BDNF在轴突发育中的自我放大自分泌作用

cAMP介导BDNF诱导的BDNF分泌。

为了直接监测发育中神经元分泌BDNF的过程，我们在电镀后6小时转染培养的海马神经元，转染的BDNF编码结构与pH-敏感型EGFP[BDNF-pHfluorin(22);SI材料和方法]并通过外周血分泌到细胞外间隙时BDNF-pH荧光增强来监测BDNF-pHfluorin的分泌(23). 浴液中添加forskolin（20μM），通过激活腺苷酸环化酶或膜透性cAMP类似物Sp-cAMPS（50μM）升高cAMP，导致未极化神经元大多数轴突周围的BDNF-pH荧光增强（2期）(1)14-24小时培养(图2A1类和地下一层)，与先前在垂体腺瘤细胞系中使用ELISA的研究一致(24). 相反，极化神经元的相同治疗（第3阶段）(1)在2-d培养中，BDNF-pH荧光沿着轴突而非树突增加，在远端轴突中积累最多(图2A2级和地下二层). 这种增加的荧光是由于分泌的BDNF-pHfluorin粘附在细胞表面或培养基上，因为它被浸在膜上的非透明荧光猝灭剂溴酚蓝完全消除了(图S1) (25). 此外，当KT5270存在于培养基中时，forskolin诱导的荧光增强不存在，表明这种分泌是由PKA介导的。因此，轴突/树突分化伴随着cAMP/PKA敏感的BDNF分泌向轴突的再分配。

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图2。

通过升高cAMP或应用BDNF触发BDNF-pH氟的分泌。(一个)第2阶段的荧光图像（无偏振，A1类)和阶段3（极化，A2级)暴露于Sp-cAMPS或forskolin前后不同时间表达pH-敏感融合蛋白BDNF-pHfluorin的海马神经元。插图：神经节或轴突/树突尖端，其中测量了pHfluorin荧光，并按照左图所示的比例以假彩色线性编码。(B类)在没有或存在KT7250的情况下，用forskolin和Sp-cAMPS治疗2期和3期神经元前后的相对pHfluorin荧光强度的平均迹线，其强度由治疗前最后3分钟的平均强度标准化。n、 测量的神经元数量。(C类和D类)类似于一个和B类除使用重组BDNF（50 ng/mL）外。

先前的ELISA检测表明，神经营养素可以通过调节分泌途径诱导神经营养素释放(26,27). 在这项研究中，我们还对海马细胞培养上清液进行了ELISA，发现在浴中添加forskolin、Sp-cAMPS或高钾可显著提高BDNF的分泌⁺KT5720涂层废除了该标高(图S2). 此外，我们检测了表达BDNF-pHfluorin的单个发育中海马神经元中BDNF诱导的BDNF分泌的地形图。与Sp-cAMPS和forskolin的观察结果类似，浴浸BDNF（50 ng/mL）增加了与第2期神经元所有轴突相关的BDNF-pH荧光(图2C1类和第1页)但只有3级神经元的轴突(图2指挥与控制和D2类). 在两例患者中，KT5720的存在均未观察到荧光增强。上述研究表明，福斯科林和BDNF诱导的BDNF-pH荧光变化具有相似的地形和PKA依赖性，表明BDNF可能通过增加cAMP水平触发BDNF分泌。这是通过使用Epac（ICUE）和A激酶活性报告（AKAR）直接测量cAMP的荧光共振能量转移（FRET）传感器指示剂cAMP和PKA活性水平来测试的(SI材料和方法)分别是。我们发现，浸提的BDNF在表达ICUE和AKAR的神经元中诱导cAMP和PKA活性升高(图3一个和图S3)时间进程和幅度与forskolin诱导的相似(28). 此外，BDNF诱导的cAMP/PKA升高存在于2期神经元的所有轴突中，但在3期神经元中局限于轴突(图3A2级)，表明在神经元极化过程中BDNF敏感机制的重新分布，类似于毛喉素和BDNF诱导的BDNF分泌。因此，BDNF可以通过提高cAMP/PKA活性来触发BDNF分泌。

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图3。

BDNF诱导cAMP升高和轴突分化。(一个)BDNF诱导cAMP升高。(A1类)，海马神经元处于第2阶段（S2，非极化）和第3阶段（S3，极化），转染了cAMP的FRET指示剂（ICUE；参见SI材料和方法). 所示为在浴缸中涂抹BDNF（50 ng/ml）或与BDNF涂层珠接触后不同时间的CFP荧光和FRET信号图像。FRET信号是CFP与YFP荧光[F（CFP）/F（YFP）]的比值，在装箱区域测量。棒材，20μm。(A2级)，单个轴突（或轴突/树突）尖端的cAMP变化痕迹（根据BDNF前3分钟的平均值进行标准化）。(第3页)FRET信号显示的轴突（或轴突/树突）尖端cAMP变化总结（标准化如A2级)在没有或存在K252a（或K252b）的情况下。误差条=扫描电镜(n个=每个5-10个细胞，1个或2个神经突起/细胞）。(B类)局部暴露于BDNF或forskolin诱导的cAMP升高引发轴突发育。(地下一层)，显示单个BDNF涂层珠与未分化神经突起局部接触的图像（电镀后10小时，左侧)如Tau-1染色所示，48小时后发展为轴突（箭头）(赖特). (地下二层)，百分比（SEM，n个>每个15个*P（P）< 0.05,t吨分化为轴突或树突的神经突，或与涂有BSA（对照）、forskolin或BDNF的珠接触后36–48小时收缩。

BDNF诱导的局部cAMP升高触发轴突分化。

为了确定BDNF诱导的BDNF分泌在神经元中是在局部水平还是在整体水平上运作，我们将BDNF应用于共价包覆BDNF的乳胶珠培养的海马神经元(SI材料和方法). 接触后几分钟内将珠子取出，以避免珠子的长期非特异性影响，如肌肉纤维中带正电的珠子诱导ACh受体簇所示(29). 我们发现，ICUE转染神经元的FRET信号显示，在珠子接触第2期神经元的轴突后几分钟内，接触部位附近的cAMP水平局部持续升高(图3A1类和A2级). 与之前的报告一致(28)，同一细胞非接触突起中cAMP水平降低(图3A2级)，表示长程抑制信号。此外，BDNF-涂层珠还诱导表达BDNF-pHfluorin的神经元珠接触部位的pHfluoin荧光局部升高，其时间过程与cAMP/PKA依赖性BDNF分泌一致(图S4). K252a而非K252b的存在降低了浴或珠涂BDNF引起的cAMP/PKA升高。尽管K252a可能发挥非特异性作用，但这些结果确实表明Trk信号通路参与(图3第3页). 与BDNF分泌地形图的发育转变一致(图2)，BDNF诱导的cAMP升高发生在轴突，而不是树突(图3A2级). 因此，cAMP升高和BDNF分泌的地形也有类似的发育变化。

BDNF包被珠触发的局部cAMP升高和BDNF分泌表明，BDNF触发的BDNF的分泌可以作为一种自我放大机制来维持稳定的局部cAM升高，这是通过PKA依赖的LKB1磷酸化实现轴突规范所必需的(4)以及下游效应酶级联的后续激活[例如，SAD激酶(2,三)]. 此外，BDNF涂层珠可促进接触神经突起第2期神经元的轴突分化。当珠子被操纵与第2阶段神经元未分化的轴突接触时，同样的神经元在2天后重新检查轴突的形成(图3地下一层)我们发现，与BSA涂层的神经突相比，福斯科林涂层或BDNF涂层珠接触的神经突的轴突形成率明显更高(图3地下二层). 相反，我们发现在轴突与未涂覆或BSA涂覆的珠接触3-5分钟后，FRET信号和轴突起始没有显著影响。因此，局部暴露于BDNF或cAMP升高确实促进了这些神经元的局部轴突分化。

依赖PKA的TrkB受体表面插入。

BDNF-pH荧光素分泌的测量表明，随着神经元极化，所有轴突从均匀分泌过渡到轴突限制分泌。用外源性抗体对表面TrkB进行免疫染色，显示TrkB向轴突的重新分布类似(图4A1类). 使用的TrkB抗体的特异性在HEK293细胞中通过Western blot分析得到证实，显示转染TrkB表达结构的细胞的裂解物的免疫染色高于未转染的对照细胞。为了控制神经元的膜面积，我们使用罗丹明结合ConA（R-ConA）染色，这是一种植物凝集素，与所有细胞表面糖蛋白的葡萄糖和甘露糖残基结合。将TrkB染色与R-ConA染色进行归一化后，我们发现第2期神经元轴突尖端的TrkB最高染色强度为121%±14%（SEM，n个=13）相同神经元尖端的平均强度（如5个最高强度的轴突所示；图4地下一层). 然而，对于3期神经元，轴突尖端的TrkB染色强度为479%±50%（SEM，n个=平均尖端强度的19）(图4地下二层). TrkB的这种局部再分配可能是由于TrkB膜在轴突的插入率增加或TrkB前体小泡向轴突的运输增加，或两者兼而有之。这也可以解释BDNF诱导的极化神经元远端轴突处BDNF pHorion分泌受限的原因。

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图4。

极化后TrkB受体和cAMP向轴突的再分布。(一个)2期和3期神经元的表面TrkB和细胞质cAMP水平。(A1类)海马神经元用针对表面TrkB受体的外源性抗体进行免疫染色（绿色）。细胞表面与R-ConA（红色）共染，以实现膜面积归一化。（比例尺，20μm）(A2级)与PKA活性FRET指示剂（AKAR）共同转染的2期（或3期）神经元的FRET图像。(B类)第2阶段汇总图(地下一层)或第3阶段(地下二层)神经元表面TrkB的平均荧光强度（±SEM，n个= 35–50; **P（P）<0.01，Tukey试验，通过ConA染色归一化，左轴）和平均基础PKA活性，如AKAR信号所示（±SEM，n个= 10–35; *P（P）<0.05，Tukey试验，右轴）沿神经突(顶部)或位于神经突远端5μm处。对每个强度最高的细胞的前五个轴突进行比较，按强度从左到右排列，并在所有细胞中取平均值。强度等级神经突的平均长度如下所示。

进一步研究表明，TrkB的膜插入受BDNF和细胞质cAMP的调节。我们发现，在存在翻译抑制剂环己酰亚胺（25μg/mL）的情况下，细胞板形成后10 h，用forskolin（20μM）或BDNF（50 ng/mL）处理3 h，导致2期神经元表面TrkB水平升高(图S5一个). KT5720的存在消除了forskolin效应，而KT5720,K252a（但不是K252b）或PI3K抑制剂LY294002的存在则消除了BDNF效应(图S5B类). 在没有环己酰亚胺的情况下也得到了类似的结果(图S6一个). 放线菌酮处理在阻断蛋白质合成方面的有效性通过其在放线菌亚胺孵育16小时（而非3小时）后降低这些神经元中总TrkB水平的效果得到证实(图S6B类). 这些结果与在视网膜神经节细胞中发现的结果一致(30)表明BDNF促进的表面TrkB表达依赖于cAMP/PKA和PI3活性，而不依赖于蛋白质合成。此外，单独使用KT5720、K252a（但不使用K252b）或LY294002降低表面TrkB的表达(图S5B类)，表明组成型表面TrkB的表达受到基础PKA和PI3K活性的调节。

通过在涂有膜渗透性荧光cAMP类似物（F-cAMP）或BDNF条纹的基底上电镀2期神经元，进一步检查了BDNF-cAMP信号传导是否可以局部调节TrkB表面表达(SI材料和方法). 对于体细胞位于条纹边界的所有细胞，我们比较了条纹上“开”和“关”的轴突尖端表面TrkB的平均免疫染色荧光（通过R-ConA染色标准化）并发现表面TrkB在与F-cAMP或BDNF条接触的神经突起上表达的明显偏好(图S5C类). KT5720和K252a废除了这种偏好，但K252b没有废除(图S5D类). 这与F-cAMP或BDNF诱导的TrkB依赖于cAMP/PKA的插入相一致。通过在这些神经元中表达TrkB-GFP融合构建物，我们进一步发现TrkB表面表达在接触BDNF涂层珠后几分钟内局部增加(图S5E类). 当在LY294002、TrkB-IgG和K252a存在的情况下接触珠子时，没有出现这种局部TrkB增加，但不受IgG-Fc、KT5720或K252b的影响，这表明BDNF诱导的TrkB-GFP积累取决于TrkB和PI3K活性，而不是PKA活性。这一发现表明，在神经炎生长锥处的BDNF/TrkB信号以PI3K依赖的方式促进TrkB的顺行运输。

我们感谢Z.-Y.Chen（山东大学）提出的Flag-TrkB-GFP构建，感谢J.Zhang提出的使用Epac（ICUE）和A激酶活性报告荧光共振能量转移探针的cAMP指示剂，感谢M.Kojima（国家先进工业科学技术研究所）提出的BDNF-EGFP构建的cDNA，感谢G。Miesenboeck（耶鲁大学）为超黄道pHfluorin构造。这项工作得到了美国国立卫生研究院（EY014979和PN2EY018228）的部分资助。