《实验医学杂志》。2006年5月15日；203(5): 1259–1271.
第条
辐射调节肽库，增强MHC I类表达，并诱导成功的抗肿瘤免疫治疗
,1 ,2 ,1 ,1 ,2 ,2 ,三 ,1 ,4 ,1 ,1 ,1 ,4 ,1 ,2 ,4和1
埃里克·雷茨
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
詹姆斯·霍奇
2肿瘤免疫学与生物学实验室，三马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心放射肿瘤学分院
卡拉·A·赫伯特
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
汤姆·A·格鲁修斯
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
Mala Chakraborty公司
2肿瘤免疫学与生物学实验室，三马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心放射肿瘤学分院
伊丽莎白·K·万斯利
2肿瘤免疫学与生物学实验室，三马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心放射肿瘤学分院
凯文·坎普豪森
2肿瘤免疫学与生物学实验室，三马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心放射肿瘤学分院
罗莎莉·路易斯顿
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
阿诺德·德鲁
4荷兰莱顿2333 2A莱顿大学医学中心免疫血液学和输血系和医学系统生物学中心
乔斯特·奈杰森
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
亚历山大·格里克斯波尔
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
伊利·梅斯曼
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
弗兰克·A·韦瑞克
4荷兰莱顿2333 2A莱顿大学医学中心免疫血液学和输血系和医学系统生物学中心
Hergen Spits公司
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
杰弗里·施洛姆
2肿瘤免疫学与生物学实验室，三马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心放射肿瘤学分院
彼得·范·韦伦
4荷兰莱顿2333 2A莱顿大学医学中心免疫血液学和输血系和医学系统生物学中心
雅克·奈夫杰斯
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
1荷兰癌症研究所肿瘤生物学部和免疫学部，1066 CX，荷兰阿姆斯特丹
2肿瘤免疫学与生物学实验室，三马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心放射肿瘤学分院
4荷兰莱顿2333 2A莱顿大学医学中心免疫血液学和输血系和医学系统生物学中心
2005年12月16日收到；2006年3月27日接受。
摘要
放射治疗是最成功的癌症治疗方法之一。本文研究了辐照对MHC I类分子抗原提呈的影响。由于三种反应，MHC I类分子的细胞表面表达在许多天内以辐射剂量依赖的方式增加。最初，现有蛋白质的降解增强，导致细胞内肽库增加。随后，由于雷帕霉素途径哺乳动物靶点的激活，翻译增强，导致肽产生增加，抗原提呈增加，以及辐射细胞的细胞毒性T淋巴细胞识别增加。此外，还产生了新的蛋白质来响应γ辐射，产生了MHC I类分子呈递的新肽，这些肽被细胞毒性T细胞识别。我们表明，只有在对肿瘤组织进行放射治疗之前，免疫治疗才能成功根除小鼠结肠腺癌。我们的研究结果表明，定向放射治疗可以提高肿瘤免疫治疗的疗效。
MHC I类分子向CTL提供内源性肽。许多这些肽是由蛋白酶体从新合成但快速降解的蛋白质（称为快速降解蛋白质（RDP）或缺陷核糖体产物）中生成的(1,2). 蛋白酶体产品由三肽基肽酶II修饰(三)和下游肽酶，只有一小部分通过结合与抗原处理相关的转运体（TAP）而逃脱完全降解(4–6). TAP将肽转移到内质网腔中，以进一步修剪并结合MHC I类分子(7). 肽结合后，MHC I类分子进入细胞膜，使T细胞检查细胞内肽含量，并清除那些呈现外源肽的细胞。TAP在正常情况下不完全激活，因为肽库在抗原提呈途径中形成限制因子(7). 这种情况可能会在压力条件下发生变化。例如，在急性流感感染期间，病毒蛋白的生成导致肽生成的快速增加，从而使CTL对感染作出快速反应(1). 在此，我们研究了另一种临床相关条件辐射对细胞内肽产物和MHC I类表达的影响。
电离辐射最著名的作用是诱导双链DNA断裂，如果DNA修复失败，则可能导致突变，导致转化和肿瘤形成(8,9). 细胞对DNA损伤的反应是激活复杂的通路来阻止细胞周期，允许DNA修复或诱导程序性细胞死亡(10). 电离辐射后细胞的微阵列分析显示核苷酸切除修复基因、细胞周期基因和参与凋亡的基因上调(11). 此外，辐射诱导的自由基形成通过自由基诱导的交联、二硫键断裂和氨基酸侧链氧化来修饰蛋白质(12)，可能导致蛋白质展开和降解。辐射吸收可直接发生在蛋白质内，但主要导致水的辐解，水占细胞体积的90%。由此产生的短寿命自由基可以修饰细胞内蛋白质和DNA。目前尚不清楚γ射线照射是否会改变体内的细胞内蛋白库，以及由此产生的MHC I类肽库是否会因这种治疗而改变。我们发现，在较高剂量下，γ射线照射可在许多天内促进MHC I类肽的产生和表面表达。此外，MHC I类肽库现在包括辐射特异性肽。放射诱导对MHC I类抗原提呈的影响可能具有重要后果，因为放射治疗与免疫治疗相结合可产生优越的抗肿瘤反应。
结果
电离辐射增强MHC I类分子的表面表达
正常情况下，抗原提呈途径远未饱和，细胞内蛋白质库的变化将导致肽-MHC I类复合物的快速变化，使免疫系统能够对细胞内蛋白质含量的变化作出快速反应(1,13). 众所周知，电离辐射会引发自由基，自由基会氧化蛋白质和DNA，导致过多的生物效应。我们将人黑色素瘤细胞系MelJuSo暴露于不同剂量的γ射线照射下，18小时后通过流式细胞术定量细胞表面-MHC I类复合物。与以前的报告一致(14–16)，我们观察到体外辐射诱导MHC I类表达增加。这种增加是剂量依赖性的()而另一种蛋白质转铁蛋白受体的表达则未受影响。在CMV启动子的控制下，对表达HLA-A2的转染MelJuSo细胞进行γ射线照射后观察到同样的增加，表明HLA表达的增加不是由MHC位点的转录激活引起的（未公布的数据）。
电离辐射增加细胞表面肽-MHC I类复合物的表达。（A） 如图所示，将细胞暴露于不同剂量的辐射下，并在γ射线照射后18 h用流式细胞仪测量细胞表面肽-MHCⅠ类复合物的水平。显示无第一抗体（W6/32）时的荧光（背景）。（插图）在不同剂量的γ辐射后，培养18小时后，MHC I类和转铁蛋白受体（TfR）的平均荧光强度（MFI）（代表性实验）。（B） 辐射诱导MHC I类上调的时间进程。MelJuSo细胞暴露于不同剂量的γ射线下并培养指定时间，然后通过FACS分析表面MHC I类表达。测定MFI，并将其与对照MelJuSo细胞中MHC I类表达相关，绘制比率。在较高剂量的辐射下，观察到MHC I类表达的长期显著增加。（C） 将一只HLA-A2转基因小鼠局部暴露于25 Gy剂量的γ射线照射下。24 h后，处死该小鼠，并用兔抗MHCⅠ类h链血清和与Cy5偶联的二级抗体对暴露于γ射线照射的肾脏和辐射场外的肾脏进行染色。背景荧光仅用第二抗体检测。图像是在相同的设置下制作的。
为了测试辐射对MHCⅠ类表达的时间效应，在FACS分析MHCⅠ级表达之前，用不同剂量的辐射MelJuSo细胞并培养不同时间(). 在3天的时间里，在更高剂量（10-25 Gy）下观察到MHC I类表达的显著增加。为了测试在体内是否可以观察到MHC I类表达的类似增加，我们照射了HLA-A2转基因小鼠(17)照射24小时后，分离肾脏，并用抗人MHC I类h链抗体对相应肾脏切片进行染色(). 荧光定量显示，与未照射肾脏相比，照射肾脏中HLA表达增加了两到三倍，与组织培养中的效果类似(). 辐照后转基因小鼠皮下组织中MHC I类水平也增加（未公布数据）。因此，γ射线通过增加体内外MHC I类表达，导致剂量依赖性细胞反应。
辐射以剂量依赖的方式扩大细胞内肽库
为了了解辐射诱导MHC I类表达的分子基础，我们使用稳定转染TAP1-GFP的MelJuSo细胞，通过TAP迁移率分析来分析细胞内肽库的定量变化。标记有GFP的TAP转运体的横向迁移率可以使用一种时间推移协议来跟踪，该协议显示光漂白后的荧光恢复（FRAP）。TAP以ATP依赖的方式将肽运输到内质网，其活性与其迁移率呈负相关。完全活性的TAP转运体扩散速度较慢（可能是由开放的孔引起的），而非活性TAP分子（在封闭的构象中）扩散速度更快(1). 在缺乏肽（蛋白酶体抑制后）的细胞中，TAP转运体在未辐照细胞中的扩散速度增加，而在肽饱和细胞中则降低(). 当用4Gy的剂量照射细胞并在1小时后检测时，TAP迁移率下降到与肽饱和细胞相当的水平。这取决于蛋白酶体活性和ATP。ATP耗竭使受照细胞中TAP的迁移率增加到与ATP耗竭的对照细胞相似的水平(). 人类CMV蛋白US6抑制和阻止TAP的构象变化(18,19). 电离辐射不会改变转染US6内质网腔部分的细胞中TAP的迁移率(). 这排除了辐射对内质网膜改变引起的TAP流动性的可能影响，表明受辐射细胞由于胞内肽水平较高而增加了TAP活性。
电离辐射以剂量依赖的方式增加细胞内肽水平。（A） 利用FRAP通过其在内质网膜中的横向迁移率测量TAP活性（与细胞内肽的数量相关）。乳酸菌素通过抑制蛋白酶体来耗尽细胞中的肽。ATP耗竭和蛋白酶体抑制使TAP失活。环己酰亚胺被用于抑制蛋白质合成。在4 Gy剂量后1小时测量TAP活性(n个= 9; 平均值±SD）。（B） 如图所示，在不同的γ射线照射后1-2小时测量TAP活性(n个= 9; 平均值±SD）。（C） 对照细胞和暴露于25 Gy辐射的细胞被微量注射不同长度的肽底物（如图所示），并测定半衰期(n个= 8; 平均值±SD）。（D） （左）如图所示，MelJuSo细胞暴露于不同剂量的γ射线下，然后培养1或6小时。在最后30分钟内，在有或无蛋白酶体抑制剂MG132的情况下培养细胞，以观察蛋白酶体产生但未转化的多泛素化物种。N个-裂解前加入乙基马来酰亚胺以抑制去泛素化酶，并通过10%SDS-PAGE分离细胞裂解物，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上，用抗体FK2检测泛素。标记蛋白的位置用标线表示，多泛素化蛋白部分用标线（用星号标记）在凝胶的右侧位置表示。（右）量化辐射对多泛素化的影响。Western blot的多泛素池（星号表示的区域）的发光被量化，针对蛋白质输入进行校正，并与对照细胞中的信号相关。当蛋白酶体被MG132抑制时，辐射后观察到多泛素池显著增加。（E） 在时间点t=0时，γ辐照后一段时间内测量的TAP活性。顶行表示未辐照细胞中的TAP活性；底线表示肽饱和细胞中的TAP活性（每个数据点n>3；平均值±SD）。
肽水平的增加可能是肽酶活性降低的结果；因此，我们通过在对照细胞或辐射25Gy后2–3h的细胞中引入内部猝灭的荧光肽来检测γ辐射是否抑制肽酶活性。这些肽在被细胞内肽酶降解后将变为荧光肽(三,4). 我们测定了不同长度的肽的稳定性，包括9和14肽以及27肽基肽酶II底物(). 辐照后，这些肽的半衰期没有实质性差异。如果有，暴露于γ射线的细胞中肽半衰期较短。这表明TAP活性和MHC I类表达的增加不是由于细胞内肽酶活性的失活或饱和，而是由于电离辐射导致蛋白质降解的增加。
为了独立验证γ辐射引起的蛋白质转换增加，MelJuSo细胞暴露于不同剂量的γ辐射，1或6小时后用抗泛素抗体的Western blotting测定多泛素化程度(). 由于对多泛素化的任何影响都可以通过增强蛋白酶体降解来消除，因此在细胞裂解前30分钟，MG132会抑制蛋白酶体。观察到多泛素化增加是对辐射的反应。通过发光检测和多泛素信号定量蛋白质印迹(，垂直线）。相对发光显示，只有蛋白酶体受到抑制后，多泛素化物种才会增加(，右），表明辐射增强的蛋白质泛素化，随后是蛋白酶体降解。这将导致在直接测量TAP活性的实验中检测到更多降解碎片().
因为MHC I类表达以辐射剂量依赖的方式增加()，我们研究了肽库是否有类似的增加。随着γ辐射剂量的增加，对细胞进行辐照，并测定TAP迁移率。照射后1小时，所有细胞均显示肽饱和水平()，这不能解释MHC I类表达的剂量依赖性增加。因此，我们再次使用TAP迁移率分析测试了不同剂量γ辐射对细胞内肽库的时间效应(). 当细胞受到1 Gy的辐射时，TAP活性的增加仅持续1 h。4 Gy的剂量在细胞恢复到非饱和水平前约3 h会导致肽饱和水平，而7 Gy辐射的细胞会出现长达7 h的肽饱和。25 Gy照射后的细胞保持肽饱和24小时以上(，下线）。这些动力学可以解释照射对MHC I类表达的剂量依赖性效应。
辐照后蛋白质的降解与合成
为了测试稳定的蛋白质或RDP是否有助于增加细胞内肽库，在辐射之前用翻译抑制剂环己酰亚胺对细胞进行预处理，以抑制辐射期间和之后的蛋白质合成。RDP被定义为翻译产品，在翻译后无法发挥功能并迅速降级(5,7). 与稳定的蛋白质库不同，该库会立即受到翻译抑制的影响(1,2). 与未经辐照的细胞相比，环己酰亚胺处理对TAP活性没有影响，表明辐照会导致稳定蛋白质的降解(). 为了观察辐射后蛋白质的分解，我们在MelJuSo细胞中CMV启动子下稳定表达增强型GFP（EGFP）。25Gy照射细胞，通过流式细胞术将GFP荧光与对照细胞进行比较。辐射后4小时（当GFP已经降解时），细胞内的荧光没有降低，可能是因为受影响的蛋白质库太小，无法通过FACS直接检测。令人惊讶的是，照射24小时后细胞内GFP荧光增强(). 辐射后蛋白质表达明显增加可能是由于辐射诱导雷帕霉素（mTOR）激酶哺乳动物靶点激活后蛋白质翻译速率增加所致，雷帕霉素是蛋白质翻译的关键调节因子(20). mTOR激活S6K，S6K释放启动因子4E-结合蛋白1，导致核糖体翻译增强。顾名思义，雷帕霉素能特异性抑制mTOR(21). 当表达GFP的MelJuSo细胞在雷帕霉素存在下受到照射时，未观察到GFP表达对电离辐射的反应增加，这表明mTOR通路在辐射反应中起着关键作用(). 雷帕霉素还降低了未辐照细胞中GFP的表达，这表明在控制条件下，mTOR活性也是最佳蛋白表达所必需的。
mTOR途径、电离辐射和MHCⅠ类抗原提呈。（A） 在存在或不存在mTOR抑制剂雷帕霉素的情况下，将在CMV启动子控制下稳定表达GFP的MelJuSo细胞暴露于25Gyγ辐射。在γ射线照射后0、4或24小时通过流式细胞术测定GFP的表达（n=6；平均值±SD）。（B） 在分析之前，表达TAP1-GFP的MelJuSo细胞暴露于25Gy辐射下并培养24h。雷帕霉素存在于24小时培养期间或仅存在于最后3小时培养期间。另外，在分析前最后一小时内添加的环己酰亚胺抑制了翻译。FRAP检测细胞内肽库。（C） MelJuSo细胞在有或无mTOR抑制剂雷帕霉素的情况下接受25 Gy辐射，然后用MHCⅠ类抗体W6/32标记细胞进行流式细胞术分析。（n=4；平均值±SD）。（D） 在CMV启动子的控制下，稳定表达HLA-A2/GFP的MelJuSo细胞按照指示的剂量进行辐射，并在有或无雷帕霉素的情况下培养6小时，如指示所示。用标记细胞35如图所示，在裂解前60分钟分离出S-蛋氨酸/半胱氨酸，以及内源性和GFP标记的MHC I类分子、MHC II类分子和游离的MHCⅠ类H链。分子和标记蛋白在10%凝胶上的位置已标明。NRS，正常兔血清对照免疫沉淀。（右）减去相同M后，与来自非辐射对照细胞的SDS-PAGE信号相关的SDS-PAGE信号的定量第页NRS车道上的区域。
为了测量辐射诱导的mTOR通路激活对细胞内肽库的影响，MelJuSo细胞受到25 Gy的辐射并培养24 h。根据FRAP的TAP活性测量结果推断，增加的肽库对雷帕霉素治疗敏感，在培养期的最后一个小时添加到环己酰亚胺中(). 这与放线菌酮或雷帕霉素处理后未抑制的细胞内肽的初始增加形成对比(; 未发表的数据）。这表明，在现有蛋白质分解的初始阶段后，由于mTOR激活导致（RDP-衍生）肽水平升高，蛋白质合成增加。为了确定辐射对增强MHC I类表达的mTOR激活作用，细胞暴露于25 Gy，然后在没有或存在雷帕霉素的情况下进一步培养4或24小时。4小时后，雷帕霉素对MHCⅠ类表达没有影响，但用雷帕霉素处理细胞后24小时辐射诱导的MHCⅠ级表达增加明显减少(). 这表明mTOR激活在辐射诱导的增强MHC I类呈现的后期非常重要。
为了测试辐射诱导的mTOR通路是否也增强MHC I类分子的翻译，在暴露于10或20 Gy辐射后6 h，对表达HLA-A2-GFP的MelJuSo细胞进行生物合成标记。为了评估mTOR通路的作用，在有或无抑制剂雷帕霉素的情况下培养细胞。因为氨基酸饥饿后的放射性标记将激活mTOR途径，我们补充道35在裂解和分离MHC I类复合物、游离h链和MHC II类分子之前，将S-蛋氨酸/半胱氨酸置于正常培养基中1小时(). GFP标记的和内源性MHC I类分子、H链以及MHC II类分子的翻译没有因辐射而改变，但仍被雷帕霉素抑制，因此受到构成mTOR活性的影响。
辐射产生独特的MHC I类结合抗原肽
照射后增加的MHC I类分子池可能装载与未照射细胞类似的肽，或者装载一组独特的肽，以响应辐射诱导的mTOR增强的翻译和从头开始的蛋白质生成。为了分析电离辐射后的肽谱，在25 Gy辐射18 h后从对照细胞和细胞中纯化MHC I类分子。用反相高效液相色谱（rpHPLC）洗脱肽并将其分离为50个组分。用质谱法（MS）分析从辐射细胞中分离出的每个组分，并与对照细胞相应组分中的肽含量进行比较(). 对各个组分的比较显示，辐照细胞中有约1%的独特肽，这意味着辐照后出现的大多数肽源于对照细胞中表达和降解的蛋白质。通过串联MS/MS分析对辐照肽库中特有的几个肽进行测序(). 所有肽都具有与MelJuSo细胞HLA-A1分子结合的正确锚定残基(，粗体）(22). 两种肽来自参与DNA修复的蛋白质（MSH6和PCNA[23])一个位于蛋白质分解中（核F-box蛋白Fbl7参与[未知]底物的识别和泛素标记），另一个位于线粒体外膜（未发表数据）的蛋白质（CGI 51或SAM50），可能是线粒体蛋白质导入系统的一部分(24). 这些肽源于γ射线照射后最可能上调的蛋白质。
电离辐射改变MHC I类相关肽谱和免疫反应。（A） 如图所示，从未辐照和辐照细胞的相应rpHPLC组分中洗脱的双电荷肽的质谱图。在两个图谱中都观察到星号标记的肽，而箭头表示仅在辐射后的肽部分中观察到的肽CGI-51。（B） 质谱法测定γ辐射诱导蛋白质的肽序列和相应的蛋白质。请注意，所有肽都含有HLA-A1的锚定残基（粗体）。（C） 识别含辐射诱导肽的HLA-A1四聚体的CTL的鉴定。CD5门控的人血单个核细胞流式细胞术分析+和CD4−/CD19编号−TCRγδ−染色（最左侧面板）以确定CTL群体。
如果T细胞能够识别其中一些独特表达的肽，那么识别辐照肿瘤细胞上的辐射诱导肽可以使放射治疗和免疫治疗相结合来诱导特异性反应。为了鉴定识别这些肽的CTL，生成HLA-A1四聚体并装载辐射诱导肽CGI 51(206–215)，MSH6(469–478)和F-box蛋白Fbl7(335–362)(). 三分之二的健康HLA-A1阳性捐赠者有少量（～0.08%）四聚体反应CD8+PBMC与含有三种肽之一的四聚体孵育时的T淋巴细胞(). 使用含有流感病毒肽的HLA-A1四聚体，可以在所有三个供体（～0.14%）中检测到流感特异性T细胞，而使用从黑色素瘤相关抗原MAGE-A1衍生的肽装载的HLA-A2四聚体则没有发现反应性（<0.02%）(25)，在正常HLA I类表达组织中不表达（未发表数据）。当CD8+从供体淋巴细胞中分离出T细胞，并用预先加载辐射诱导肽的CD8-阴性淋巴细胞刺激1周，尽管其中两个供体中存在辐射诱导抗原特异性T细胞，但这些培养物中四聚体结合T细胞的百分比没有增加。辐射诱导肽的CTL特异性可能是“无反应的”，正如健康供体和患者中Mart-1/HLA-A2特异性CTL所显示的那样(26,27). 这些T细胞必须受到更广泛的刺激才能离开“无能状态”，然后才能对辐射诱导的细胞产生反应，这是肿瘤疫苗研究中经常观察到的现象(28).
肿瘤细胞辐射增强体外T细胞识别并提高体内过继CTL免疫治疗的疗效
为了测试辐射诱导的MHC I类上调是否能更好地识别靶细胞，我们照射了表达肿瘤抗原gp70的小鼠结肠腺癌MC38细胞（20 Gy）。测定辐射效应和mTOR依赖的MHC I类表达。与MelJuSo细胞类似，MC38细胞在照射后上调MHCⅠ类表达，雷帕霉素可抑制其表达(). 随后，测试了特异性CTL对细胞上gp70表位的识别操作。照射MC38细胞导致雷帕霉素依赖性裂解增强(). 雷帕霉素对（未辐照）细胞的CTL识别无影响。这表明，辐射诱导的MHC I类表达增加导致对抗原特异性细胞毒性T细胞杀伤的敏感性增加。
肿瘤细胞的辐射增强了CTL在体内外的疗效。MC38细胞经（A）缓冲液、（B）20Gy辐射、（C）雷帕霉素或（D）辐射和雷帕霉素处理后再培养。24小时后，通过流式细胞术分析MHC水平。（A–D）虚线表示同种对照抗体；实线表示H2-Kb条插图数字表示阳性细胞的百分比（平均荧光强度）。（E）111用缓冲液（□）、20Gy辐射（•）、雷帕霉素（）或辐射与雷帕霉素联合作用（▴）处理标记的MC38细胞。24 h后，用不同数量的gp70特异性CTL培养细胞18 h。（F）h-2K的时间效应b条辐射后表达。MC38细胞暴露在不同剂量的辐射下，然后按指定的时间进行培养。H2-K的表面表达b条随后通过FACS分析确定，并在与H2-K的MFI相关后绘制MFIb条对照MC38细胞的表达。（G） C57BL/6小鼠注射3×105每天测量MC38肿瘤细胞，并绘制肿瘤体积（单位：mm）。（第一组）未接受额外治疗的小鼠。（第二组）小鼠肿瘤移植后第9天接受原位外照射（10 Gy）。（第三组）小鼠采用3×106第10天的gp70特异性CTL（ω）。（第四组）小鼠肿瘤在第9天接受原位外照射（10 Gy），然后在第10天过继转移gp70特异的CTL（δ）。图中显示了实验各组的小鼠数量和未检测到任何肿瘤的小鼠数量。
为了检测这种现象是否也在体内发生，我们首先测试了辐射对H2-K表达的时间效应b条分子。MC38细胞暴露于不同剂量的辐射下，然后进行培养和FACS分析H2-Kb条分子(). 8或10Gy辐射后，MHC I类表达增加超过11d。为了测试辐射对抗肿瘤免疫反应的影响，我们使用了过继转移范式。在C57/BL6小鼠右后腿皮下注射MC38细胞。9天后，将小鼠分为四组，分别接受不治疗、肿瘤组织10Gy照射、仅过继转移CTL或肿瘤联合照射，24小时后转移CTL。未接受任何治疗的小鼠肿瘤()逐渐生长，最终导致动物死亡（30天时为100%）。肿瘤在第9天暴露于辐射仅减少肿瘤生长，而在第10天用过继转移的gp70特异性CTL治疗肿瘤也没有显著抑制肿瘤生长。然而，联合放疗和CTL过继转移治疗肿瘤，显著抑制肿瘤生长（P<0.001与未治疗相比；P<0.001与单纯放疗相比；P<0.0001与单纯过继转移相比）。此外，62.5%的小鼠接受了肿瘤放疗和CTL过继转移的联合治疗，在实验期间肿瘤得到了治愈，并成为无瘤小鼠，这表明放射治疗是当前抗癌免疫治疗方案的重要补充。
讨论
放射治疗是术后最成功的癌症治疗方法。辐射除了具有细胞毒性外，还可以根据剂量对细胞和组织产生多种影响。在动物模型和临床研究中，低剂量辐射可通过上调肿瘤相关抗原诱导免疫调节活性(29,30)，粘附分子(31,32)和IFN-γ分泌(33,34)，CTL可能被吸引到受照射的组织中以诱导局部反应(34)并改善肿瘤反应(16). 局部放射治疗后，电离辐射也可以抑制远处肿瘤，这种现象称为脱落效应。这种现象已经在各种恶性肿瘤中报道过，但仍然是一个鲜为人知的事件。肿瘤照射后，可能需要T细胞介导远处肿瘤生长抑制(35,36). 我们关于γ辐射对MHC I类分子影响的数据为免疫介导的绝对效应提供了解释。
我们使用的剂量在1–25 Gy之间，低于或可与患者接受的剂量相媲美，并观察到电离辐射在两个阶段诱导MHC I级表现的剂量依赖性增加(). 第一阶段代表来自现有蛋白质的肽，因为抑制翻译并不影响这些肽的生成。辐射后迅速观察到更多用于蛋白酶体降解的多泛素化蛋白，即使剂量为1–4Gy，也会导致更多肽用于MHC I类抗原的呈现，并且增强MHC I级表达，因为肽是复合物形成的限制步骤(37). 即使在低剂量下，辐射也会导致自由基的形成，蛋白质会被辐射直接修饰或被水辐射分解后形成的自由基间接修饰，从而导致各种氨基酸的氧化。这些修饰可能针对受影响的蛋白质，以便蛋白酶体快速降解。尽管这将反映细胞蛋白库中的一小部分，但它仍会增加肽的数量，从而增加MHC I类的表达。在第二阶段，mTOR激酶被激活，导致蛋白质合成增强。结果，产生了更多的蛋白质，其中一部分立即被降解为RDP，导致细胞内肽水平增加。mTOR激活后MHC I类分子的翻译更好，但没有观察到MHC I级翻译的额外增加。此外，即使细胞暴露于20 Gy辐射下，仍然可以观察到大量的游离MHC I类H链，这表明如果周围有肽，可能有更多的MHC I级分子被装载。因为肽是MHC I类组装的限制因素(37)，增加肽库对增加MHC I类表达最为重要。数据表明，如FACS所观察到的，mTOR增加的“一般”翻译而不是MHC I类翻译的特定增加对辐射增加的表面MHC I级表达很重要。除了这两种反应外，辐照细胞还通过表达独特的蛋白质作出反应，这些蛋白质中的肽随后被MHC I类分子装载。辐射可选择性上调和/或降解各种蛋白质，包括DNA修复蛋白，如PCNA、MSH2和MSH6，也包括参与细胞周期检查点、凋亡和蛋白质降解的蛋白质(11). 辐照后，在MHC I类上发现了这些蛋白质的片段。鉴于MHC I类肽分离、肽洗脱、浓缩和MS分析前的HPLC分馏之间的许多实验步骤（这也不是定量技术），我们的实验方案不允许对总肽库进行定量。尽管在辐照池中输入的肽应该是原来的两到三倍（基于表面MHC I类肽组合的FACS分析），但在各种程序之后，这种差异可能会消失。尽管如此，可以想象mTOR的激活会导致蛋白质合成的改变，从而导致肽谱的改变。MHC I类抗原提呈途径效率极低，产生了一个自我抗原阈值，只有在强烈上调后才能提呈。产生的自肽出现在受照射的组织上，并可能被患者的特定CTL识别。我们用三种确定的放射性特异性自身肽四聚体标记后，在血液中发现了此类CTL，但这些CTL不能在体外扩增和刺激。这些CTL可能处于无能状态。因为IFN-γ是局部分泌的，是对辐射的反应(33,34)，这种CTL可能在受照组织中进一步活化。如最近成功的体内抗肿瘤反应所述，可能需要特定的疫苗接种方案来重新唤醒这些无活性CTL(28)在辐照诱导肽局部前。
总结电离辐射对MHC I类抗原呈递的三种影响的模型。早期效应是由蛋白质降解引起的，这些蛋白质可能会被辐射触发或损坏。后期效应是由mTOR通路激活引起的，这导致蛋白质的蛋白质翻译增加，并增加了这些新蛋白质（RDP）产生的肽。增加的肽库将增强MHC I类组装，因为肽是限制因素。此外，独特的蛋白质将被表达/上调以响应电离辐射，从而产生由MHC I类分子呈现的新肽。
放射治疗和免疫治疗相结合的另一种策略是局部照射以增加MHC I类分子的表达，如局部照射HLA-A2转基因小鼠肾脏中所示。辐射诱导的MHC I类水平增加导致肿瘤细胞对CTL体外裂解的敏感性增强。值得注意的是，我们之前报道了CTL对五种人结肠癌细胞系的辐射增强杀伤。对其表面抗原的分析表明，只有I类上调是共同的分母(16). 事实上，我们现在证明辐射激活mTOR通路对辐射增强的CTL杀伤至关重要。我们研究了辐照和免疫细胞在体内是否也能协同工作。在小鼠模型中，辐射或过继转移特异性CTL均无效。肿瘤放疗和过继性CTL转移的联合应用大大减少了肿瘤体积，大多数接受这种联合治疗的小鼠完全消除了肿瘤体积。这可能不仅仅是由于MHC I类表达上调，因为mTOR激活将对蛋白质表达产生更广泛的影响，包括Fas、ICAM-1的上调(38)和干扰素表达(33,34). 较高剂量的辐射可在数天甚至数周内增强MHC I类表达。这可能取决于细胞增殖。缓慢分裂的细胞可能具有更长的MHC I类分子半衰期，这解释了为什么快速分裂的MelJuSo细胞比MC-38细胞具有更短的辐射诱导的MHC I类表达增加。其他蛋白的上调可能与MHC I类分子协同作用于CTL反应的局部诱导。
这种联合疗法基于靶向放射强烈支持癌症过继免疫治疗的概念。放射治疗和免疫治疗相结合的协同效应可以解释前面提到的脱落效应，因为局部诱导的MHCⅠ类中特定肿瘤相关抗原的上调可能会将这些抗原的表达提高到CTL激活所需的阈值水平以上。一旦激活，这些T细胞可能识别并攻击远处的肿瘤。
通过增强细胞内肽库，辐射对MHC I类表达的影响可用于放射治疗和免疫治疗的新组合，该组合在治疗抗辐射肿瘤方面具有吸引力，但也可选择性增强活化或过继引入的肿瘤特异性CTL的抗肿瘤反应。CTL可以识别独特的辐射诱导抗原肽或增强的肿瘤相关自身抗原，从而产生更好的肿瘤反应。由于放射可以局部应用于肿瘤而不接触周围组织，因此放射治疗的特异性可以与免疫治疗的特异性相结合，如本研究所示。这种放射免疫疗法的新组合可能为现有的癌症治疗带来新的前景。
材料和方法
小鼠、构建物、细胞系和抗体
TAP1-GFP是通过将全长TAP1融合到EGFP（Clontech Laboratories）中制成的，并如所述稳定转染到黑色素瘤细胞系MelJuSo中(1). 已描述表达HLA-A2-GFP的MelJuSo细胞(39). MelJuSo为DNA型，表达HLA-A1、-B8、-Cw7、-DR3和-DQ2(40). 小鼠结肠腺癌细胞系MC38（H-2b条)，已在前面描述过(41). H-2Kb条–受限，gp70特定CD8+CTL线，即gp70-CTL，由C57BL/6生成，如所述(42)，并识别肽表位p15（KSPWFTTL）。CTL系通过每周用辐照的同基因原始脾细胞在RPMI 1640中用胎牛血清进行体外刺激来维持，并补充10 IU/ml小鼠IL-2（Boehringer Mannheim）。用1μg/ml gp70肽脉冲照射照射的同基因脾细胞1小时，然后在用CTL培养之前洗涤(43). 对于细胞毒性试验和过继转移，CTL在刺激周期的第6天通过密度梯度离心（LSM；Organon Teknika）恢复。
HLA-A2.1转基因小鼠(17)是F.Lemonier（法国巴黎巴斯德研究所）赠送的礼物，并在荷兰癌症研究所的动物设施中保持无菌。在放射免疫治疗实验中，雌性C57BL/6小鼠来自国家癌症研究所弗雷德里克癌症研究中心。小鼠在6-8周龄时被放置在无致病性条件下的微型隔离笼中，直到用于实验。
抗人转移单克隆抗体66Ig10(44)，抗人MHC I类单克隆抗体W6/32(45)，抗人I类H链血清(13)，抗人MHC II类单抗1B5(40)和兔抗GFP血清(40)使用了。用单克隆FK2（Stressgen）检测泛素。用初级FITC-标记的单克隆抗体H-2K进行小鼠细胞表面染色b条购自PharMinen。兔抗人Ⅰ类H链血清(46)用于HLA-A2转基因小鼠的免疫染色。CD5-FITC、CD4-PE、CD19-PE和TCRγδ-PE单克隆抗体从Becton Dickinson获得。
生物化学
蛋白质印迹分析。
MelJuSo细胞在裂解前1小时和6小时以指定剂量照射。如有指示，在溶血前30分钟向细胞中添加10μM MG132。用50μM处理所有细胞N个-乙基马来酰亚胺在裂解前5分钟，以防止底物蛋白质在裂解后的氘化。细胞在1×还原性SDS样品缓冲液中溶解，煮沸，并用10%SDS-PAGE分析，然后用Western印迹聚偏氟乙烯膜。用FK2抗体封闭膜并染色多泛素。蛋白质印迹通过发光检测定量（MultiImage；Alpha Innotech公司）。
生物合成标记。
表达HLA-A2/GFP的MelJuSo细胞(39)用0、10或20 Gy照射，并在添加或不添加10 nM雷帕霉素的IMDM中培养6小时，补充8%FCS。随后用100μCi 35S-蛋氨酸/半胱氨酸（添加到正常培养基中）标记细胞1小时，然后在含有NP-40的裂解混合物中裂解。使用Bradford分析法（BioRad实验室）将5%的裂解液用于量化总蛋白输入，并从等量的总蛋白中分离出免疫沉淀。首先用单克隆抗体W6/32和1B5分离MHCⅠ类和Ⅱ类复合物，然后分离游离MHCⅠH类链，并用10%SDS-PAGE对样品进行分析。包括正常血清对照。凝胶通过磷光图像分析进行定量（富士胶片FLA-3000）。
电离辐射
细胞暴露于来自137Cs来源。指示剂量以0.75Gy/min的速率给予。HLA-A2转基因小鼠局部暴露于25Gyγ辐射。因此，在辐射期间，小鼠被保存在一个有孔的铅管中，并用黑色墨水在皮肤上标明辐射区域(47). 照射24小时后处死小鼠，分离辐射区和非辐射区的组织并固定在福尔马林中进行免疫细胞化学。切割切片并用兔抗人HLA I类H链血清孵育，该血清在这些条件下识别HLA I级分子(46). 此外，使用兔抗体对小鼠组织进行染色，没有发生交叉污染。第二个山羊抗兔免疫球蛋白与远红外染料Cy5（分子探针）偶联，用于最小化组织自身荧光的检测。图像由Leica SP2共焦系统使用辉光/辉光模式制作，荧光定量使用标准Leica软件进行。减去背景（仅二级抗体）荧光以确定电离辐射后HLA-A2表达的增加。
用于FRAP实验的FACS和共焦荧光显微镜分析
用pcDNA3中表达EGFP的构建物稳定转染MelJuSo细胞。细胞在有或无20 nM雷帕霉素的情况下暴露于0或25 Gy辐射下，并培养指定的时间。或者，用0–25 Gyγ射线照射MelJuSo细胞，并在有或无20 nM雷帕霉素的情况下培养指定的时间跨度，然后用W6/32和流式细胞术染色MHC I类复合物。在长期实验中，MelJuSo或MC38细胞暴露于1–25 Gy辐射下并培养7 d（MelJuSo），然后通过W6/32和FACS分析定量MHC I类表达（仅对活细胞群体进行门控）。细胞接种后，在培养期间不需要稀释（重新接种）。辐射后培养MC38细胞11天。用20 Gy处理MC38细胞，在有或无20 nM雷帕霉素的情况下培养24 h，然后用FITC-标记的单克隆抗体h-2Kb和流式细胞术染色。
如前所述，对活细胞进行共焦分析和FRAP实验(1). 为了抑制蛋白酶体，将细胞在37°C和10μM乳酸菌素的存在下培养30分钟。为了去除ATP，用NaAz（0.05%）和2-脱氧葡萄糖（50μM）的混合物培养细胞30分钟。TAP-GFP的扩散按所述进行测定(1). 简而言之，ER中的圆形光斑在全激光强度下被漂白，并使用衰减的激光束监测漂白区域的荧光恢复（使用徕卡TCS延时）。校正成像引起的荧光损失（通常小于4%）后，根据每个回收曲线计算回收半衰期。扩散系数D由至少三个独立的FRAP实验（通常每个实验至少10个测量值）确定，并描述为平均值±SD。作为标准，非操作细胞的FRAP试验包括在内。CLSM培养室的温度为37°C，并持续控制。
肽降解
通过微量注射将内部猝灭肽引入对照MelJuSo细胞或辐照MelJuSo细胞（接受25 Gy剂量后1–2 h），而荧光发射检测如所述(4). 肽序列为T[K-dabcyl]NKTER[C-荧光素]Y（9-mer）、T[K-dabcyl]LKTER[C-fluorescein]YFKDLGP（15-mer）和T[K-dabcyl]NKTER[C-荧光素]YFKDLGPFKDLGPGP（27-mer）。肽经HPLC纯化，序列经MS验证。
MHC I类肽分离、rpHPLC、MS和肽测序
MHC I类肽复合物从>1010MelJuSo细胞是对照细胞或在25 Gy剂量的γ射线照射18小时后收获的细胞。使用抗I类W6/32抗体通过亲和层析纯化肽。用TFA从分离的MHC I类分子中洗脱肽并通过10-kD过滤器，如所述(22). 如前所述，在配有反相C18柱（Pharmacia Biotech）的SMART系统上，使用0.1%TFA中的乙腈梯度，通过RP-HPLC分离得到的肽池(48). 部分反相高效液相色谱图谱来自对照或辐照细胞的相应I类洗脱液。如前所述，从每个HPLC馏分中取样等分样品，并在Q-TOF质谱仪上通过电喷雾MS进行分析(49). 在对相应组分进行比较后，对辐照细胞组分特有的肽进行串联质谱（大约25–30V的碰撞能量）。氨基酸序列通过PeptideSearch程序进行交互解释(50).
用四聚体鉴定特异性CTL
将从健康供体血的浅黄色涂层制备物中分离的PBMC解冻，并在室温下用10μg/ml DNase I在含有8%FCS的Iscoves培养基中培养1 h。四聚体是通过用肽CGI-51重折叠HLA-A1重链而产生的(206–215)，MSH6(469–478)和F-box蛋白Fbl7(335–362)和人类β2m（如上所述）(51). 106将PBMC与APC缀合的HLA-A1四聚体在37°C下孵育10分钟，洗涤，并与抗CD5–FITC抗体、抗CD4–PE、抗CD19–PE和抗TCRγδPE抗体在冰上孵育20分钟。洗涤细胞并通过流式细胞术（FACScalibur）进行分析。用碘化丙啶检测后，将死细胞排除在分析之外。CD5上的细胞数量+和CD4−，CD19−，TCRγδ−染色由93%的CD8组成+T淋巴细胞(，R3）。在该人群中，结合相应四聚体的细胞百分比已确定。
CTL识别
将MC38细胞暴露于20Gy辐射、20nM雷帕霉素（在整个24小时培养过程中保持）或辐射和雷帕霉素的组合，并再培养24小时。这些细胞在标准细胞毒性测定中用作靶标，使用111这些放射性标记细胞（1×10三细胞/孔）与gp70特异性CTL以100:1至3.125:1的效靶比在96周U底板（Costar）中培养，并在37°C与5%CO共培养18小时2培养后，使用上清液收集系统（Skantron）收集上清液，并使用γ计数器（眼镜蛇Autogamma；Packard）定量放射性。特定释放的百分比111In由标准方程确定：比溶解度%=（[实验-自发]/[最大-自发]）×100。所有组的非特异性溶解在6-11%之间。
肿瘤治疗研究
向C57BL/6小鼠注射3×105右后肢股四头肌区的MC38肿瘤细胞。肿瘤移植后9天，用10 Gy照射肿瘤。将小鼠限制在定制夹具中，并放置在铅支架中，以便只有肿瘤暴露在辐照束中。使用Pantax机器在300 kV、10 mA和157 cGy/min的剂量率下进行辐照。使用的剂量（10 Gy）预定对肿瘤皮下生长率的影响最小。
肿瘤照射后24小时，一组小鼠接受3×10剂量6通过过继转移静脉注射gp70特定CTL。每天用数字卡尺测量肿瘤的二维尺寸，并计算肿瘤体积。当任何肿瘤测量值（长度或宽度）超过20 mm时，将动物杀死。按照国家癌症研究所动物护理和使用委员会和实验动物护理和使用指南（卫生与公共服务部出版物国家卫生研究院85-23）。
致谢
我们感谢M.Verhey对手稿的建议和批判性阅读，E.Kueter和P.Weder生成HLA-A1四聚体，F.Couwenberg对FACS的帮助，F.Lemonnier、J.Haanen和A.Bins对HLA-A2转基因小鼠的帮助，J.W.Drijfhout对肽化学的帮助，M.van der Valk对切片的帮助，以及F。为HLA-A2转基因小鼠的辐射提供帮助。
这项工作得到了荷兰癌症协会KWF和医学系统生物学中心的资助。这项研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）、美国国立癌症研究院癌症研究中心（National Cancer Institute Center for Cancer research）的院内研究计划的部分支持。
作者没有相互冲突的经济利益。
笔记
本文中使用的缩写：EGFP，增强型GFP；FRAP，光漂白后荧光恢复；质谱；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；RDP，快速降解蛋白质；反相高效液相色谱法；TAP，与抗原处理相关的转运体。
J.W.Hodge和C.A.Herberts对这项工作做出了同样的贡献。
H.Spit’s和E.A.Reits目前的地址是荷兰阿姆斯特丹AZ 1105号学术医学中心细胞生物学和组织学部。
工具书类
1Reits，E.A.、J.C.Vos、M.Gromme和J.Neefjes。体内TAP的主要底物来自新合成的蛋白质。自然。
404:774–778.[公共医学][谷歌学者] 2美国舒伯特、L.C.安东、J.吉布斯、C.C.诺伯里、J.W.Yewdell和J.R.本宁克。蛋白酶体对大部分新合成蛋白质的快速降解。自然。
404:770–774.[公共医学][谷歌学者] 三。Reits，E.、J.Neijssen、C.Herberts、W.Benckhuijsen、L.Janssen、J.W.Drijfhout和J.Neefjes。2004年，TPPII在调节蛋白酶体降解产物以呈现MHC I类抗原方面发挥了重要作用。免疫。
20:495–506.[公共医学][谷歌学者] 4Reits，E.、A.Griekspoor、J.Neijssen、T.Groothuis、K.Jalink、P.van Veelen、H.Janssen、J.Calafat、J.W.Drijfhout和J.Neefjes。2003年。MHC I类抗原呈递前，核和细胞质中的肽扩散、保护和降解。免疫。
18:97–108.[公共医学][谷歌学者] 5Yewdell，J.W.，2001年。这不是一门令人沮丧的科学：蛋白质合成、折叠、降解和抗原处理的经济学。趋势细胞生物学。
11:294–297.[公共医学][谷歌学者] 6Princiotta，M.F.、D.Finzi、S.B.Qian、J.Gibbs、S.Schuchmann、F.Buttgereit、J.R.Bennink和J.W.Yewdell。2003.定量蛋白质合成、降解和内源性抗原处理。免疫。
18:343–354.[公共医学][谷歌学者] 7Yewdell、J.W.、E.Reits和J.Neefjes。2003.理解大规模杀伤：量化MHC I类抗原呈现。《自然免疫学评论》。
三:952–961.[公共医学][谷歌学者] 8K.K.Khanna和S.P.Jackson。2001.DNA双链断裂：信号传递、修复和癌症联系。自然遗传学。
27:247–254.[公共医学][谷歌学者] 9Rosen、E.M.、S.Fan、I.D.Goldberg和S.Rockwell。2000.辐射敏感性的生物学基础。第2部分：辐射敏感性的细胞和分子决定因素。肿瘤学（亨廷特）
14:741–757.[公共医学][谷歌学者] 10Bartek，J.和J.Lukas。2001.细胞周期。禁止销毁命令。科学。
294:66–67.[公共医学][谷歌学者] 11Tusher、V.G.、R.Tibshirani和G.Chu。2001.用于电离辐射反应的微阵列显著性分析。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
98:5116–5121.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12.Schaich，K.M.，1980年。通过电离、紫外线辐射和脂质氧化在蛋白质和氨基酸中引发自由基——第一部分：电离辐射。批评。食品科学评论。螺母。
13:89–129.[公共医学][谷歌学者] 13.Neefjes，J.J.和H.L.Ploegh。1988年。细胞表面表达的等位基因和部位特异性差异以及HLA I类重链与β2-微球蛋白的关联：抑制糖基化对I类亚单位关联的差异效应。欧洲免疫学杂志。
18:801–810.[公共医学][谷歌学者] 14Santin，A.D.、P.L.Hermona、J.C.Hiserot、M.Chiriva-Internati、J.Woodliff、J.W.Theus、D.Barclay、S.Pecorelli和G.P.Parham。1997年。辐射对人宫颈癌中主要组织相容性复合体I类抗原和粘附协同刺激分子ICAM-1表达的影响。国际放射肿瘤生物学杂志。
39:737–742.[公共医学][谷歌学者] 15Chakraborty，M.、S.I.Abrams、K.Camphausen、K.Liu、T.Scott、C.N.Coleman和J.W.Hodge。2003年。肿瘤细胞的辐射上调Fas并增强CTL裂解活性和CTL过继免疫治疗。免疫学杂志。
170:6338–6347.[公共医学][谷歌学者] 16Garnett，C.T.、C.Palena、M.Chakraborty、K.Y.Tsang、J.Schlom和J.W.Hodge。2004.人类肿瘤细胞的亚致死辐射调节表型，从而增强细胞毒性T淋巴细胞的杀伤作用。癌症研究。
64:7985–7994.[公共医学][谷歌学者] 17Firat，H.、F.Garcia-Pons、S.Tourdot、S.Pascolo、A.Scardino、Z.Garcia、M.L.Michel、R.W.Jack、G.Jung、K.Kosmatopoulos等人，1999年。H-2Ⅰ类敲除，HLA-A 2.1转基因小鼠：用于临床前评估抗肿瘤免疫治疗策略的通用动物模型。欧洲免疫学杂志。
29:3112–3121.[公共医学][谷歌学者] 18Ahn，K.、A.Gruhler、B.Galocha、T.R.Jones、E.J.Wiertz、H.L.Ploegh、P.A.Peterson、Y.Yang和K.Fruh。1997年HCMV糖蛋白US6的ER蛋白域通过TAP抑制肽移位。免疫。
6:613–621.[公共医学][谷歌学者] 19Hengel，H.、J.O.Koopmann、T.Flohr、W.Muranyi、E.Goulmy、G.J.Hammerling、U.H.Koszinowski和F.Momburg，1997年。病毒ER受体糖蛋白使MHC编码的肽转运蛋白失活。免疫。
6:623–632.[公共医学][谷歌学者] 20Sunavala-Dossabhoy，G.、M.Fowler和A.De Benedetti。γ射线通过激活mTOR和磷酸化4E-BP 1诱导放射抗性激酶TLK1B的翻译。BMC分子生物学。
5:1.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Fingar，D.C.和J.Blenis。雷帕霉素（TOR）的靶点：营养素和生长因子信号的整合者，细胞生长和细胞周期进展的协调者。致癌物。
23:3151–3171.[公共医学][谷歌学者] 22Falk，K.、O.Rotzschke、M.Takiguchi、B.Grahovac、V.Gnau、S.Stevanovic、G.Jung和H.G.Rammensee。HLA-A1、-A11、-A31和-A33分子的肽基序。免疫遗传学。
40:238–241.[公共医学][谷歌学者] 23.Gu，L.，Y.Hong，S.McCulloch，H.Watanabe和G.M.Li，1998年。人类错配修复蛋白的ATP依赖性相互作用和PCNA在错配修复中的双重作用。核酸研究。
26:1173–1178.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Kozjak，V.、N.Wiedemann、D.Milenkovic、C.Lohaus、H.E.Meyer、B.Guiard、C.Meisinger和N.Pfanner。2003年。Sam50在线粒体外膜的蛋白质分类和组装机制中发挥重要作用。生物学杂志。化学。
278:48520–48523.[公共医学][谷歌学者] 25Traversari，C.、P.van der Bruggen、I.F.Luescher、C.Lurquin、P.Chomez、A.van Pel、E.De Plaen、A.Amar-Costesec和T.Boon。1992年，人类基因MAGE-1编码的一种九肽被靶向肿瘤抗原MZ2-E的细胞溶解T淋巴细胞识别到HLA-A1上。实验医学学报
176:1453–1457.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Yee，C.、P.A.Savage、P.P.Lee、M.M.Davis和P.D.Greenberg，1999年。使用肽-MHC四聚体从异质人群中分离高亲和力黑色素瘤反应性CTL。免疫学杂志。
162:2227–2234.[公共医学][谷歌学者] 27Lee，P.P.，C.Yee，P.A.Savage，L.Fong，D.Brockstedt，J.S.Weber，D.Johnson，S.Swetter，J.Thompson，P.D.Greenberg等人，1999年。黑色素瘤患者肿瘤相关抗原特异性循环T细胞的特征。国家医学院。
5:677–685.[公共医学][谷歌学者] 28Germeau，C.，W.Ma，F.Schiavetti，C.Lurquin，E.Henry，N.Vigneron，F.Brasseur，B.Lethe，E.De Plaen，T.Velu等人，2005年。黑色素瘤患者接种肿瘤抗原前后血液中抗肿瘤T细胞的高频率。实验医学学报
201:241–248.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Hareyama，M.、K.Imai、T.Ban、H.Koshiba、K.Kubo、M.Shidou、A.Oouchi和K.Morita。1988年。辐射对人胃腺癌细胞膜上癌胚抗原表达的影响——使用单克隆抗体的免疫学研究。日本Igaku Hoshasen Gakkai Zasshi。
48:1572–1574.[公共医学][谷歌学者] 30Ciernik，I.F.、P.Romero、J.A.Berzofsky和D.P.Carbone。电离辐射增强表达肿瘤特异性T细胞表位的细胞的免疫原性。国际放射肿瘤生物学杂志。
45:735–741.[公共医学][谷歌学者] 31Gaugler、M.H.、C.Squiban、A.van der Meeren、J.M.Bertho、M.Vandamme和M.A.Mouthon。体外电离辐射对人内皮细胞细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达的延迟和持续上调。国际辐射杂志。生物。
72:201–209.[公共医学][谷歌学者] 32Quarmby，S.、R.D.Hunter和S.Kumar。辐射诱导人微血管内皮细胞中CD31、ICAM-1和VCAM-1的表达。抗癌研究。
20:3375–3381.[公共医学][谷歌学者] 33Lugade，A.A.、J.P.Moran、S.A.Gerber、R.C.Rose、J.G.Frelinger和E.M.Lord。B16黑色素瘤的局部放射治疗增加了肿瘤抗原特异性效应细胞的生成，这些效应细胞会进入肿瘤。免疫学杂志。
174:7516–7523.[公共医学][谷歌学者] 34Ganss，R.、E.Ryschich、E.Klar、B.Arnold和G.J.Hammerling。T细胞治疗和炎症触发的联合作用可诱导血管重塑和肿瘤根除。癌症研究。
62:1462–1470.[公共医学][谷歌学者] 35Nobler，M.P.1969年。恶性淋巴瘤的脓肿效应及其与淋巴细胞循环的关系。放射科。
93:410–412.[公共医学][谷歌学者] 36Demaria，S.、B.Ng、M.L.Devitt、J.S.Babb、N.Kawashima、L.Liebes和S.C.Formenti。2004年。电离辐射对未经治疗的远处肿瘤的抑制（吸收效应）是免疫介导的。国际放射肿瘤生物学杂志。
58:862–870.[公共医学][谷歌学者] 37Neefjes，J.J.、G.J.Hammerling和F.Momburg，1993年。完整细胞内质网中主要组织相容性复合体I类异二聚体的折叠和组装先于肽的结合。实验医学学报
178:1971–1980.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Chakraborty，M.、S.I.Abrams、C.N.Coleman、K.Camphausen、J.Schlom和J.W.Hodge。肿瘤的外照射改变了肿瘤细胞的表型，使其容易受到疫苗介导的T细胞杀伤。癌症研究。
64:4328–4337.[公共医学][谷歌学者] 39Gromme，M.、F.G.Uytdehaag、H.Janssen、J.Calafat、R.S.van Binnendijk、M.J.Kenter、A.Tulp、D.Verwoard和J.Neefjes。1999.回收MHC I类分子和内体肽负载。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
96:10326–10331.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40van Ham，M.，M.van Lith，B.Lillemeier，E.Tjin，U.Gruneberg，D.Rahman，L.Pastoors，K.van Meijgaarden，C.Roucard，J.Trowsdale等人，2000年。人类组织相容性白细胞抗原（HLA）-DO对主要组织相容性复合体II类相关肽库的调节。实验医学学报
191:1127–1136.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Robbins，P.F.、J.A.Kantor、M.Salgaller、P.H.Hand、P.D.Fernsten和J.Schlom。人癌胚抗原基因在小鼠结肠癌细胞系中的转导和表达。癌症研究。
51:3657–3662.[公共医学][谷歌学者] 42Kudo-Saito，C.、J.Schlom和J.W.Hodge。通过多种皮下/瘤内接种诱导抗原级联反应与抗肿瘤反应相关。临床。癌症研究。
11:2416–2426.[公共医学][谷歌学者] 43Yang，J.C.和D.Perry-Lalley。内源性鼠逆转录病毒的包膜蛋白是多个鼠肿瘤的肿瘤相关T细胞抗原。免疫学杂志。
23:177–183.[公共医学][谷歌学者] 44van de Rijn，M.、A.H.Geurts van Kessel、V.Kroezen、A.J.van Agthoven、K.Verstijnen、C.Terhorst和J.Hilgers。控制人类转铁蛋白受体表达的基因定位到q12区域导致3号染色体的qter。细胞遗传学。细胞遗传学。
36:525–531.[公共医学][谷歌学者] 45Parham，P.、C.J.Barnstable和W.F.Bodmer。1979年。单克隆抗体（W6/32）在HLA-a、B、C抗原结构研究中的应用。免疫学杂志。
123:342–349.[公共医学][谷歌学者] 46Neefjes、J.J.、V.Stollorz、P.J.Peters、H.J.Geuze和H.L.Ploegh。MHC II类而非I类分子的生物合成途径与内吞途径相交。单元格。
61:171–183.[公共医学][谷歌学者] 47Kruse，J.J.、J.A.te Poele、A.Velds、R.M.Kerkhoven、L.J.Boersma、N.S.Russell和F.A.Stewart。2004.使用微阵列分析鉴定照射后小鼠肾脏中差异表达的基因。辐射。物件。
161:28–38.[公共医学][谷歌学者] 48de Bueger，M.、F.Verreck、E.Blokland、J.W.Drijfhout、R.Amons、F.Koning和E.Goulmy。1993年。分离HLA-A 2.1提取的人类次要组织相容性肽。欧洲免疫学杂志。
23:614–618.[公共医学][谷歌学者] 49新泽西州比克曼、P.A.van Veelen、T.van Hall、A.Neisig、A.Sijts、M.Camps、P.M.Kloetzel、J.J.Neefjes、C.J.Melief和F.Ossendorp。2000.通过C-末端蛋白酶体裂解位点两侧的单一氨基酸取代消除CTL表位处理。免疫学杂志。
164:1898–1905.[公共医学][谷歌学者] 50Mann，M.和M.Wilm。1994年。通过肽序列标签对序列数据库中的肽进行容错识别。分析。化学。
66:4390–4399.[公共医学][谷歌学者] 51Altman，J.D.、P.A.Moss、P.J.Goulder、D.H.Barouch、M.G.McHeyzer-Williams、J.I.Bell、A.J.McMichael和M.M.Davis。抗原特异性T淋巴细胞的表型分析。科学。
274:94–96.[公共医学][谷歌学者] 
