小鼠衰老的代谢足迹

摘要

衰老（最终死亡）是生命中不可避免的一部分，伴随着各种生理和心理疾病，包括常见的代谢、炎症、心血管和神经退行性疾病，这些疾病会缩短健康寿命。这类疾病的例子包括帕金森氏病和阿尔茨海默氏病，以及从心脏代谢的角度来看，肥胖、2型糖尿病和动脉粥样硬化。尽管这些临床表现众所周知，但导致衰老过程的复杂生物分子网络才刚刚开始被发现¹有人建议几种常见的过程会导致或至少有助于衰老，包括DNA损伤、活性氧（ROS）积累和一般代谢功能障碍。到目前为止，这些大多被视为独立事件，但证据表明其中一些通路是相互关联的，正如最近DNA损伤和代谢控制之间的联系所强调的那样^2,三.

无论其机制如何，衰老相关疾病的一个共同特征是代谢系统的参与，尤其是线粒体的参与^1,4,5,6与衰老有关的最具特征的代谢途径是胰岛素/IGF1信号途径⁷。两个秀丽线虫和D.黑腹果蝇胰岛素受体突变体显示寿命延长，其作用是通过FOXO1转录因子、热休克因子HSF1和SKN1介导的⁵). 胰岛素/IGF1途径在哺乳动物寿命调节中的参与尚存在争议，但似乎有可能⁷第二条长寿途径以哺乳动物雷帕霉素（mTOR）为靶点，该靶点将胰岛素信号与其他营养物质（最显著的是氨基酸）的传感结合在一起，从而调节蛋白质翻译和自噬^8,9与此一致，mTOR被证明参与了与老化相关的酮体生成减少¹⁰通过服用雷帕霉素抑制mTOR可延长小鼠寿命¹¹与这些营养过剩系统相对的是营养限制途径，如sirtuin和AMP-activated protein kinase（AMPK）途径^12,13被能量应激激活，例如在长时间禁食或运动后，它们抑制能量需求过程，有利于能量生产¹⁴sirtuins和AMPK都被认为是低等生物体寿命的积极调节因子（在¹)但对于胰岛素/IGF1途径，需要证实其与哺乳动物寿命的相关性。在秀丽线虫，AMPK被证明直接磷酸化CREB调节的转录辅激活子-1，然后它就无法辅激活CREB转录因子以缩短寿命¹⁵这表明哺乳动物中可能存在一种衰老途径。此外，在鼠标中，AMPK已与SIRT1连接^16,17和PGC-1α信号^17,18巩固该系统与线粒体代谢的联系，尤其是线粒体呼吸。然而，由于抑制和刺激线粒体代谢似乎都能延长寿命，线粒体功能如何影响衰老仍存在争议（在^1,5). 最有可能的是，生理环境和操作本身的性质可能决定衰老反应。这种表型似乎至少部分由线粒体未折叠蛋白反应介导，并以细胞非自主方式作用，涉及一种尚未确定的“有丝分裂因子”¹⁹.

一些研究报告了衰老的分子效应，例如在生物化学²⁰，基因组²¹，或代谢组学水平²²然而，这些研究的局限性在于这些不同数据集的多级集成问题。因此，我们的目的是获得一个无偏见的图谱，并了解衰老期间的代谢下降，这容易导致哺乳动物发生与衰老相关的疾病。我们对野生型C57BL/6J小鼠（代谢研究中最常用的菌株）衰老的临床、分子和代谢组学方面进行了表征。这使我们能够通过识别代谢物集和分子变化来定义衰老的一致表型，这些代谢物和分子变化可以用作健康跨度生物标记物，从而构成衰老的详细代谢足迹。

结果

代谢特征和身体性能

为了描述哺乳动物衰老过程中的代谢变化，我们使用了3个月龄（“年轻”）和22个月龄的C57BL/6J小鼠。我们通过广泛的临床表型研究验证了我们的衰老模型。正如预期的那样，老龄小鼠出现了生理衰退的迹象。老年小鼠明显比年轻小鼠重(图1A)主要是因为脂肪量增加(图1B). 此外，老年小鼠出现离散性葡萄糖不耐受，这可能反映了胰岛素抵抗的发展(补充图S1在线）。在间接量热法中，当校正了瘦体重后，老年小鼠的能量消耗有减少的趋势(图1C)或与多元回归相比(第页=0.128），部分原因可能是体力活动减少(补充图S1在线）。老年小鼠的呼吸交换比（RER）低于年轻小鼠，表明老龄小鼠对脂肪有一定比例的底物偏好(图1C). 当接受体育锻炼时，最大VO₂显著减少(图1D)

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图1

衰老小鼠的临床和分子表型。

（A） 体重。（B） 身体成分。（C） 间接量热法显示耗氧量（VO₂)以及24小时记录期间的呼吸交换比（RER）。（D） 基本和最大VO₂在代谢跑步机上。（E） 20小时自愿运动记录。（F） 年轻和老年小鼠在腓肠肌中的基因表达（G）柠檬酸合成酶（CS）的酶活性，以及腓肠肌氧化磷酸化复合物I和复合物IV。（H） 腓肠肌相关代谢信号通路的Western blot分析。pAMPKα代表AMPK的α亚单位的磷酸化/活化；免疫沉淀IRS1检测其对丝氨酸残基（p-Ser）的磷酸化作用；p-S6K1反映S6K1磷酸化/活化。Tubulin用作加载控制。数值表示为平均值±SEM；n=6–10(图1A，n＝20）。*第页≤0.05; **第页≤0.01; ***第页≤0.001.

在一次家庭式监测中证实，在间接热量测定期间，老年小鼠的体力活动减少，在此期间，小鼠可以自由使用轮子(图1E). 老老鼠在最初的发现阶段和后来的夜间阶段跑得更少。在方形开放场地试验中也观察到了老年小鼠的这种低动力表型，该试验表明老年小鼠不如年轻小鼠敏捷(补充图S1在线）。猫道分析（用于确定小鼠的步态障碍）表明，在迈出下一步之前，单爪站立的时间会随着年龄的增长而显著增加(补充图S1在线）。

血液中的代谢紊乱

为了进一步表征衰老时的代谢变化，我们对血浆进行了临床化学分析。血浆标志物发生了各种变化，如游离脂肪酸增加和甘油三酯水平降低(图2A，C). 为了扩大我们对衰老小鼠血液代谢物的表征，并确定可能的新型衰老生物标记物，我们采取了一种针对性较低的方法，并在年轻和老年小鼠的血液中生成了广泛的代谢组学图谱。测量了75种以上的分析物，包括红细胞脂肪酸和血浆酰肉碱、氨基酸和酮体的特征，并对这些数据进行了聚类，以确定在衰老过程中反应相似的代谢物组(图2B-C). 利用代谢物的这一图谱，根据年龄将小鼠分离出来，几个有趣的代谢物簇变得明显。其中一个簇含有长链和中链酰基肉碱。这些代谢产物是FAO的中间产物，在老年小鼠中减少(图2C). 红细胞脂肪酸谱反映了脂肪酸稳态的长期变化，通常用于诊断多不饱和脂肪酸（PUFA）缺乏症。对于饱和脂肪酸，C16略有下降，而细长的C18和C20有所增加。此外，PUFA生物合成的各种中间体和产物如C20:4ω6增加，而底物C18:2ω6和C18:3ω3减少。PUFAs和血浆白蛋白的总体水平没有降低，这两种物质都与ROS的保护有关(图2B).

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图2

血浆生物化学和靶向代谢组学。

（A） 血浆临床生物化学的双向分层聚类。（B） 目标代谢组学数据的双向分层聚类。FA描述的代谢物是红细胞脂肪酸，而AC表示血浆中的酰肉碱。（C） 选定代谢物的血浆水平。数值表示为方框图和胡须图；n=10；*第页≤0.05; **第页≤0.01; ***第页≤0.001.

除了脂肪代谢外，氨基酸代谢在衰老过程中也会发生显著变化。之前的研究表明，补充支链氨基酸（BCAAs）²³或饮食中蛋氨酸含量的改变^24,25影响寿命。我们对血浆氨基酸的表征表明，随着年龄的增长，脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸和蛋氨酸的水平明显降低，但BCAA的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸水平没有降低(图2B-C). 类似地，先前已经表明mTOR途径抑制生酮，并且生酮能力随着年龄的增长而降低¹⁰。与生酮减少一致，我们的分析发现，反映总酮体水平的β-羟基丁酸（BHBA）水平往往随着年龄的增长而下降(图2C).

新的衰老生物标志物

年轻和年老小鼠的血浆代谢物水平的明显差异使我们测试了这些是否可以可靠地区分两组，这是开发生物标记物的先决条件。

选择样本分类的相关变量是高维数据集（如代谢组学和基因表达研究）的一项常见任务，在这些数据集中，人们试图确定仍能实现良好预测性能的尽可能小的代谢物或基因集（即生物标记物）。随机森林（RF）是这样一种学习算法，它可以通过估计每个变量对类的重要性来实现这一点。RF分析使用随机的小鼠训练集和随机选择的少量代谢物生成许多分类树。被排除在树外的老鼠被用来估计分类错误，提供内部交叉验证。因此，“平均下降准确度”表示某种代谢物对两个测试组的分离有多大贡献，而总体“预测准确度”表示一组代谢物组合可以分离组的准确度。血液靶向代谢组学数据的RF分析定义了一组10种代谢物，这些代谢物构成了衰老的最佳预测因子，具有100%的预测准确性(图3A). 特别是，红细胞亚油酸（C18:2ω6）降低和血浆C16-酰基肉碱降低是强有力的预测因素(图3B).

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图3

靶向代谢组学和微阵列的代谢产物和途径富集。

（A） 为了将衰老状态与血液代谢物表达数据联系起来，我们使用了随机森林预测因子。根据代谢物对衰老状态的预测重要性，使用随机森林重要性度量对代谢物进行排序。我们发现，10种最重要的代谢物具有100%的明显预测准确性。（B） 监督层次聚类图，用于可视化RF预测因子的表达（z-score标准化）。RF图和监督层次聚类图表明，15种最重要的代谢物根据其老化状态对样品进行分层。FA描述的代谢物是红细胞脂肪酸，而AC表示血浆中的酰肉碱。色码描述了相应代谢物所属的途径。

在我们的血液代谢物分析和微阵列数据中出现这些明确的代谢变化后，我们还使用全球代谢组学绘制了年轻和老年小鼠肝脏和股四头肌的代谢变化图。我们在肝脏和肌肉中分别检测到473和263种代谢物，其中94种和65种在各组之间发生了显著变化（参见补充表S1和S2在线查看相对代谢物水平）。我们再次进行RF分析，对这些代谢变化进行分类(图4——5). 在肝脏中，代谢物的变化可以93%准确预测年龄组(图4A)前25种代谢物的层次聚类证实了这两个年龄组的分离(图4B). RF分析旨在从高维代谢组学数据中确定单个代谢物的相对贡献，随后我们进行了代谢物集富集分析（MSEA）²⁶确定哪些途径受到影响。在肝脏中，预测年龄的最佳代谢物是葡萄糖代谢、磷脂代谢和氧化还原稳态(图4C). 此外，我们进行了代谢组视图分析，以证明代谢产物“中枢”节点是否受到影响，这可能比“死端”代谢产物节点具有更多的生物学后果，从而证实主要是碳水化合物和甘油脂质代谢以及氧化还原平衡受到干扰(图4C). 例如，在氧化还原稳态方面，老年小鼠的各种代谢物发生了变化，尤其是代谢物中心还原型谷胱甘肽(补充图S2在线）。

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图4

通过全球代谢组学在肝脏中进行老化生物标志物识别和途径分析。

为了将衰老状态与肝代谢产物表达数据联系起来，我们使用了随机森林预测因子（A）。代谢产物根据年龄对组分离的重要性进行排名。我们发现，25个也是最重要的问题导致93%的明显预测准确率。彩色符号用于指示代谢物发挥作用的途径。监督层次聚类图（B），用于可视化RF预测因子的表达（z评分标准化）。RF图和监督层次聚类图表明，25种最重要的代谢物根据其老化状态对样品进行分层。（C） 代谢物集富集分析（MSEA）的汇总图（左面板），其中代谢物集合根据Holm p值进行排序，阴影线显示Holm p的截止值。代谢组视图（右侧面板）反映了根据中间中心性度量，x轴增加的代谢途径影响，这反映了代谢途径中的关键节点随着年龄的增长而发生了显著变化。

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图5

通过肌肉中的全球代谢组学进行衰老生物标志物识别和途径分析。

为了将衰老状态与肌肉代谢产物表达数据联系起来，我们使用了随机森林预测因子（A）。代谢物根据其对按年龄分组的重要性进行排名。我们发现，这25个也是最重要的问题导致了100%的明显预测准确率。彩色符号用于指示代谢物发挥作用的途径。监督层次聚类图（B），用于可视化RF预测因子的表达（z评分标准化）。RF图和监督层次聚类图表明，25种最重要的代谢物根据其老化状态对样品进行分层。（C） 代谢产物集富集分析（MSEA）（左面板）和代谢组视图（右面板）的汇总图，如图4C.

在肌肉中，前25位主要是脂肪酸代谢物(图5A)前20名已经显示出100%的预测准确率和明确的分组分离(图5B). MSEA和代谢组观点证实了脂肪酸代谢的参与，但也强调了葡萄糖代谢的强大贡献，多不饱和脂肪酸的代谢亚麻酸和亚油酸是肌肉年龄的最佳预测因子(图5A,补充图S3在线）。这些代谢物是多不饱和脂肪酸代谢的中枢，因此对预测能力有很大影响(补充图S3在线）。

讨论

老龄化及其相关疾病是社会的沉重负担。目前预期寿命的增加不仅影响到我们的社会系统，而且还伴随着常见慢性病的出现，包括神经系统、免疫系统和心血管系统的疾病，这些疾病往往达到流行病的程度。在这方面，重要的是要了解自然衰老过程，并阐明生活方式和/或药物干预可能产生的影响。近年来，人们提出了许多新的治疗方案来预防与衰老相关的疾病。尽管其中一些药物干预被证明可以延长寿命，即使是在哺乳动物中^11,27由于尚未确定老化生物标记物，因此没有很好的数据显示健康寿命的改善。

在这里，我们描述了年轻和老年小鼠的临床以及分子、生化和代谢组的变化，从而定义了衰老的一致表型。除了血液和血浆中的代谢组学外，我们还采用了一种无偏见的方法来确定肌肉和肝脏中的代谢变化。我们使用C57BL/6J小鼠，因为这些小鼠特别适合研究代谢疾病^28,29我们意识到，我们的研究可能会因伴随衰老的身体成分变化而产生偏差，但这一现象是所有物种衰老所固有的。虽然可以认为，没有脂肪量或葡萄糖稳态变化的衰老模型是最佳的，但这种模型并不存在，因为生理衰退是衰老的标志。

我们制作的自然衰老小鼠变化纲要强调了各种各样的分子和代谢变化。我们的数据表明线粒体功能受损的严重参与。我们不仅观察到与线粒体功能有关的各种转录物的表达显著下降，例如氧化磷酸化、FAO、凋亡，而且我们还测量了酶活性的变化，如4-HNE水平升高所证明的那样，可能最终导致氧化损伤的积累。这与我们在肝脏和肌肉代谢组学分析中确定氧化还原稳态及其中枢谷胱甘肽为受影响的途径相一致，表明活性氧物种在衰老表型的启动或进展中发挥作用。有趣的是，不同组织中基因表达和氧化磷酸化活性的降低似乎被线粒体生物发生和/或活性的补偿性增加所抵消，因为肌肉中的CS和BAT中的mtDNA丰度在老年小鼠中增加。

从信号传导的角度来看，胰岛素和mTOR途径受到了影响。IRS-1丝氨酸磷酸化增加与胰岛素抵抗有关³⁰，这也是我们研究中观察到的衰老迹象(补充图S1在线）。IRS-1丝氨酸磷酸化阻碍其与胰岛素受体的适当结合，因此胰岛素促进IRS-1酪氨酸磷酸化并激活Akt和PI3-激酶及其下游通路的能力^31,32,33与此一致，老年小鼠组织中S6K1磷酸化降低。S6K1磷酸化依赖于mTOR，mTOR由营养素和PI3-激酶协同激活³⁴因此，IRS-1的丝氨酸磷酸化为mTOR信号传导减少提供了一个合理的解释。几种激酶可以诱导IRS-1丝氨酸磷酸化，包括JNK³⁵、IKK³⁶以及新型PKC^36,37随着年龄增长，JNK和IKK的激活与慢性氧化和炎症应激有关。新的PKC，如PKC-θ，被二酰基甘油激活，当血清游离脂肪酸增加和线粒体功能缺陷时，二酰基丙三醇会积累，这两种情况都会随着年龄增长而再次出现。与之前的观察结果一致^38,39，反映AMPK活化的基础AMPK磷酸化没有随着年龄的增长而改变，这表明在衰老组织中观察到的线粒体功能缺陷不会影响基础状态下ATP的生成。

我们研究的主要目标之一是识别新的衰老生物标志物。因此，我们进行了广泛的血液和血浆代谢组学研究，主要关注营养途径。在这种方法中，我们发现氨基酸和脂肪酸代谢物水平的显著变化可以准确预测衰老。除了血液代谢组学之外，我们还采用了一种无偏见的方法来确定衰老组织中的代谢变化。在肌肉和肝脏中，我们确定了在衰老时发生变化的代谢组，包括脂肪酸和葡萄糖代谢。

我们发现葡萄糖和糖酵解和糖原代谢的中间产物，如麦芽糖和麦芽四糖，是肝脏和肌肉衰老的生物标志物(图4——5,​，6A）。6A级). 在肝脏和肌肉中，糖原中间产物的积累表明老年小鼠的糖原代谢发生了改变，而乳酸增加和糖酵解中间产物减少则表明厌氧糖酵分解升高。在肌肉中，葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸和麦芽糖水平的升高也表明葡萄糖和糖原代谢发生了变化(图6A). 事实上，肌肉麦芽糖水平的增加与糖原分解的增加相一致。重要的是，这些代谢物数据与临床上的糖耐量受损和信号转导增加的IRS-1丝氨酸磷酸化数据相匹配。最近对糖尿病患者血液样本的代谢组学调查也发现麦芽糖水平升高⁴⁰，再次支持我们发现的一些代谢变化与阿吉格相关的胰岛素抵抗有关。

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图6

衰老相关的糖和脂肪代谢变化模型。

（A） 综述肌肉和肝脏中葡萄糖代谢的生化途径。年轻人和老年人之间变化的代谢物用粗体表示；肌肉和肝脏的代表性代谢物数据分别显示在左边缘和右边缘。总之，糖原中间产物麦芽糖和麦芽四糖的积累表明老年小鼠的肝糖原分解增加。另一方面，乳酸的增加和糖酵解中间产物的减少表明糖酵分解作用增强。肌肉中葡萄糖和葡萄糖-磷酸盐的升高，再加上乳酸水平的不变，表明肌肉中的葡萄糖处置减少，无论是通过分解还是糖原合成。事实上，肌肉麦芽糖水平的增加与糖原分解的增加是一致的。（B） 脂肪代谢的示意图，显示有代表性的变化。老年小鼠的血浆甘油三酯降低，而游离脂肪酸增加，表明组织中甘油三酸酯沉积增加，脂肪酸释放增强和/或分解减少。脂肪酸在肌肉中的积累、酰基肉碱向血浆中泄漏的减少（虚线）和酮生成减少支持了FAO的减少。肌肉中Cpt1b表达降低可能是导致FAO降低的原因之一，这也解释了血浆中乙酰肉碱水平降低的原因。老年小鼠的RER较低，表明其相对依赖脂肪氧化，这表明葡萄糖氧化也受到阻碍，脂肪代谢仍然是ATP生成的主要来源。数值表示为平均值±SEM或盒须图。*第页≤0.05**第页≤0.01; ***第页≤0.001.

在老年小鼠中明显受到影响的第二条途径是脂肪酸代谢(图6B). 我们不仅观察到FAO相关基因的基因表达减少(Cpt1b型肌肉，阿卡德姆在肝脏，阿卡德尔BAT中），但来自该途径的代谢物也受到干扰。我们发现老年小鼠血浆游离脂肪酸增加，而血浆中链和长链酰肉碱降低。相反，众所周知，在禁食期间，血浆中的游离脂肪酸以及中长链酰基肉碱都会增加，这反映了FAO流量的增加⁴¹因此，我们的数据与线粒体FAO途径的进入和流量减少相吻合^42,43，导致FA水平增加，同时减少了酰基肉碱“泄漏”回血浆室（中的虚线图6B). 值得注意的是，在老年人中，几种脂肪酸在血浆中也更丰富²²，尽管没有关于酰基肉碱的信息。我们的假设也与肌肉中脂肪酸的积累和Cpt1b型肌肉中的表达，表明线粒体膜上的肉碱酯化减少，从而减少了FAO进入线粒体的次数。这似乎与老年小鼠的RER降低这一事实相矛盾，这表明能量生成对脂肪的依赖性增加。然而，间接量热法测量全身代谢，反映所有代谢途径（如葡萄糖和脂肪氧化）和所有器官（如肝脏、肌肉等）中导致能量消耗的相对变化的组合。虽然我们不能排除FAO中组织特异性差异，但我们的数据表明脂肪代谢仍然是ATP生成的主要来源。

我们确定了各种组织中衰老的分子和生化特征，具有很高的预测准确性。我们的各种方法之间对这些途径的交叉验证——例如血液和组织代谢组学中的FAO代谢物，以及基因表达中的FAA基因——加强了它们作为生物标记物的潜在价值。然而，对于生物标记物的鉴定，我们建议分析血浆中的代谢物水平，因为它很容易获得，而无需牺牲动物或对人类具有太大的侵袭性。如上所述，血浆游离脂肪酸和酰基肉碱水平的变化对年轻和老年小鼠的分离具有很高的预测价值，并可能证明是衰老和健康寿命的一个强有力的候选生物标志物。值得注意的是，多不饱和脂肪酸的生物合成途径在老年肌肉中受到强烈影响，但在红细胞膜中也发现了类似的变化，再次证明了血液和血浆作为生物标记物来源的价值。此外，所选血浆氨基酸的测量增加了预测值。重要的是，最近证实了氨基酸作为生物标记物的相关性，因为包括BCAA在内的几种氨基酸的组合与胰岛素抵抗有关⁴⁴并预测未来糖尿病⁴⁵。我们在衰老的肝脏和肌肉中发现了BCAA代谢产物的一些变化，但在血浆中没有，这使得它们不太适合作为衰老的生物标志物。

尽管从临床角度来看可能不太实用，但一些额外的途径被证明对监测衰老过程和通过预防和治疗策略来延缓衰老和/或衰老相关病理是有用的，因为它们被证明同样可以预测衰老。这些包括增加组织氧化损伤和多不饱和脂肪酸中间产物的积累，特别是在肌肉中。此外，一组选定基因的mRNA表达(考克斯IV和Tfam公司)在所有受试组织中发生变化，可以预测衰老。与这些在大多数分析组织中发生变化的生物标记物相比，一些变化表明特定组织中存在老化，例如BAT中线粒体基因表达和mtDNA含量的增加，可能使该组织更好地适应老化的代谢挑战。

总之，我们的数据提供了一个控制良好的哺乳动物系统中代谢衰老的足迹。我们通过综合方法确定的途径也开辟了一条新的研究途径，旨在确定这些分子和代谢组系统对衰老过程的个人贡献。虽然其中一些通路已经被研究与衰老有关，但还需要进一步研究以充分确定其相关性，也包括在人类中。未来的研究还必须解决生理挑战，如禁食/喂养、运动或老年小鼠的高脂肪喂养对这些生物标记物的影响。此外，我们希望这些老化生物标志物的识别可以刺激合理设计策略，以防止或扭转某些受影响网络的衰退，从而延长健康寿命并防止加速老化。

方法

作者贡献

RHH和JA在CA、SMH、CC和KS的投入下构思和设计了该项目。RH、CA、SMH、CC、EHJ和PAA进行了实验。CT和RD计划并监督小鼠实验。RHH、CA、SMH和JA撰写了这份手稿，所有作者都提供了稿件。

补充材料

致谢

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