaert等人，1977年)，并使用1fs集成步骤。模拟使用周期性边界条件，静电相互作用使用光滑粒子网格Ewald方法表示(Darden等人，1993年)，网格间距为1º。每个系统在25ps的时间内从100到300K进行温和退火。然后在50 ps期间将系统保持在300 K的温度下，并进行溶质抑制和渐进能量最小化，逐渐释放溶质的限制，然后从100到300 K进行20 ps的加热阶段，在此阶段去除限制。最后，每个系统的生产模拟持续了3 ns，并在等温-等压系综中继续进行。在所有平衡和生产过程中，每2 ps记录一次坐标轨迹，从而得出每个复合体1500个结构的集合，以供进一步分析。对于Galα（1→3）Gal和Galα。对于Galα（1→6）Gal，选择了两个不同的起始络合物（围绕连接两个环的C5–C6键有两个不同取向）；这些对应于对接协议中发现的两个人口最多的集群。为了评估起始几何形状的任何影响，考虑了两个环相对于蛋白质的相对取向不同的其他起始几何形状。在所有情况下，唯一与STD数据一致的复合物（见表位映射一节）是那些对应于“类乳糖”相互作用模式的复合物。因为MD模拟只运行了3 ns，所以我们在补充部分以证明所有模拟都收敛了。

使用AMBER和VMD软件包组合分析MD轨迹。总的来说，在gal-1的CA、C和N原子（蛋白质骨架）重叠后，使用ptraj（AMBER）计算RMSD变化。在MD运行的3 ns期间，在双半乳糖苷和氨基酸之间以及与水分子之间形成的氢键生成均通过ptraj进行鉴定（截止值=4º）。在模拟期间，测定了糖苷键的二面体Φ/Ψ扭转角。它们分别被定义为H1′-C1′-O-C3/C1′-O-C3-H3（Φ/Ψ。在蜜二糖涉及外环C6原子进行连接的情况下，二面体ω还监测了扭转角，定义为O-C6-C5-H5。此外，通过测量糖单位和关键氨基酸之间的显著距离，揭示了结合位点的碳水化合物取向。