Nkx2.2阻遏物复合物调节胰岛β细胞规格并防止β-至-α细胞重新编程

适当的胰岛细胞发育需要Nkx2.2 TN结构域

大多数内分泌细胞谱系的初级诱导需要Nkx2.2；单位：Nkx2.2^−/−胚胎中，ghrelin表达细胞的形成消耗了所有β细胞以及大多数α和PP细胞(Sussel等人，1998年). 确定Nkx2.2中观察到的受损胰岛结构和异常胰岛细胞比率^{TNmut/TNmut公司}成年小鼠是由胚胎发育期间出现的胰腺缺陷引起的，我们评估了Nkx2.2中内分泌细胞的形成^{TNmut/TNmut公司}胚胎。与Nkx2.2不同^−/−E9.5、Nkx2.2已经显示内分泌细胞分化表型的胚胎^{TNmut/TNmut公司}胚胎在E12.5时α和β细胞数量没有明显缺陷(图3A-C). 与细胞定量一致，在胰高血糖素或胰岛素Nkx2.2之间的基因表达^{TNmut/TNmut公司}胚胎及其野生型同胞(图3L). 然而，到了E13.5，在二次转变开始时，β细胞数量和胰岛素表达减少，相应的ɛ细胞数量和胃饥饿素表达式(图3L; 补充图1D–F、I、J）。在E15.5，在内分泌细胞分化的高峰期间，胰岛素分泌β细胞的数量仍然显著减少，相应地胰岛素(插入1和ins2（英寸2）)基因表达(图3D、E、H、L; 数据未显示）。β细胞数量的减少似乎不是由于凋亡，如胰岛素生成细胞群或胰腺其他部位caspase3表达缺失所示（补充图2A-D）。此外，ɛ-细胞数和胃饥饿素基因表达随着β细胞的丢失而增加，这表明与Nkx2.2相似^−/−等位基因，细胞是以牺牲β细胞群为代价形成的(图3F–H、L). 这些表型持续到妊娠末期(图3I–L).

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图3。

Nkx2.2个^{TNmut/TNmut公司}小鼠的胰岛素表达降低，胰高血糖素和ghrelin表达增加。(A–L)Nkx2.2中胰岛素、胰高血糖素和ghrelin表达细胞的特征^{TNmut/TNmut公司}小鼠(n个= 3–5). (一–C类,L（左）)E12.5时，激素阳性细胞的数量和表达没有改变。(D类–H（H）,L（左）)按E15.5，Nkx2.2^{TNmut/TNmut公司}小鼠的ɛ细胞数量增加，α细胞数量略有增加，β细胞数量减少。(I–L型)到E18.5，胰高血糖素数量显著增加，而胰岛素和ghrelin数量分别保持减少和增加。(*)P（P）< 0.05. 箭头表示胰高血糖素/胰岛素在E类和J.

令人惊讶的是，与Nkx2.2相比^−/−表型，α细胞数量和胰高血糖素Nkx2.2中的基因表达^{TNmut/TNmut公司}E18.5胰脏(图3I–L). α细胞的增加似乎不是由过度复制引起的，因为我们在α细胞群扩张之前或期间没有检测到增殖的胰高血糖素阳性细胞（补充图2E-H）。虽然α和ɛ单激素阳性细胞的数量增加，但这与胰高血糖素的增加无关⁺胃饥饿素⁺共存人群（未显示数据）。相反，尽管β细胞总数减少，但我们确实观察到胰岛素和胰高血糖素共存的细胞数量增加(图3E、J，插图）。在整个妊娠期，PP和生长抑素水平在Nkx2.2中保持不变^{TNmut/TNmut公司}胰腺，外分泌组织形态、腺泡细胞数量或外分泌酶基因表达无明显变化(图3L; 未示出的数据）。

Nkx2.2中胰岛细胞特异性转录因子的表达受到干扰^{TNmut/TNmut公司}胰腺

有趣的是，Nkx2.2^{TNmut/TNmut公司}表型与Nkx2.2中观察到的表型有很大不同^−/−胚胎。虽然不太严重的β细胞和β细胞表型可归因于TN结构域的突变，Nkx2.2功能比无效等位基因的降低更为温和，但由此导致的α细胞数量的增加更难解释。开始描述可能导致Nkx2.2的潜在分子变化^{TNmut/TNmut公司}内分泌细胞表型，当胰岛素和ghrelin细胞群发生明显变化时，我们在E14.5评估了几个胰腺发育标记物的表达。类似于Nkx2.2^−/−小鼠，表达Pdx1页E14.5不变，我们看到Ngn3号机组尽管内分泌祖细胞没有明显减少(图4A;Anderson等人，2009年; 数据未显示）。与Nkx2.2相比^−/−老鼠，新x6.1E14.5的表达没有显著下调(图4A).

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图4。

Nkx2.2 TN域突变导致阿尔克斯β细胞的错误表达和β-到-α细胞的重新编程。(一)E14.5时胰岛细胞特异性转录因子的表达(n个= 5). (B类)到E18.5，β细胞因子减少，而α细胞因子增加，反映了与这些细胞类型相关的变化(n个= 5). (C类)Nkx2.2个^{TNmut/TNmut公司}小鼠的阿尔克斯E15.5中的表达式，在胰高血糖素表达和α细胞数(n个= 5). (D类,E类)Arx数量增加⁺细胞和更多Arx⁺/胰高血糖素⁻Nkx2.2中的单元格^{TNmut/TNmut公司}E15.5时，当阿尔克斯首先观察到该表达式。(F–I型)在E15.5和持续妊娠期间，Arx在Nkx2.2的β细胞群中表达错误^{TNmut/TNmut公司}老鼠。(J,K（K）)使用β-细胞特异性Ins:Cre和Rosa26:番茄报告基因，在Nkx2.2中经常检测到β-细胞衍生胰高血糖素阳性细胞^{TNmut/TNmut公司}老鼠。(L（左）)β-细胞衍生α细胞表达Arx(n个= 3). (*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01. 箭头输入E类指示Arx⁺/胰高血糖素⁻细胞。箭头输入G公司,我、和K（K）表示共阳性细胞。箭头输入L（左）表示三阳性细胞。

到E18.5时，胰岛谱系特异性因子的表达改变与观察到的由TN结构域突变引起的胰岛细胞比率的变化完全一致。与β细胞数量减少一致，Pdx1页,神经元D、和美国金融管理局显著降低了E18.5(图4B). 或者，α-细胞标记物阿尔克斯和Irx2显著升高了E18.5，增加了阿尔克斯表达接近野生型水平的70倍(图4B).MafB公司表情没有出现变化；然而，这可能是由于以下事实MafB公司在胚胎发生期间在α和β细胞群中表达；损失MafB公司-β细胞的表达将通过增加MafB公司-表达α细胞。4周龄时，MafB在野生型和Nkx2.2的α细胞中表达^{TNmut/TNmut公司}小鼠（补充图3）。

有趣的是，尽管α和β细胞特异性基因表达水平的总体变化与Nkx2.2中观察到的α和β-细胞数量的变化很好地对应^{TNmut/TNmut公司}胚胎中，我们可以检测到α-细胞转录因子的表达增加了三到四倍阿尔克斯在E15.5时，胰高血糖素的数量显著增加之前⁺单元格(图4C). 确定增加的细胞来源阿尔克斯表达，我们进行免疫荧光分析以关联阿尔克斯不同胰腺人群的表达。在E15.5中，我们观察到在Nkx2.2中不同时表达胰高血糖素的Arx表达细胞数量大幅增加^{TNmut/TNmut公司}(图4D、E). 令人惊讶的是，在发育的同一阶段，我们开始观察到一些胰岛素分泌细胞在体外表达阿尔克斯(图4F、G). 到妊娠结束时，Nkx2.2^{TNmut/TNmut公司}胰腺含有Arx⁺，胰岛素⁺β细胞和Arx⁺，胰高血糖素⁺α细胞，而野生型窝鼠胰腺显示Arx和胰岛素的互斥表达。(图4H、I、L).

Nkx2.2 TN结构域的突变导致β-到-α-细胞转化，原因是阿尔克斯β细胞内

以前的研究表明阿尔克斯胚胎中的β细胞足以将β细胞转化为α细胞(Collombat等人，2007年). 因为我们观察到阿尔克斯表达式和Arx⁺在α-细胞数量显著增加之前，我们假设Nkx2.2 TN结构域的突变可能导致E15.5处的胰岛素分泌细胞的异常去表达阿尔克斯启动β细胞转分化为α细胞的基因。为了验证这个假设，我们生成了Nkx2.2^{TNmut/TNmut公司}携带Ins:Cre转基因的小鼠(埃雷拉2000)以及Rosa26:番茄或Rosa26:LacZ报告基因等位基因(索里亚诺1999;Madisen等人，2010年)让我们能够追踪突变的β细胞。而Rosa26报告基因的表达仅限于对照组中胰岛素表达人群Nkx2.2^+/+;Ins：Cre；Rosa26:LacZ/番茄岛(图4J; 补充图4A、B），我们检测到Rosa26：Nkx2.2中2%以上的胰高血糖素表达细胞中的番茄报告基因表达^{TNmut/TNmut公司};Ins：Cre；Rosa26:LacZ/出生后第0天的番茄胰岛（P0）(图4K、L; 补充图4C，J）。许多胰高血糖素和番茄双阳性细胞共表达Arx，这支持了以下观点阿尔克斯在缺乏功能性Nkx2.2的β-细胞衍生胰高血糖素表达人群中上调(图4L). 与β细胞在Nkx2.2中被重新编程为α细胞命运的发现一致^{TNmut/TNmut公司}在小鼠体内，可以检测到一些β细胞转录因子的表达，包括Pdx1、MafA和Nkx6.1，这些细胞正处于转化为表达胰高血糖素的α细胞的过程中（补充图4D-I）。Nkx2.2中胰岛素和胰高血糖素共表达人群^{TNmut/TNmut公司}胰腺也可能代表这种过渡人口(图3E、J). 应该注意的是，无法检测到番茄与ghrelin的共染色，这表明与α细胞谱系相比，观察到的ɛ细胞的增加并不是由于β细胞重新编程所致（补充图4K，L）。

自Nkx2.2以来^{TNmut/TNmut公司}幼崽出生时没有代谢表型，但随着年龄的增长，β细胞不断丢失，血糖越来越高，我们希望确定出生后的动物是否继续发生β-到-α细胞的转化。对于此分析，我们生成了Nkx2.2^{TNmut/TNmut公司}携带Pdx1:CreER转基因的小鼠(Gu等人，2002年)和Rosa26:番茄报告基因。为了避免可能与高血糖环境相关的结果，我们在显性高血糖发作之前用三苯氧胺诱导了3周龄小鼠（补充图1）。三苯氧胺诱导五天后，我们可以检测Nkx2.2中胰高血糖素生成α细胞中番茄报告基因的表达^{TNmut/TNmut公司}; Pdx1：CreER；Rosa26：番茄岛(n个=3），表明出生后β-至α-细胞重编程继续发生（补充图5A–D）。对照Nkx2.2中，胰高血糖素表达和番茄报告基因表达相互排斥^{TNmut公司/+}; Pdx1：CreER；Rosa26：番茄室友服用他莫昔芬。Nkx2.2个^{TNmut/TNmut公司}; Pdx1：CreER；Rosa26：如预期的那样，未接受他莫昔芬治疗的番茄胰岛缺乏番茄报告基因表达（补充图5E，F）。

Nkx2.2直接结合并抑制β细胞中甲基化的Arx启动子

鉴于阿尔克斯Nkx2.2中的表达式^{TNmut/TNmut公司}β细胞，Nkx2.2和Grg3之间相互作用的破坏可能干扰阿尔克斯β细胞中的启动子。确定是否阿尔克斯是Nkx2.2的直接靶点，我们对阿尔克斯用于识别转录起始位点上游～1.4 kb处高度保守的Nkx2.2结合位点的启动子（补充图6A；Hill等人2011). 胰岛细胞系中该区域的染色质免疫沉淀（ChIP）和Nkx2.2抗体表明，内源性Nkx2-2通常占据胰岛细胞的该区域阿尔克斯α和β细胞中的启动子，尽管βTC6细胞中的结合显著增强(图5A). 此外，Grg3和HDAC1优先被招募到阿尔克斯β细胞中的启动子，支持Nkx2.2可能招募Grg3来抑制阿尔克斯β细胞群中的表达。进一步分析阿尔克斯启动子揭示了保守的Nkx2.2结合位点周围存在CpG岛，如果甲基化，也可能有助于阿尔克斯抑制β细胞。相应地，Nkx2.2结合区的亚硫酸氢盐分析阿尔克斯启动子识别β与α细胞的差异甲基化模式；这个阿尔克斯启动子在β细胞中高度甲基化(图5B). 自从DNA甲基转移酶Dnmt3a被证明在发育过程中对建立甲基化模式很重要，并通过与转录因子的相互作用促进位点特异性甲基化(Hervuet等人，2009年)，我们研究了Dnmt3a是否也存在于阿尔克斯发起人。与Dnmt3a在细胞特异性调节阿尔克斯启动子甲基化，Dnmt3a占据阿尔克斯β细胞特异性启动子(图5A). 此外，联合免疫沉淀分析表明，标记的Dnmt3a可以与Nkx2.2形成蛋白质复合物，但不能与其他β细胞因子（如Pax4和Isl1）形成蛋白复合物(图5C). Grg3和HDAC1也是这个复合物的一部分，这表明Dnmt3a和Nkx2.2合作促进阻遏物复合物向阿尔克斯β细胞中的启动子。有趣的是，对于Nkx2.2和Dnmt3a之间的直接相互作用而言，Nkx2.2TN结构域似乎是不可或缺的（补充图6B），这表明这两个因素通过另一个Nkx2.2.结构域和/或通过复合体中的其他蛋白质相互作用。

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图5。

Nkx2.2直接抑制阿尔克斯βTC6细胞而非αTC1细胞。(一)Nkx2.2、Grg3、HDAC1和Dnmt3a在阿尔克斯βTC6细胞中的启动子(n个= 3). (B类)Nkx2.2结合区亚硫酸氢盐序列分析和量化阿尔克斯在分离的β和α细胞中的位点（−1660到−1463碱基对[bp]和−1374到−1162）。(C类)利用Flag-Dnmt3a构建物转染的Min6细胞上的Flag标记抗体进行免疫沉淀，并利用Flag标签、Nkx2.2、Grg3、HDAC1、Pax4和Isl1抗体进行Western blotting，以协同免疫沉淀分析Dnmt3a与Nkx2。(D类)Nkx2.2诱导2.5 kb区域的阿尔克斯启动子与αTC1细胞中的荧光素酶融合。Nkx2.2抑制阿尔克斯βTC6细胞启动子活性3.5倍(n个= 4). (E类)3个月龄婴儿典型胰腺切片的免疫染色Dnmt3a型^{飞行/飞行}（对照）和Ins:Cre：Dnmt3a型^{飞行/飞行}胰岛素和胰高血糖素的室友。(F类)3个月大的代表性胰腺切片保险公司：Cre:Dnmt3a型^{飞行/飞行}:Rosa26:LacZ公司动物胰高血糖素免疫染色左边面板和具有β-半乳糖苷酶活性（LacZ）的胰高血糖素覆盖层正确的面板。这个插入标记一个放大的代表区域，显示一些LacZ和胰高血糖素双标记细胞（白色箭头）。(***)P（P）<0.001与αTC；(#)P（P）< 0.05; (###)P（P）<0.001与IgG一. (**)P（P）<0.01与β细胞B类. (***)P（P）<0.001与阿尔克斯启动子D类.

为了研究Nkx2.2是否特异性抑制阿尔克斯在β细胞启动子中，我们亚克隆了阿尔克斯位于转录起始位点上游的启动子进入pGL3碱性无启动子荧光素酶报告载体。pGL3的共转染-阿尔克斯和Nkx2.2个转化为αTC1细胞系导致显著诱导阿尔克斯转录活性，而pGL3的共转染-阿尔克斯和Nkx2.2个βTC6细胞系诱导65%的转录抑制(图5D). 这些数据表明Nkx2.2抑制阿尔克斯β细胞通过与Dnmt3a和Grg3的相互作用以及HDAC1优先招募到阿尔克斯β细胞中的启动子。这些发现与体内结果一致，表明Nkx2.2 TN结构域对于Grg3的募集和维持对Grg3表达的抑制至关重要阿尔克斯在β细胞群中。

Dnmt3a的β-细胞特异性缺失也会导致β-到-α-细胞转化

鉴于Dnmt3a在阿尔克斯β细胞中的启动子及其在Nkx2.2、Grg3和HDAC1阻遏复合物中的存在，我们希望确定Dnmt3a是否对适当的胰岛细胞类型维持至关重要，类似于Nkx2.2。有趣的是，Dnmt3a（Ins:Cre；Dnmt3 a）β细胞特异性缺失的小鼠^{飞行/飞行})现象复制Nkx2.2^TNmut/TNmut老鼠；α细胞增加，β细胞相应减少(图5E). 此外，Ins:Cre中的遗传谱系追踪；Dnmt3a型^{飞行/飞行};Rosa26:LacZ小鼠证明了与Dnmt3a型导致β-到-α-细胞转分化，类似于Nkx2.2^{TNmut/TNmut公司}小鼠(图5F).

动物保养

所有小鼠均在瑞士黑（Taconic）背景下饲养，并根据哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会的批准协议进行饲养和治疗。Nkx2.2的基因分型^TNmut公司使用Nkx2.2等位基因特异性引物（如上所述）对小鼠和胚胎进行检测。Arx基因分型^{flox/flox公司}小鼠、Ins:Cre小鼠、Rosa26:Tomato小鼠、Rosa 26:LacZ小鼠和Pdx:CreER小鼠按前述方法进行(埃雷拉2000;Gu等人，2002年;Marsh等人，2009年;Madisen等人，2010年).

免疫组织化学

组织在4%PFA中固定4小时或过夜，在冷PBS中清洗，在30%蔗糖中培养，并冷冻保存。在7μM切片上进行免疫荧光。使用的抗体列表见补充表1。荧光图像是通过尼康Eclipse 80i显微镜、Q图像相机和ImagePro软件（媒体控制论）获得的。使用Zeiss LSM 510立式相机（针孔=1）拍摄共聚焦图像。为了量化目的，在整个胰腺的每四个部分（E12.5和eE13.5）和每八个部分（EI5.5）手动计数野生型的染色细胞(n个=3）和突变(n个= 3). 对于E18.5的动物，每八个切片计数一次的染色细胞数除以胰腺总面积。所有值均表示为平均值±SEM。使用双尾学生的未配对进行统计分析t吨-测试。当P（P）< 0.05.

RNA分析

从各个胚胎年龄（RNeasy，Qiagen）的整个胰腺组织中分离出总RNA，并使用SuperScript III试剂盒（Invitrogen）和随机六聚体引物制备cDNA。使用200 ng cDNA、PCR主混合（Eurogentec）和TaqMan探针（ABI按需检测）进行定量PCR。使用的引物清单见补充表2。所有基因均归一化为亲环素B，并用ABI棱镜软件进行定量。安n个所有小鼠种群均≥4。所有值均表示为平均值±SEM。使用双尾学生的未配对进行统计分析t吨-测试。当P（P）< 0.05.

炸薯条

α-TC1和β-TC6细胞在15厘米的培养皿中生长至~80%的融合度，并根据ChIP IT Express试剂盒（Active Motif）进行甲醛交联。使用Diagnode BioRupter（8分钟至30秒开/关）通过超声波破碎交叉连接的染色质。将三微克小鼠α-Nkx2.2（发育研究杂交瘤库[DSHB]）、兔子α-TLE3（圣克鲁斯生物技术）、家兔α-HDAC1（圣克鲁兹生物技术），兔子α-Nkx6.1（β细胞生物联合会）或小鼠α-IgG（AbCam）添加到剪切后的染色质中。让抗体/染色质复合物在4°C下首尾旋转过夜。使用ChIP-grade蛋白G磁珠（细胞信号）拉下抗体/染色质复合物。对染色质进行洗涤、洗脱和反向交联，然后进行蛋白酶处理。然后使用SYBR绿色荧光和以下引物对染色质片段进行定量PCR分析：Arx（FWD）、TCCTCCACCATTGAGGGTA；和（修订版），GCAACTTGAGGGGTACAGA。所有值均表示为平均值±SEM。使用双尾学生的未配对进行统计分析t吨-测试。当P（P）< 0.05.

免疫共沉淀和Western

使用核复合物Co-IP试剂盒（Active Motif）对P0小鼠幼鼠的切除胰腺进行核提取。核提取物来自五只野生型或五只突变动物。在4°C下，将一个五微克的核提取物和5μg的兔抗TLE3（Santa Cruz Biotechnologies）、兔α-Dnmt3a（Santa Cruz Bintechnologics）、小鼠α-Nkx2.2（DSHB）或兔抗IgG（Chemicon）在4℃下培养过夜，并端对端旋转。使用蛋白G DynaBeads（Invitrogen）拉下蛋白质/抗体复合物。清洗、洗脱蛋白质/抗体复合物，并在NuPAGE Novex 10%Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上运行。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上（GE Healthcare），并使用小鼠抗Nkx2或兔α-Dnmt3a进行探测。为了进行免疫沉淀控制，对膜进行剥离、清洗，并用用于初始免疫沉淀的抗体进行重制。

荧光素酶分析

要生成阿尔克斯-荧光素酶报告子，一个2.5kb的片段阿尔克斯用以下引物从小鼠尾部基因组DNA中PCR扩增转录起始位点上游的基因组区域：oRS18（FWD），ACGCGTTGCACCTCTCTTACAGTGTGTATAA；和第19版（修订版），AGATCTGGGCTCAGAGAGCGGACCT。将MluI和BglII位点分别并入5′端和3′端，以便于使用MluI与BglII克隆位点克隆到pGL3碱性无启动子荧光素酶报告载体中。所得质粒通过DNA测序进行验证。如前所述，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）对αTC1和βTC6细胞系进行荧光素素酶分析(Hill等人，2010年).

他莫昔芬治疗Pdx:CreER；R26R：番茄小鼠

Pdx:CreER通过每48小时向3周龄小鼠腹腔注射5毫克他莫昔芬（Sigma）诱导，持续4天。第五天，如上文所述，采集胰腺并固定在多聚甲醛中，并对指示激素进行免疫染色。

我们感谢Catherine Lee May（CHOP）和Jeffrey Golden（CHOP阿尔克斯-floxed小鼠和Kanako Miyabayashi（日本福冈九州大学）用于提供Arx抗体。我们感谢Jonathon Hill在阿尔克斯发起人。我们感谢Lori Zeltser博士和Stephanie Padilla博士对原稿的批判性阅读，感谢Kathy D.Shelton女士组装基因靶向载体，感谢Vanderbilt转基因/ES细胞共享资源的工作人员对胚泡微注射实验的专业表现。这项工作得到了NIH拨款DK0272504（给L.S.）、DK082590（给L.S和J.P.）、丹麦042502（给M.A.M.）、乌克兰072473（给M.M.）和丹麦068763（给A.B.）的支持。哥伦比亚大学DERC（P30 DK63608）和CTSA赠款提供了额外支持。