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自然。作者手稿；PMC 2012年2月18日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然。2011年8月18日；476(7360): 298–303.
2011年7月27日在线发布。 数字对象标识：10.1038/自然10351
预防性维修识别码：项目经理3210554
NIHMSID公司：NIHMS313098标准
PMID：21796119

非霍奇金淋巴瘤组蛋白修饰基因的频繁突变

瑞安·D·莫林,*,1 玛丽亚·门德斯·拉戈,*,1 安德鲁·蒙格尔,1 罗德里戈·戈雅,1 凯伦·蒙格尔,1 理查德·科贝特,1 纳塔莉·约翰逊,2 泰萨·M·塞弗森,1 邱瑞德曼（Readman Chiu）,1 马修·菲尔德,1 肖恩·杰克曼,1 马丁,1 大卫·W·斯科特,2 黛安娜·L·特里恩,1 杰西卡·塔穆拉-威尔斯,1 萨莉,1 马洛公司,1 萨尼娅·罗吉奇,2 马拉奇·格里菲斯,1 苏珊娜·陈,1 奥列克桑德·雅科文科,1 伊姆特劳德·梅耶,9 埃里克·Y·赵,1 杜安·斯迈卢斯,1 米歇尔·莫克萨,1 Suganthi Chittaranjan公司,1 丽莎·里姆萨,4 安吉拉·布鲁克斯·威尔逊,1,7 约翰·斯皮内利,6中，8 苏珊娜·本·内里亚,2 芭芭拉·梅斯纳,2 布鲁斯·沃尔科克,2 梅里尔·博伊尔,2 海伦·麦克唐纳,1 安吉拉·谭,1 赵永军,1 阿伦·德莱尼,1 托马斯·曾,1 谢霆锋（Kane Tse）,1 亚伦·巴特菲尔德,1 Inanc Birol公司,1 罗布·霍尔特,1 杰奎琳·谢恩,1 道格拉斯·霍斯曼,2 毛利小五郎,1 史蒂文·琼斯,1 约瑟夫·康纳斯,2 马丁·赫斯特,1 兰迪·D·加斯科因,2,5和马可·马拉§,1,三
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关联数据

补充资料

摘要

滤泡性淋巴瘤（FL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是两种最常见的非霍奇金淋巴瘤（NHL）。为了确定B细胞NHL突变基因，我们对肿瘤进行了测序，并匹配了13例DLBCL和1例FL患者的正常DNA。我们分析了这些NHL和其他113个NHL的RNA-seq数据，以确定具有候选突变的基因，然后对这些病例中的肿瘤进行重新排序并匹配正常DNA，以确认109个具有多个体细胞突变的基因。组蛋白修饰基因是体细胞突变的常见靶点。例如，32%的DLBCL和89%的FL患者在MLL2级，编码组蛋白甲基转移酶。11.4%的DLBCL和13.4%的FL患者在MEF2B型是一种钙调节基因，在乙酰化组蛋白中与CREBBP和EP300合作。因此，我们的分析表明，淋巴图像病中染色质生物学的破坏是以前未被重视的。

关键词：H3K27、H3K4、HDAC、HAT、癌症基因组学、甲基化、乙酰化、EZH2、驱动因素、癌症测序

介绍

非霍奇金淋巴瘤（NHL）是B、T或自然杀伤淋巴细胞的癌症。在北美每年新诊断的B细胞淋巴瘤中，滤泡性淋巴瘤（FL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）这两种最常见的NHL占60%1FL是一种无痛且典型的不治之症，其特征是临床和遗传异质性。DLBCL具有攻击性，同样具有异质性，至少包含两种不同的亚型，对标准治疗的反应不同。FL和DLBCL的生发中心B细胞（GCB）起源细胞（COO）亚型均来源于生发中心B细胞，而表现出更具侵略性临床病程的活化B细胞（ABC）被认为来源于已经退出或即将退出生发中心的B细胞2目前对导致DLBCL和FL的特定遗传事件的了解仅限于存在一些复发性遗传异常2例如，85-90%的FL和30-40%的GCB DLBCL病例三,4harbort t（14；18）（q32；q21），导致BCL2癌蛋白的表达失控。GCB DLBCL特有的其他遗传异常包括c-继电器miR-17-92 microRNA簇的基因和5与GCB病例相比，24%的ABC DLBCL存在结构改变或失活突变，影响项目风险管理1参与将GCB细胞分化为抗体分泌浆细胞6ABC特异性突变也影响调节NF-κB信号的基因7,8,9，使用TNFAIP3（A20）和88马来西亚第纳尔10突变最丰富的分别为24%和39%。为了加深我们对B细胞NHL遗传结构的理解，我们进行了一项研究，以（1）确定体细胞突变，（2）确定FL和DLBCL突变的流行率、表达和局部复发。使用我们和他人应用于癌症基因组和转录组特征分析的策略和技术11,12,13，我们对117个肿瘤样本和10个细胞系的肿瘤DNA和/或RNA进行了测序(补充表S1和S2)并鉴定出651个基因(补充图S1)有证据表明B细胞NHL发生体细胞突变。经过验证，我们发现109个基因在2个或更多的NHL病例中发生了体细胞突变。我们进一步描述了基因突变的频率和性质MLL2级和MEF2B型这些基因是最常见的突变基因之一，之前在淋巴瘤中没有已知的作用。

复发性突变基因的鉴定

我们对14例非霍奇金淋巴瘤患者的基因组或外显子进行了测序，所有病例的结构DNA测序深度相当(补充表S1和S2). 在筛选单核苷酸变体，然后减去已知多态性并目视检查序列读取比对后，我们确定了717个影响651个基因的非同义（编码单核苷酸变体；cSNV）(补充图S1; 方法）。我们在每个基因组中鉴定了20到135个cSNV。在651个携带cSNV的基因中，只有25个基因参与了癌症基因普查（2010年12月发布）14.

我们对这14例NHL病例和113个扩大样本进行了RNA测序（RNA-seq），其中包括83例DLBCL、12例FL和8例B细胞NHL病例以及其他组织学和10例DLBCL-衍生细胞系(补充表S2). 我们分析了这些数据以确定新的融合转录本(补充表S3)和cSNV(图1). 我们在基因组/外显子组或RNA-seq“突变热点”（见下文）中鉴定了240个至少含有一个cSNV的基因，总共至少有三个病例含有cSNV(补充表S4). 我们从这240个基因中的每一个中选择cSNV进行重新测序，以确认其体细胞状态。我们没有对先前记录的淋巴瘤突变（例如。CD79B、BCL2). 我们确认了317个基因中543个cSNV的体细胞状态，其中109个基因至少有两个已确认的体细胞突变(补充表S4和S5). 在从基因组预测的成功重测序的cSNV中，171个（94.5%）被确认为体细胞，7个为假呼，3个存在于生殖系中。这109个反复突变的基因显著富集了与淋巴细胞活化相关的基因（P=8.3×10-4; 例如STAT6、BCL10)，淋巴细胞分化（P=3.5×10-3; 例如卡片11)和凋亡调节（P=1.9×10-3; 例如BTG1、BTG2). 与转录调控相关的基因也显著富集（P=5.4×10-4; 例如TP53型)和参与甲基化的基因（P=2.2×10-4)和乙酰化（P=1.2×10-2)包括组蛋白甲基转移酶（HMT）和乙酰转移酶（HAT），这些酶以前在淋巴瘤（例如。EZH2型13和CREBBP公司15; 方法）。

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NHL体细胞突变靶点的全基因组可视化

我们分析中发现的11个DLBCL基因组中的结构重排和拷贝数变异（CNV）以及109个复发突变基因中的cSNV概述。内弧代表在11个基因组中的一个基因组中鉴定的体细胞融合转录物。在11个DLBCL肿瘤/正常配对中检测到的CNV和LOH显示在同心环组上。内11环显示用蓝色绘制的增强纯合子区域（解释为LOH）。外11环显示体细胞CNV。紫色圆圈表示至少有两个已确认体细胞突变的基因的位置，圆圈直径与该基因中检测到的cSNVs病例数成比例。标记了代表具有显著正选择证据的基因的圆圈。反复突变的基因和增益/损耗区域之间的一致性在标签中用彩色编码（绿色=损耗，红色=增益）。例如企业对企业编码β-2-微球蛋白的基因反复突变，有两例被删除。

突变热点可能是由强选择性压力下的位点突变引起的，我们之前已经使用RNA-seq数据确定了此类位点13。我们搜索了RNA-seq数据中有突变热点的基因，并在14个基因组中确定了10个没有突变的基因(PIM1、FOXO1、CCND3、TP53、IRF4、BTG2、CD79B、BCL7A、IKZF3和企业对企业)，其中五个(FOXO1、CCND3、BTG2、IKZF3和B2M)不是以前已知的NHL点突变靶点(补充表S6; 方法）。FOXO1、BCL7A和企业对企业显示出影响其起始密码子的热点。The effect of aFOXO1系列使用起始ATG突变为TTG的细胞系，进一步研究了在三例患者中观察到的起始密码子突变。用FOXO1抗体进行的蛋白质印迹显示一条分子量减少的带，表明FOXO1N末端截断(补充图S2)与使用下一帧内ATG启动翻译一致。第二个热点FOXO1系列2例T24位点突变。据报道，在B细胞受体（BCR）刺激后，T24被AKT磷酸化16诱导FOXO1核出口。

我们分析了RNA-seq数据，以确定109个反复突变基因中的任何体细胞突变是否显示出等位基因不平衡，表达偏向于一个等位基因。在380个表达杂合突变等位基因中，我们观察到突变优先表达16.8%（64/380），野生型优先表达27.8%（106/380；补充表S7). 至少在两种情况下，有七个基因显示出突变等位基因的显著优先表达：(BCL2、CARD11、CD79B、EZH2、IRF4、MEF2B和TP53型; 方法）。43例患者中有27例BCL2级cSNV的表达倾向于突变等位基因，这与之前描述的假设一致，即易位（因此，转录解除调控）等位基因BCL2级以体细胞超突变为目标17已知致癌热点位置（如F123I）的突变示例卡片1118在某些情况下，表现出有利于突变等位基因的等位基因失衡。类似地，我们注意到表达有利于两种新的热点突变MEF2B型（Y69和D83）和EZH2型此前未报道淋巴瘤（A682G和A692V）发生突变。

我们试图使用Greenman提出的方法来区分新的癌症相关突变和乘客突变等19我们推断，这将揭示具有强烈选择特征的基因，而这些基因的突变将是很好的候选癌症驱动因素。我们鉴定了26个具有显著阳性选择证据的基因（FDR 0.03，Methods），这些基因要么存在获得非同义点突变的选择压力，要么存在截断/无义突变（Methods；表1;补充表S8). 包括已知的淋巴瘤致癌基因(BCL2、CD79B9,卡片1118,88马来西亚第纳尔10和EZH2型13)，所有这些都表现出指示选择非同义变体的特征。

表1

cSNV概述和最常见突变基因的体细胞突变

案例总计
基因NS公司S公司T型NS公司S公司T型体细胞cSNV（RNA-seq队列）*P（生）q个NS SPT SP（T SP）倾斜（M、WT、两者）***
MLL2级†1681717818106.85×10-88.50×10-70.83414.4重量
TNFRSF14型G公司†717817116.85×10-88.50×10-77.52118二者都
新加坡元1G公司†18663710696.85×10-88.50×10-719.561.7-
BCL10（BCL10）†204三0446.85×10-88.50×10-73.62112重量
GNA13号机组G公司†2112331256.85×10-88.50×10-724.125.7二者都
TP53型G公司†202123三1226.85×10-88.50×10-715.614.1二者都
EZH2型G公司†33003300336.85×10-88.50×10-711.40二者都
基站2†1261146126.85×10-88.50×10-723.935.1-
BCL2级G公司†42450961050439.35×10-88.50×10-73.780M（M）
BCL6号机组†**1120122029.35×10-88.50×10-70.1750M（M）
CIITA公司†**5三06三029.35×10-88.50×10-70.0860
船边交货†204三0421.52×10-71.17×10-62.5466.5重量
英国电信1号†11621172101.52×10-71.17×10-617.552.5二者都
MEF2B型G公司†20202020102.05×10-71.47×10-614.20M（M）
IRF8型†115三145三三4.55×10-73.03×10-68.8228.2重量
TMEM30A型†10410446.06×10-73.79×10-60.78565重量
CD58型†20三20三22.42×10-61.43×10-52.2969.2-
KLHL6号机组†1022122241.00×10-55.26×10-55.4216.4-
88马来西亚第纳尔A类†1320142091.00×10-55.26×10-512.40重量
CD70型†501502三1.70×10-58.48×10-57.0844-
CD79B型A类†72192152.00×10-59.52×10-510.918.3M（M）
CCND3号机组†71271262.80×10-51.27×10-46.5536.3重量
CREBBP公司†2074247491.00×10-44.35×10-42.726.04二者都
HIST1H1C公司†900100061.80×10-47.50×10-411.90二者都
企业对企业†70070043.90×10-41.56×10-316.60重量
ETS1型†1010101044.10×10-41.58×10-35.760重量
卡片11†14三014三0三1.90×10-37.04×10-33.370二者都
工厂验收试验2†**21021026.30×10-32.25×10-20.1280-
IRF4型†**940265057.00×10-32.41×10-20.5690二者都
FOXO1系列†840104047.60×10三2.53×10-24.020-
STAT3（状态3）90090042.19×10-26.08×10-2--二者都
RAPGEF1型8三010三0三2.98×10-27.45×10-2--重量
ABCA7公司12三015三027.76×10-21.67×10-1--重量
RNF213号机组1080108027.87×10-21.67×10-1---
MUC16型171203925028.32×10-21.73×10-1---
HDAC7型84084028.94×10-21.82×10-1--重量
PRKDC公司7三074021.06×10-12.05×10-1---
SAMD9公司92092021.79×10-13.01×10-1---
TAF1型1000100023.03×10-14.74×10-1---
PIM1型2019033340113.40×10-15.23×10-1--重量
COL4A2系列82082027.64×10-18.99×10-1---
EP300型871871三9.54×10-11--重量

非同义（NS）、同义（S）和截断（T）突变的个别病例以及每类突变的总数分别显示为同一病例中某些基因包含多个突变。粗体显示的P值是用Greenman等人描述的方法确定的该基因的P值的上限（见方法）19，q是Benjamini校正的q值，NS、SP和T SP分别是指从该模型中获取非同义或截断突变的选择性压力估计值。

†FDR为0.03时显著的基因。BCL2中的SNV和先前确认的热点突变EZH2型和CD79B型根据其他人发表的观察结果，这些样本中可能存在体细胞。
*在较大队列中发现的其他体细胞突变和插入/缺失突变不包括在总数中。
**选择性压力估计值均小于1，表明对该基因起作用的是净化选择而非正选择。
***“both”表示我们观察到个别情况下出现了表达偏斜，但这种偏斜与突变或野生型等位基因不一致。上标为a或G的基因分别在ABC或GCB病例中显著富集（P<0.05，Fisher Exact检验）。

选择失效变更的证据

我们预计肿瘤抑制基因在获得无义突变方面表现出强烈的选择性。在我们的分析中，8个最重要的基因包括7个对无义突变具有强烈选择性压力的基因，包括已知的肿瘤抑制基因TP53型和TNFRSF14型20(表1).CREBBP公司，最近报告为DLBCL中常见的失活15，也显示了获得无义突变和cSNV的一些证据(补充图S3；补充表S9). 我们还观察到无义突变在BCL10（BCL10）一种NF-κB的阳性调节物，在淋巴瘤中描述了致癌截断产物21.其余的极显著基因(BTG1、GNA13、SGK1和MLL2级)在淋巴瘤中没有报道作用。GNA13号机组受22例突变影响，包括多个无义突变。GNA13号机组编码负责调节RhoA活性的异源三聚体G蛋白偶联受体的α亚单位22.一些突变残基对其功能产生负面影响23,24，包括T203A突变，该突变也表现出有利于突变等位基因的等位基因失衡(补充表S7). 在含有无义突变、终止密码子缺失、移码缺失或影响剪接位点变化的细胞系中，GNA13蛋白在Western blot上减少或缺失（方法；补充图S4).

新加坡元1编码PI3K调节激酶，具有调节FOXO转录因子的功能25，通过磷酸化IkB激酶调节NF-κB26和NOTCH信号的负调节27.新加坡元1也存在于DLBCL中通常缺失的6号染色体区域内(图1)5.其机制新加坡元1和GNA13号机组失活可能导致淋巴瘤尚不清楚，但对其失活的明显选择程度很强，且其整体高突变频率（每106例DLBCL中有18例发生突变）表明，其缺失可能导致B细胞NHL。已知某些基因在GCB DLBCL中更常见的突变（例如。TP53型28和EZH2型13). 这里，两个新加坡元1和GNA13号机组仅在GCB病例中发现突变（P=1.93×10-3和2.28×10-4Fisher精确检验；n=15和18）(图2). 另外两个基因(MEF2B型和TNFRSF14型)在DLBCL中没有先前描述的角色，显示出与GCB病例类似的限制(图2).

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非霍奇金淋巴瘤突变和潜在合作相互作用概述

该热图显示了体细胞突变和结构重排的共现（红色）和互斥（蓝色）的可能趋势。通过左尾和右尾Fisher精确测试的最小值分配颜色。为了捕捉趋势，使用了0.3的P值阈值，颜色的最深阴影表示符合统计学意义（P<0.05）。左侧显示了ABC（蓝色）、GCB（红色）、不可分类（黑色）DLBCL和FL（黄色）病例的相对突变频率。基因排列为ABC病例（蓝色三角形）突变显著富集（P<0.05，Fisher精确检验）的向上（和左侧）和GCB病例（红色三角形）突变明显富集的向下（和右侧）。顶部显示了每个基因包含cSNV或经证实的体细胞突变的病例总数。蓝色方块簇（右上方）是ABC富集突变相互排斥的结果（例如。MYD88、CD79B)从富含GCB的突变（例如。EZH2、GNA13). 存在涉及两个癌基因的结构重排2006年和BCL2级（表示为BCL6s和BCL2s）通过FISH技术利用断裂部分探针进行测定（方法）。

正在停用MLL2级突变

MLL2级显示了最重要的选择证据和最多的无意义SNV。我们的RNA-seq分析表明，26.0%（33/127）的病例携带至少一种MLL2级cSNV公司。为了解决可变RNA-seq覆盖率MLL2级未能捕获一些突变，我们PCR扩增了整个MLL2级89例患者（35个原发性FLs、17个DLBCL细胞系和37个DLBCLs）的基因座（~36kb）。其中58例属于RNA-seq队列。Illumina扩增子重测序（方法）揭示了78个突变，证实了重叠病例中的RNA-seq突变，并确定了33个额外突变。我们使用Sanger测序法确认了46个变异体的体细胞状态(补充表S10)，并显示33个额外突变中有20个是插入或缺失（indels）。剪接位点也检测到三个SNV，还有10个新的cSNV没有被RNA-seq检测到。

体细胞突变分布在MLL2级(图3A). 其中37%（n=29/78）为无义突变，46%（n=36/78）为改变阅读框的indels，8%（n=6/78）是剪接位点的点突变，9%（n=7/78）是非同义氨基酸替换(表2). 四个体细胞剪接位点突变对MLL2级转录长度和结构。例如，两个杂合剪接位点突变导致使用了一个新的剪接供体位点和一个内含子保留事件。

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影响体细胞突变的总结和影响MLL2级和MEF2B型

（A） 重新排序MLL2级89个样本的基因座主要表现为无意义（红圈）和移码诱导的indel突变（橙色三角形）。还观察到少量影响剪接位点（黄星）的非同义体细胞突变（绿圈）和点突变或缺失。所有非同义点突变都影响催化SET结构域、FYRC结构域（“富FY-C末端结构域”）或PHD锌指结构域中的残基。这些剪接位点突变对MLL2级还探索了剪接(补充图S7). （B） 发现的cSNV和体细胞突变MEF2B型在所有FL和DLBCL病例中，用相同的符号示出了测序。只有在至少两名患者中含有变异的氨基酸才被标记。cSNV在MEF2B的前两个蛋白编码外显子（外显子2和3）中最常见。与EP300结合的MEF2的晶体结构支持这样的观点，即两个突变位点（L67和Y69）在这些蛋白质之间的相互作用中很重要(补充图S8；补充讨论)50.

表2

类型摘要MLL2级体细胞突变

样品类型佛罗里达州DLBCL（DLBCL）DLBCL单元线成中心细胞
截断18470
带移帧的索引22860
拼接现场4200
SNV公司三220
任何突变（病例数）31/3512/3710/170/8
百分比89%32%59%0%

我们测序的NHL病例中大约有一半有两例MLL2级突变(补充表S10). 我们对8例FL患者进行了BAC克隆测序，以表明在所有8例患者中，突变均位于反式，影响两者MLL2级等位基因。这一观察结果与以下概念一致：MLL2级在这些病人的肿瘤细胞中。

除了两个原发性FL病例和两个DLBCL细胞系（Pfeiffer和SU-DHL-9）MLL2级突变似乎是杂合的。对两例具有明显纯合子突变的FL患者的Affymetrix 500k SNP序列数据进行分析，结果表明，这两种肿瘤在12号染色体包含MLL2级（方法）。因此，除了双等位基因突变外，LOH是第二种机制，尽管其不太常见MLL2级功能丢失。

MLL2级是FL中最常见的突变基因，也是DLBCL中最常见突变基因之一(图2). 我们确认了MLL2级35例FL患者中的31例（89%）、37例DLBCL患者中的12例（32%）、17例DLBCL细胞系中的10例（59%）以及我们测序的8例正常中心体样本中无一例发生突变。我们的分析预测MLL2级正在失活（91%破坏了阅读框或截断了点突变），这向我们表明MLL2级是NHL中重要的肿瘤抑制因子。

复发性点突变MEF2B型

我们的选择性压力分析还显示，与无义突变相比，氨基酸替代的获得压力更大的基因。其中一个基因是MEF2B型之前未与淋巴瘤相关。20例（15.7%）患者MEF2B型cSNV和4例（3.1%）患者MEF2C公司cSNV。RNA-seq检测到的所有cSNV都影响MADS盒或MEF2域。确定MEF2B型我们对261例原发性FL样本的外显子2和3进行了Sanger测序；259例DLBCL原发肿瘤；17个细胞株；各类NHL 35例（IBL、复合FL、PBMCL）；和8个非恶性中心粒细胞样本。我们还使用捕获策略（方法）对整个MEF2B型261个FL样本中的编码区，揭示了外显子2和3之外的六个额外变体。因此，我们确定了69例（34例DLBCL；12.67%和35例FL；15.33%）MEF2B型cSNV或indels未能在其他NHL和非恶性样本中观察到新的变异。55（80%）个变体影响MADS盒和外显子2和3编码的MEF2结构域内的残基(补充表S11;图3B). 每个患者通常都有一个MEF2B型我们观察到相对较少（总共8个，10.7%）的截短诱导SNV或indels。到目前为止，非同义SNV是观察到的最常见的变化类型，59.4%的检测到的变异影响K4、Y69、N81或D83。12例MEF2B型突变显示为体细胞突变，包括K4、Y69、N81和D83的代表性突变(补充表S12). 我们没有检测到ABC病例中的突变，这表明MEF2B型在GCB DLBCL和FL的发展中发挥独特的作用(图2).

讨论

在我们对127例B细胞NHL病例的基因组、转录组和外显子组序列的研究中，我们鉴定了109个基因，这些基因在多个个体中有明确的体细胞突变证据。显著的选择似乎作用于其中至少26个，以获得无意义或错义突变。据我们所知，这些基因中的大多数以前没有与任何癌症类型相关。我们观察到影响转录调控基因的体细胞突变增多，更具体地说，是染色质修饰。

MLL2级从我们的分析中发现，它是NHL中的一个主要肿瘤抑制基因座。它是六种人类H3K4特异性甲基转移酶之一MLL公司所有这些都与果蝇属三胸基因29三甲基化H3K4（H3K4me3）是与活性转录基因启动子相关的表观遗传标记。通过设置这个标记，MLL负责发育基因的转录调控，包括同源异型盒（Hox）基因家族30它们共同控制发育中胚胎的片段特异性和细胞命运31,32每个MLL家族成员被认为针对不同的Hox基因亚群33此外，已知MLL2可调节多种基因的转录34。最近，MLL2级小细胞肺癌细胞系发生突变35和肾癌36但无意义突变的频率影响MLL2级这些报告没有证实这些癌症。Parsons及其同事最近报道了MLL2级或MLL3级16%的髓母细胞瘤患者37进一步牵连MLL2级作为一种癌症基因。

我们的数据链接MLL2级B细胞NHL的体细胞突变。报告的突变很可能是失活的，在8例多重突变病例中，我们证实两个等位基因都受到影响，可能导致MLL2功能基本完全丧失。The high prevalence ofMLL2级FL突变（89%）等于t（14；18）（q32；q21）易位的频率，这被认为是FL中最常见的遗传异常三在DLBCL肿瘤样本和细胞系中，MLL2级突变频率分别为32%和59%，也超过了最常见的细胞遗传学异常的流行率，例如涉及3q27的各种易位，这些易位发生在25-30%的DLBCL中，并在ABC病例中富集38重要的是，我们发现MLL2级两种DLBCL亚型均发生突变(图2). 因此，我们的分析表明MLL2级在FL和两种DLBCL亚型中充当中心肿瘤抑制物。

这个MEF2型该基因家族编码四种相关转录因子，以钙调节的方式招募组蛋白修饰酶，包括组蛋白脱乙酰酶（HDAC）和HAT。虽然在我们的分析中检测到截断变体MEF2型基因家族成员，我们的分析表明，与MLL2、MEF2家族成员倾向于选择性地获得非同义氨基酸取代。在以下情况下MEF2B型，59.4%的cSNVs在蛋白质内的四个位点（K4、Y69、N81和D83）发现，并且这些位点中的所有四个都被证实是体细胞突变的靶点。39%的MEF2B型这些改变影响D83，导致用丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸替换带电的天冬氨酸。虽然我们还无法预测这些替代对蛋白质功能的影响，但它们的作用可能会影响MEF2B促进基因表达的能力，从而在促进生发中心B细胞向淋巴瘤的恶性转化中发挥作用(补充讨论).

MEF2B型突变可能与CREBBP公司和EP300型突变和复发性Y641突变EZH2型13CREBBP/EP300 HAT活性的一个靶点是H3K27，它被EZH2甲基化以抑制转录。有证据表明EZH2的作用对抗CREBBP/EP300的作用39MEF2的一个功能是招募HDAC或CREBBP/EP300来靶向基因40有人建议HDAC与CREBBP/EP300竞争MEF2上的相同结合位点41.正常Ca下2+MEF2与IIa型HDAC结合，使组蛋白尾部保持在脱乙酰抑制染色质状态42.胞浆钙增加2+水平诱导HDAC的核输出，使HAT（如CREBBP/EP300）的招募成为可能，促进MEF2靶基因的转录。的突变爬行器，EP300或MEF2B型由于这些基因附近核小体乙酰化减少，可能影响MEF2靶基因的表达(补充图S5；补充讨论). 根据最近的发现，杂合子EZH2型Y641突变增强PCR2的整体H3K27三甲基化活性43,44，可能两者的突变MLL2级和EZH2型可以合作减少一些相同靶基因的表达。我们的数据表明：（1）组蛋白的转录后修饰在生发中心B细胞中至关重要；（2）由于这些突变而引起的组蛋白修饰被解除管制可能导致乙酰化减少和甲基化增强，并在NHL的发展中起核心驱动事件的作用(补充图S5).

方法总结

所有分析的样品中都含有至少50%的肿瘤细胞。使用Illumina GAIIx和HiSeq 2000仪器组合对基因组、外显子和转录组进行测序，以读取36到100个核苷酸的长度。外显子捕获是使用安捷伦SureSelect靶点富集系统协议（版本1.0，2009年9月）执行的。使用BWA完成校准45并使用SNVmix鉴定变异体46对IGV中的变异体进行手动审查，并通过PCR（如适用）进行确认，然后进行Sanger测序或Illumina重新测序。使用ABySS鉴定基因组和转录组中的结构重排47用于亚型分配的基因表达值计算为RPKM值48根据Affymetrix表达阵列数据开发的方法，对亚型进行了调整49使用之前按此标准方法分类的样本进行训练。

补充材料

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致谢

本研究的部分资金来源于国家癌症研究所癌症基因组办公室（合同号HHSN261200800001E）、特里·福克斯基金会（019001号赠款，癌症生物学：淋巴瘤基因组分析的见解）、，Genome Canada/Genome BC Grant Competition III（项目名称：滤泡淋巴瘤基因组的高分辨率分析）授予J.M.C.、R.D.G.和M.A.M.。我们感谢NIH赠款P50CA130805-01“淋巴瘤中的SPORE，组织资源核心（PI Fisher）”的支持和1U01CA114778“改善淋巴瘤诊断和预后的分子特征（PI Chan）”。A.J.M.是白血病和淋巴瘤协会职业发展项目研究员。N.A.J.是特里·福克斯基金会（NCIC 019005奖）和迈克尔·史密斯健康研究基金会（ST-PDF-01793）的研究员。M.A.M.是特里·福克斯（Terry Fox）的年轻调查员和迈克尔·史密斯（Michael Smith）的高级研究学者。R.D.M是Vanier学者（CIHR），持有MSFHR高级研究生学位。M.M.L感谢西班牙教育部博士后奖学金项目“2008-2011年国家I-D+I计划”的支持。D.W.S得到了加拿大卫生研究院Terry Fox基金会癌症研究战略健康研究培训项目（批准号TGT-53912）的支持。JJS获得了加拿大癌症协会和加拿大卫生研究院的认可资金。RG由UBC四年奖学金资助。IMM承认加拿大领导人机会基金创新基金会。本研究的实验室工作由基因组科学中心、不列颠哥伦比亚省癌症研究中心和转化与应用基因组中心承担，该中心是省级卫生服务局实验室的一个项目。作者感谢Chris Greenman博士提供了他的软件，并感谢Daniela Gerhard博士和Samuel Aparicio博士的有益讨论和指导。特别感谢Cecelia Suragh、Robyn Roscoe、Armelle Troussard和Adrienne Drobnies提供的专家项目管理协助，以及基因组科学中心的图书馆建设、测序和生物信息学团队。本出版物的内容不一定反映卫生与公共服务部的政策观点，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。可以使用DCC门户访问所有原始序列数据(http://cgap.nci.nih.gov/数据访问)，研究登录phs000235.v2.p1。

脚注

作者贡献：MAM、RDG、DEH、MH和JMC构思了该研究并领导了实验设计。RDM对序列数据进行了分析，确定了突变，并与MML、AJM和MAM一起制作了数字并撰写了手稿。MML、AJM、DLT、SC、SC、DS、HM、JS、MM、TZ、AD、KT、YB、MF、JTW和TMS设计并进行了扩增、发现和验证突变的实验。RG、MG和IMM参与分析并审阅了手稿。NAJ、MB、BW和BM准备了样本，进行了样本分类和COO分析，并对文本做出了贡献。ABW和JJS收集并制备了宪法DNA样本。生成KLM、RC、SL、MF和SJ从头开始组装和鉴定突变。MK、SR、MG、OY和EYZ编写了软件并为Figures做出了贡献。RC进行拷贝数分析并生成Figure，SBN进行验证性FISH实验。YZ和AT产生了测序库。IB、RH、SJMJ、RM、JS、MH为实验和分析方案的开发做出了贡献。LR提供了材料并审阅了手稿。

作者声明没有竞争性的经济利益。

提交的SRA登录号为SRP001599，与dbGAP研究登录号phs000235.v2.p1链接。

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