跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
大脑血流代谢杂志。2011年11月；31(11): 2243–2254.
2011年6月29日在线发布。 数字对象标识：10.1038/jcbfm.2011.95年
预防性维修识别码：项目经理3210348
PMID：21712834

皮质升静脉阻塞导致血流减少，流向逆转，上游毛细血管扩张

约翰·古云,1 Nozomi Nishimura公司,1 罗伯特·费乔,1 科斯坦蒂诺·伊德科拉,2和克里斯·B·谢弗1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

小中风的累积与认知功能障碍有关。虽然大多数动物模型都关注小动脉闭塞的影响，但临床证据表明小静脉闭塞也可能很重要。我们使用双光子激发荧光显微镜量化单个上升或表面皮质微静脉闭塞后毛细血管中的血流和血管直径变化，作为被测毛细血管和闭塞微静脉之间连接的函数。飞秒激光脉冲损伤靶血管壁可诱导凝血。上行小静脉（AV）闭塞后，上游毛细血管血流速度降低，流向逆转率高，血管直径增大。表面微静脉闭塞产生了类似的效果，除非侧支微静脉提供了新的引流。最后，我们发现AV和穿透性小动脉具有不同的最近邻间距，但其分支的毛细血管具有相似的拓扑结构，这两者共同预测了其中一个闭塞后血流减少的严重程度和空间范围。这些结果为皮层小静脉闭塞产生的广泛血液动力学变化提供了详细的见解，并可能有助于阐明小静脉闭塞在认知障碍和其他脑疾病发展中的作用。

关键词：侧支循环、血流动力学、非线性显微镜、中风、血管调节

介绍

越来越多的证据表明，脑静脉功能不全可能与许多脑部疾病有关。皮质灰质、脑室周围和皮质下白质的小面积缺血损伤与认知功能障碍的发生有关(科瓦里等, 2004;莫（Mok）等, 2004;维米尔等2003年). 这些病变以前被认为是小动脉血栓或出血(费希尔，1965年)最近也发现与小静脉病理学和闭塞相关(黑色等, 2009;穆迪等, 1995). 此外，静脉闭塞长期以来被认为在多发性硬化症中起主要或次要作用(普特南，1937年;Singh和Zamboni，2009年). 然而，部分由于现有微血管闭塞动物模型的局限性，人们对小静脉闭塞对脑血流动力学的影响知之甚少。

此前的研究主要集中于大脑静脉血栓形成导致的血流赤字。上矢状窦闭塞(Ungersbock公司等, 1993)和它的桥脉(Nakase公司等, 1997一, 1997b条)在动物模型中，皮下毛细血管的血流量严重减少，导致缺血性梗死。对上矢状窦闭塞的其他研究表明，当存在更多桥接静脉时，血流减少的程度并没有那么严重，这表明血管拓扑结构可能对血流重新分布至关重要(上田等, 2000). 尽管这些研究提供了对大表面静脉血栓形成影响的见解，但用于阻塞这些大血管的技术并不能转化为小（<50μm直径）表面微静脉（SV）或上行微静脉（AV）。飞秒激光烧蚀的最新发现(沃格尔等, 2005)可用于启动单个血管的凝血，从而可以靶向阻断单个皮质穿透小动脉（PA）(西村等, 2007,2010)和毛细血管(西村等, 2006). 这种非线性光学技术是一种理想的工具，用于在靶向皮层小静脉中产生闭塞，以研究大脑血管中的小静脉血栓是否会导致生理上重要的血流赤字。

在本研究中，我们量化了单微静脉闭塞对大鼠新皮质血流的影响。我们使用飞秒激光消融损伤内皮细胞并诱导靶向小静脉内凝血，并使用双光子激发荧光（2PEF）显微镜研究所产生的血流和血管直径变化，以及与闭塞血管的拓扑分离和空间距离的关系。我们发现，单个AV闭塞导致靶向小静脉上游毛细血管的血流量急剧减少，血管直径增加。SV闭塞后观察到类似的结果，但当存在提供新引流的表面侧支血管时，流量减少几乎消失。我们绘制了600×600×500的皮质微血管拓扑图μ米三-确定体积大小，并使用这些数据预测AV闭塞后血流减少的空间范围和严重程度，发现这些预测与体内测量。这些结果突出了血管拓扑结构在确定血管闭塞导致的血流重排方面的主导作用，并首次提供了新皮质微静脉闭塞导致的全面定量血流重排图片。

材料和方法

动物和外科手术

在27只雄性Sprague-Dawley大鼠（Harlan Inc.，South Easton，MA，USA）上进行实验，质量范围为265至375g。在16只动物中诱导上升小静脉闭塞，在8只动物中诱导SV闭塞（有侧支血管：3只，无侧支血管：5只），其余用于假实验。每只动物只有一个小静脉被闭塞。所有大鼠均用氨基甲酸乙酯麻醉（1.5 g/kg大鼠），并肌肉注射糖焦酯（0.5 mg/kg大鼠）以帮助防止分泌物。使用由直肠温度计控制的加热毯将体温保持在37°C（50-7053；美国马萨诸塞州霍利斯顿市哈佛仪器公司）。使用夹在大鼠后爪上的脉搏血氧仪（MouseOx；Starr Life Sciences Corp.，Oakmont，PA，USA）监测心率和动脉血氧饱和度。通过每小时皮下注射5%葡萄糖（wt/vol）生理盐水（1 mL/kg大鼠）维持水合作用。每隔20分钟手动记录一次生理参数，以确保大鼠的生理状态稳定。

进行颅骨切开术以获得大脑的光学通路。皮下注射0.1 mL布比卡因（去离子水中0.125%wt/vol），以减轻切口部位的疼痛。A～3×6毫米2在顶叶皮质上开颅，取出硬脑膜。然后在人工脑脊液中用1.5%琼脂糖（A9793；Sigma，St Louis，MO，USA）覆盖大脑(Kleinfeld和Delaney，1996年)在开颅手术上方放置一个直径为8 mm、编号为1.5的玻璃盖玻片（50201；美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司），并使用牙科粘接剂（Co-Oral-Ite dental Mfg Co.）进行密封。为了使用2PEF显微镜观察血管系统，我们在生理盐水中静脉注射约0.3 mL 5%（wt/vol）的2-MDa荧光素结合右旋糖酐（FD2000S；Sigma）。所有动物护理和实验程序均由康奈尔大学动物护理和使用委员会批准。

皮层血管的双光子成像

体内使用定制设计的2PEF显微镜获得图像，该显微镜使用由钛宝石振荡器（Mira-HP；Coherent Inc.，加州圣克拉拉，美国）产生的低能量、100-fs、800-nm、76-MHz重复频率脉冲序列，该振荡器由连续波二极管泵浦固体激光器（Verdi-V18；Coheren Inc.）泵浦。使用MPSCOPE软件控制数据采集和激光扫描(阮（Nguyen）等, 2006). 荧光通过以517nm为中心的干涉滤光片检测，带通为65nm。使用0.28数值孔径×4倍放大空气物镜（美国宾夕法尼亚州中央山谷奥林巴斯）获取整个颅骨窗口的图像。在这些大面积的2PEF图像中，识别了表面血管，并追踪了上游的大静脉，以识别闭塞的候选AV和SV(图1A). 高分辨率成像使用0.95数值孔径、×20放大倍数的浸水物镜（Olympus）(图1B)测量血管直径和血流速度(图1C)和血管阻塞(图2).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为jcbfm201195f1.jpg

2PEF显微镜用于绘制大鼠皮层血管系统的连通性，并测量单个血管的血管直径和血流速度。(A类)荧光标记血管的2PEF图像堆栈的平均投影。表面（穿透）小动脉和表面（上行）小静脉分别用红色和蓝色线条（圆圈）表示。白色框表示放大区域，如B类。标有R和L的箭头分别表示吻侧和侧向。(B类)100系列-μ2PEF图像堆栈从大脑表面到400深度的m厚平均投影μm.在每一个图像投影中，都会勾勒出选定的表面和次表面血管，表明血管直径和血流速度量化的血管网络。白色箭头表示目标AV。(C类)单个毛细血管的平均2PEF图像，用于沿着选定的段（红框）测量血管直径（i），流经毛细血管的红细胞的单个2PEF图框，带箭头指示线性扫描路径（ii），以及来自线扫描的相应时空图像，从中可以确定血流速度（iii）。(D类)面板中追踪的血管网络的基线直径和血流速度测量B类，其中箭头表示血流方向，星号标记的值对应于面板中测量的毛细管C类.颜色编码表示容器深度。该网络中的AV闭塞以及由此引起的血管直径和血流变化如所示图2和​和3，三分别是。AV，升小静脉；2PEF，双光子激发荧光。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为jcbfm201195f2.jpg

通过飞秒激光光解引发的凝血，靶向阻断皮质升静脉。(A类)小静脉凝血过程示意图。(B类)AV闭塞示例。左侧示意图中的灰色平面表示成像平面，红色“X”表示AV中靶向消融的位置。右侧的图像显示了曲面段（顶部）和20的延时序列-μm深的上升段（底部）。这个例子显示了AV通过消融血管的上升段（大约位于第一分支毛细血管和大脑表面之间的一半）而形成的凝血。在基线检查时，靶向小静脉的上升段和表面段有明显的红细胞流动。用100-nJ脉冲照射上升段的血管壁，直到我们观察到荧光标记的血浆外渗，表明血管壁受损（15分钟）。沿着血管壁进一步损伤，直至形成凝块，观察到上升段和表面段的红细胞运动完全停止（45分钟）。附近的表面血管没有凝结，保持流动。AV，升小静脉。

靶微静脉周围的血管系统用1绘制-μm间距的图像堆栈。这些高分辨率图像堆栈用于绘制被测血管和靶微静脉之间的拓扑关系和空间距离(图1B). 通过平均至少10个电影帧并手动选择血管段来测量直径。然后对所选区域进行阈值分割（最大强度的20%），并将所选分段长度上的平均宽度计算为血管直径(图1Ci). 通过跟踪红细胞的运动来获得中心线红细胞（RBC）的速度，这些红细胞不吸收静脉注射的染料，在血管内显示为黑色斑块(图1Cii). 沿着血管轴线以1.7 kHz的频率重复扫描约1分钟，以形成时空图像，其中移动的红细胞产生斜率等于速度倒数的条纹(图1Cii; 所有测量容器的特征直径和RBC流速如所示补充图1). 使用自动图像处理算法计算斜率(夏弗等, 2006). 然后将测量的参数映射到包括靶向小静脉在内的血管网络(图1D).

容器标识

上行小静脉被定义为垂直方向的皮下血管，将血液从毛细血管床输送到大脑表面，这一点通过血流方向的测量得到了证实。AV下游和脑表面的血管被定义为SV。此外，还发现了在大脑表面形成网状网络的表面小动脉和垂直向大脑输送血液的动脉(图1A). PA为一个广泛的毛细血管网络供电，最终连接并排入AV。我们将PA和AV之间的所有皮下血管定义为毛细血管。我们通过计算被测血管和被闭塞小静脉之间的血管分支数量，确定了小静脉闭塞后血流和血管直径变化对拓扑分离的依赖性。无法追溯到目标小静脉的测量毛细血管被归类为“未连接”。

在本研究中，我们阻断了单个AV和SV。对于SV实验，我们发现位于AV上游的SV有两种拓扑上不同的血管模式。这两种模式都由两个AV组成，它们合并成一个SV，形成了一个“Y”形的架构（蓝色轮廓；图5A和5B）。这两种模式的区别在于是否存在与另一个SV相连的“附属”SV（分别为紫色线和蓝色虚线；图5A）。在这两种拓扑结构中，合并的小静脉（红色圆圈；图5A和5B）被诱导闭塞，在上游SV和毛细血管中进行血管直径和血流测量。

飞秒激光靶向凝固静脉

飞秒激光脉冲紧紧聚焦在靶血管壁上（靶静脉的特征直径和红细胞流速如图所示补充图2)导致激光能量的非线性吸收，从而导致光破坏(西村等, 2006). 这种损伤引发了天然的凝血级联反应，形成了一个血栓，阻止了靶向小静脉的血液流动(图2A). 由于非线性吸收仅发生在激光强度最高的焦点处，因此光破坏仅限于焦点体积，而周围的血管和组织则完好无损。用由Q开关激光器（Evolution 15；Coherent Inc.）泵浦的钛：蓝宝石再生放大器（Legend 1k USP；Coherent Inc.）产生的50fs、800nm、1kHz脉冲串照射静脉，并由钛：蓝宝石振荡器（Chinhok钛：蓝宝石激光器；Kapteyn Murnane Laboratories Inc.，Boulder，CO，USA，由Verdi-V6泵浦；Coherent公司）。使用自定义2PEF显微镜内的偏振器分束器沿同一光束路径组合2PEF成像和烧蚀激光束，并聚焦到同一平面，从而实现同时成像和烧毁(西村等, 2006). 消融的脉冲能量通过中性密度滤光片变化，血管腔内聚焦的脉冲数量由机械快门控制，最小开启时间为2毫秒（VMM-D4；Uniblitz，Rochester，NY，USA）。对于AV闭塞，靶段始终位于上游毛细血管第一分支上方和大脑表面下方，深度为几十微米。最初，用能量低于预期损伤阈值（～100 nJ，深度～50μm） ●●●●。然后，脉冲数从一个脉冲增加到1000个脉冲，增量为100，直到观察到损伤，这是由血管外荧光标记的血浆外渗指示的。如果没有观察到损伤，则能量增加了～25%，并重复该过程。一旦发生外渗，沿着管腔在多个位置照射血管，直到红细胞停止运动，并观察到靶血管段中的红细胞积聚(图2). 封堵SVs的程序类似，只是由于靶血管位于大脑表面，所以使用的初始激光能量较低。

毛细血管拓扑特征及穿透小动脉或升静脉闭塞后血流变化的空间相关性预测

使用来自另外六只大鼠的双光子激发荧光图像堆栈来量化～4 mm以上AV和PA的位置2大脑表面（图6A）并确定最近邻区的分离(补充图7). 在三只动物身上，我们追踪到所有血管的连通性在～0.1-mm范围内三使用定制软件的脑组织体积（图6B）。从这些数据中，我们量化了毛细血管段与最近的AV（2153个毛细血管）或PA（2203个毛细血管。然后，我们测定了毛细血管分支数的分布，作为50例患者中PA和AV距离的函数-μm径向料仓。我们使用体内本研究AV闭塞和先前PA闭塞的血流变化数据(西村等, 2010)为了确定闭塞AV或PA引起的不同毛细血管分支的平均血流减少量。结合毛细血管分支数分布（图6C）和此流量变化数据，我们预测了标后血流速度变化，作为与闭塞AV和PA距离的函数（图6D）。图6D中生成数据的步骤概述见补充文本.

统计分析

使用箱线图函数（图4A、4E、5C和5E），通过Matlab（The Mathworks，Natick，MA，USA）生成箱线图。使用可变宽度的空间窗口确定毛细血管中RBC流速中位数变化（图4B）、逆转率（图4D）和平均血管扩张（图4F）与闭塞AV距离的关系，该窗口限制为包含20个数据点。趋势线用20进一步平滑-μm移动平均值，并且计算关于趋势线的95%置信区间。

差异被认为对P（P）-值<0.05。对于非参数数据，采用Dwass–Steel–Critchlow–Fligner（英国柴郡Altrincham StatsDirect）多重比较测试（图4A和5C）进行基于等级的分析，而采用Tukey–Kramer（StatsDirect）多重比较试验（图4E、5E和7B）分析正态分布数据。对于二项式数据，使用带有Bonferroni调整的二项式比例检验计算统计差异（图4C和5D）。非参数数据报告中值，而正常数据报告均值。

结果

我们对麻醉大鼠的荧光标记血浆进行2PEF成像，以绘制血管拓扑图，并量化AV和SV附近表面血管和毛细血管网络中的血流速度和血管直径，这些血管网络是闭塞的候选对象(图1). 用高能、聚焦紧密的飞秒激光脉冲照射靶向静脉，导致局部血管损伤，导致荧光标记的血浆和红细胞外渗，并引发血管凝血(图2). 附近的表面血管和毛细血管没有凝结，保持流动。然后，我们测量了周围血管网中单个血管因微静脉阻塞而导致的直径和红细胞中心线速度的变化(图3,补充图3和4).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为jcbfm201195f3.jpg

测量闭塞上升小静脉上游毛细血管中红细胞速度和血管直径的变化。2PEF成像(A类)基线和(B类)单个AV凝固后显示：（i）平均投影100-μm深荧光标记血管的图像堆栈和（ii）用于测量单个毛细血管直径和红细胞速度的图像数据。在血栓小静脉附近可见荧光标记的血浆外渗B类（i） 但附近的表面血管系统和下面的毛细血管仍然完好无损。毛细血管有轻微扩张，如图所示A类（ii）和B类（ii）血栓形成后，行线扫描后显示移动的红细胞有更多垂直方向的条纹，表明血流速度显著降低。(C类)AV闭塞后血管网中的血管RBC速度（顶部）和直径（底部），以基线值的百分比表示。靠近靶微静脉的血管在拓扑结构上显著减慢，10个测量血管中有2个反向流动（用双箭头和粗体数字表示），大多数血管直径增加。红色“X”表示凝血AV的位置。标有星号的容器对应于A类（ii）和B类（ii）。该AV的凝血顺序如所示图2AV，升小静脉；红细胞，红细胞；2PEF，双光子激发荧光。

上行静脉阻塞导致上游毛细血管血流速度下降

为了了解AV闭塞对邻近和相连血管中血流的影响，我们研究了血流速度的变化如何依赖于单个血管和闭塞小静脉之间的拓扑连接和空间距离。血栓小静脉上游一至四个分支的毛细血管中的红细胞速度显著下降，闭塞上游一（两）个分支的血管的流速仅为基线值的6%（16%）(图4A). 上游有四个以上分支或未连接到闭塞小静脉的毛细血管的平均速度没有改变，尽管与假实验相比，上游五到七个分支的血管在闭塞后的速度变化增加了9.5倍(图4A;P（P）<1.0E-7，F-test）。闭塞微静脉下游的表面微静脉速度减慢，而平行SV（即流入与凝血血管相同微静脉的血管）的速度没有改变(图4A). 被测毛细血管的红细胞中位数速度在100以内μ闭塞小静脉的m降低到基线值的约26%，并随着与闭塞血管距离的增加而恢复到基线(图4B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为jcbfm201195f4.jpg

上行小静脉闭塞导致血流量减少，流向逆转，上游毛细血管血管直径增加。(A类,C类和E类)AV闭塞后，上游毛细血管和下游表面微静脉的RBC速度（以基线速度的百分比表示）、血流方向（逆流血管的百分比）和血管直径（基线直径的百分比）分别发生变化，这是与闭塞血管拓扑连接的函数。示意图插图显示了血管计数方案，箭头指示基线处的血流方向，红色“X”表示闭塞位置。(B类,D类和F类)红细胞速度、血流方向和血管直径的变化分别与毛细血管闭塞AV的距离有关。面板中的黑线B类(F类)表示运行中值（平均值），而面板中的线D类表示运行分数。在“NC”中拓扑分组的毛细血管表明无法确定与目标血管的连接，“sham”表示没有血管凝固的实验。P和D分别代表平行和下游表面微静脉。在速度和直径图中，菱形（圆圈）表示阻塞后血流方向发生逆转的血管。方框图中的黑线和红线分别表示中位数和平均值。在计算平均值时，排除了用十字线表示的统计异常值。用于指示拓扑连接的颜色编码对于所有适用的面板都是相同的。面板中的灰色阴影区域B类,D类、和F类指出各自趋势线的95%置信区间。面板中未显示三个异常值点（组：4，sham，P；分别为5.9，6.1，5.2）A类和B类.*P（P）<1.0E-7，#P（P）<0.0005,##P（P）<0.005,‡P（P）<0.05; 与假血管相比。AV，升小静脉；NC，未连接；红细胞，红细胞。

上行静脉阻塞后许多上游毛细血管的血流方向逆转

除了血流速度的变化外，我们还观察到AV闭塞后通过毛细血管床的血流路径发生了显著变化。我们经常观察到闭塞小静脉上游一到四个分支的毛细血管的血流方向发生逆转，其中一半以上的第一和第二上游分支的血流方向逆转(图4C). 未连接到闭塞小静脉的毛细血管或下游或平行SV均未反转流向(图4C). 毛细血管内的血流逆转次数随着离闭塞小静脉距离的增加而减少，未观察到血流逆转>650μ距离目标船m(图4D).

上行静脉阻塞后上游毛细血管直径增加

我们进一步研究了AV闭塞对邻近和相连血管直径的影响。我们发现，与假实验相比，靶向小静脉上游的毛细血管在血栓形成后扩张，平均直径增加了～25%(图4E). 进一步上游或未连接到靶血管的毛细血管以及下游和平行SV没有显著扩张(图4E). 扩张量随着离血栓距离的增加而减少，在距离>200的距离处未观察到扩张μ米(图4F).

表面副静脉（如果存在）有助于表面静脉闭塞后维持正常血流

我们还检查了血管拓扑结构中SVs闭塞引起的血流变化(图5A;补充图5)但没有(图5B;补充图6)侧支SV。平均而言，当存在侧支血管时，AV上游的毛细血管一支和二支的血流速度不受SV闭塞的影响，而当没有侧支血管存在时，血流速度平均降低到基线速度的12%(图5C). 只有在没有侧支血管存在的情况下，前两条上游毛细血管才会出现血流逆转(图5D). 只有在没有侧支血管存在的情况下，第一上游毛细血管分支的直径才会增加，而第二上游毛细血管支在有侧支血管和无侧支血管的SV闭塞后扩张(图5E).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为jcbfm201195f5.jpg

副表面微静脉有助于在表面微静脉闭塞后维持上游毛细血管的正常流动。大脑表面血管系统2PEF图像堆栈的平均投影(A类)侧支血管（紫色）将末端微静脉连接到另一引流表面微静脉（虚线）或(B类)没有这样的附属血管。红色圆圈表示血栓位置。闭塞后上游血管的流量变化图如所示补充图5和6. (C类)对于放置在有或无侧支血管的表面微静脉中的血栓，上游毛细血管中的红细胞速度表示为基线值的百分比。示意图插图显示了考虑的血管拓扑结构、血管名称和表面微静脉闭塞的位置。(D类)表面微静脉闭塞后反向流动的毛细血管百分比。(E类)血管直径图，以基线值的百分比表示，用于表面小静脉中形成的血栓上游的毛细血管。菱形（圆圈）表示闭塞后血流没有（没有）反转方向的血管，所有图的颜色编码方案都相同。*P（P）<1.0E-7，**P（P）<0.00001,#P（P）<0.0005,##P（P）<0.005,‡P（P）<0.05; 与假血管相比。红细胞，红细胞；2PEF，双光子激发荧光。

拓扑结构在确定血流变化方面起着重要作用

为了深入了解血管拓扑结构在确定闭塞后血流重排中的作用，我们使用了体内成像以绘制约0.1 mm以上的血管拓扑三并结合血管闭塞后红细胞速度变化的拓扑依赖性测量，预测血流减少的空间范围和严重程度。我们发现AV的数量超过PA的1.8倍(图6A;补充图7; 6只动物，360名PA至201名AV）。我们使用了所有船只的轨迹(图6B; 以确定每个毛细血管的三维空间位置，作为与最近的AV或PA拓扑连接的函数。毛细血管与AV或BA的平均距离，作为上游或下游分支数的函数，是可比较的(图6C)，表明远离AV和PA的毛细血管分支拓扑相似。然后我们使用体内AV和PA闭塞后毛细血管流速的测量值随着拓扑分离而降低图4A和来自研究的西村等(2010)分别计算作为与闭塞血管的距离的函数的毛细管中的冲切后流速变化，根据来自图6C该计算预测，与PA相比，单个AV闭塞后血流不足的空间范围和严重程度都更小(图6D)，与来自图4B和之前的工作(西村等, 2007,2010).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为jcbfm201195f6.jpg

上行小静脉和穿透性小动脉闭塞导致的血流变化差异是不同的AV–AV和PA–PA间距以及相似的毛细血管拓扑结构的结果。(A类)皮层表面血管系统2PEF图像堆栈的平均投影。AV（左）和PA（右）的位置分别用蓝色和红色圆点表示。(B类)2PEF，三维立体投影，使用Voxx(克伦登等, 2002)从大脑表面开始的皮质血管系统（左）。追踪所有血管和分叉点以表征血管拓扑结构。显示了表面血管和描记的毛细血管的子集（右），以强调皮层血管系统的复杂性。(C类)毛细管到最近AV（蓝色）或PA（红色）的距离箱线图，作为远离AV或PA的毛细管分支的函数(D类)使用体内基于面板中的数据进行拓扑加权的流量数据C类每个数据点代表50的加权平均值-μm-binned窗口。AV，升小静脉；PA，穿透小动脉；2PEF，双光子激发荧光。

讨论

我们使用非线性光学技术检测了皮质小静脉闭塞后的血管-血管血流动力学。使用2PEF显微镜测量中心线RBC速度和方向、血管直径和单个血管的拓扑连通性，并使用飞秒激光消融触发靶向AV和SV的凝血。在闭塞前后测量血管，以确定红细胞速度和方向以及血管直径的拓扑和空间依赖性变化。靶微静脉上游的毛细血管的红细胞速度急剧下降，血流方向逆转，直径增加，每个参数都恢复到血栓微静脉上游血管的基线值。SV闭塞后，在不含侧支血管的拓扑结构中，上游毛细血管也观察到类似的行为，而随着表面侧支小静脉的出现，血流赤字得到缓解。此外，我们研究了AV和PA的密度，以及从其分支的毛细血管的拓扑结构，并使用这些值预测AV和PA闭塞导致的血流减少的空间范围和严重程度的差异。这些观察结果揭示了血流量的影响，这是血管拓扑结构和通过皮质的距离的函数，与皮质小静脉闭塞有关。

非线性光学技术能够创建稳健的皮层小静脉闭塞模型

在正常和病理状态下测量脑血流的能力对于建立小静脉中风动物模型至关重要。以前关于皮质小静脉闭塞的大多数研究都使用激光多普勒血流测量来表征直径约0.1至1 mm的皮质静脉闭塞引起的血流变化(Nakase公司等, 1997一, 1997b条;Ungersbock公司等, 1993;上田等, 2000). 尽管这种方法允许绘制大血管闭塞引起的区域血流变化图，但它倾向于平均与～10至50的血管闭塞相关的影响μm直径，如本研究中考虑的直径。定量放射自显影术也被用于绘制上矢状窦闭塞后的组织灌注赤字(黑川等1990年)，但此方法不启用体内例如，可以将血管拓扑结构与血流变化联系起来的测量。在本研究中，我们使用2PEF显微镜在血管对血管水平上表征了小静脉闭塞后位于皮质组织深处的血管的血流和直径变化。虽然用这种方法在一次实验中很难描述大量血管的特征，但我们在AV和SV闭塞后观察到的血流重排的有限拓扑和空间范围表明，2PEF成像非常适合研究这些微血管闭塞(张和墨菲，2007年). 其他能够同时测量许多表面或穿透/上行血管的血流变化的方法，如多普勒光学相干层析成像(斯里尼瓦桑等, 2011)或先进的固有光学成像(陈等, 2011)，可以补充此处采用的方法。

传统的血管闭塞方法不太适合小静脉闭塞。机械结扎方法仅限于大血管，如上矢状窦(弗雷里希斯等, 1994). 依靠静脉注射光敏剂线性激发的光学方法(沃森等, 1985)可能提供更高的精度(Nakase公司等, 1997一)但血栓的形成很难局限于单个血管。栓塞注射模型已被用于封堵较小的血管(三宅一生等, 1993)但这种技术不适用于小静脉闭塞，因为栓子在到达静脉系统之前会阻塞小动脉和毛细血管。在本研究中，我们将高能飞秒激光脉冲紧紧聚焦在血管腔内，以驱动焦点处激光能量的非线性吸收，从而导致局限于焦点体积内的损伤(西村等, 2006). 这种损伤会在目标血管中引发凝血，同时使邻近血管和周围脑组织保持完整（参见补充电影1). 总的来说，这种方法提供了一种稳健的皮质小静脉闭塞动物模型，可以在大脑表面及其下方精确和可控地凝固单个小静脉，并将副作用降至最低。

拓扑是血管闭塞后血液再分布的主导因素

血管拓扑结构在皮质血管凝块后重新分配血流中起着至关重要的作用。沟通的表面小动脉闭塞不会导致下游小动脉和毛细血管的流量严重减少，因为表面小动脉网络内的血管吻合提供了侧支流(百叶窗等, 2010;夏弗等, 2006). 类似地，在SV与侧支血管闭塞后，我们发现上游毛细血管中的血流变化最小，而不包含表面侧支小静脉的拓扑结构会导致严重的血流减少。这些研究强调了动脉和微静脉网络冗余在表面血管闭塞后维持血流的重要作用。相反，拓扑结构不包含侧支通路（如PA和AV）的血管中的闭塞会导致潜在毛细血管的流量减少。PA的凝血导致下游毛细血管的血流严重减少，从靶血管下游至少有七个分支(西村等, 2010)而在房室传导阻滞后，上游第四支后血流恢复。PA或AV闭塞后血流恢复时，毛细血管网络的拓扑距离存在差异，这可能是因为PA的数量几乎是AV的两倍。由于两种血管类型的毛细血管分支模式相似，这种密度差异，因此两个PA或两个AV之间的距离也不同(补充图7)，表明两个PA之间的毛细管分支数量大于两个AV之间的分支数量。因此，闭塞PA下游毛细血管中的血流量不足将进一步延伸至毛细血管网络，然后附近的另一个PA才能有效提供替代来源的血流量。相反，由于两个AV距离较近，闭塞AV上游毛细血管中的血液需要较少的分支才能到达另一个AV，从而导致较轻的血流赤字。为了进一步支持这一观点，我们对毛细血管流量变化与闭塞血管距离的关系进行了拓扑加权分析，结果表明，与PA闭塞相比，AV闭塞后血流减少的空间范围和严重程度较小。综上所述，这些结果不仅暗示了血管拓扑结构和连通性在血流再分配中的作用，还突出了血管层次中闭塞位置的重要性。

上行静脉阻塞后毛细血管扩张是一个被动过程

本研究的关键发现之一是房室闭塞后上游毛细血管的大扩张。一个问题是，观察到的膨胀是主动的还是被动的过程。以往对脑微血管的解剖学研究已经证实，AV上游毛细血管中缺乏平滑肌细胞(罗丹，1968年)这表明毛细血管并不主动调节其直径。这导致了一种假设，即我们观察到的毛细血管扩张是一个被动过程，由血管内压力增加引起，这是由于小静脉闭塞后，紧邻上游的毛细血管在拓扑上离低压引流小静脉更远。为了模拟这种情况，我们将毛细血管视为嵌入脑组织基质中的管子(冯等, 1966)，具有杨氏模量，E、，1.5 kPa和泊松比，ν，共0.5页(杰芬等2003年). 血管半径的变化，R（右）与血管内压力的变化有关，P（P），由

方程式图像

哪里P（P）c（c）和R（右）c（c）是明信片和P（P）o个和R（右）o个基线压力和半径。使用方程式（1），我们计算了引起膨胀所需的压力增加，这与我们的实验测量值一致(图7). 我们计算的血管内压力增加5%至10%，与猫肠系膜毛细血管床和第一引流静脉之间测得的压差比较吻合(Lipowsky，2005年). 然而，我们注意到周细胞已被证明积极调节毛细血管的直径(佩皮亚特等, 2006)虽然我们观察到的扩张幅度大于周细胞活化引起的典型直径变化，但不能排除它们与此处观察到的直径变化有关(费尔南德斯·克莱特等, 2010). 事实上，之前的研究显示阻塞的PA扩张下游有毛细血管(西村等, 2010)可能是一个活跃的过程，直径变化小于此处观察到的变化。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为jcbfm201195f7.jpg

闭经后上游毛细血管扩张归因于内压增加。(A类)脑组织内具有杨氏模量的毛细血管示意图，E类，和泊松比，ν在基线处，初始半径和压力为R（右）o个和P（P）o个分别增加到R（右）c（c）和P（P）c（c）分别在血栓形成后。(B类)管腔内压力的变化（平均值±标准偏差）条形图，作为与闭塞血管拓扑连接的函数，计算公式如下方程式（1）平均直径的变化图4E.*P（P）<1.0E-7，‡P（P）<0.05; 与假血管相比。

小静脉中风后血流减少可能会损害脑细胞

我们在单皮质AV和SV闭塞后观察到的广泛血流和血管变化表明，这些闭塞可能导致脑细胞功能障碍。以前的研究表明，大的皮质静脉闭塞会导致局部血流减少，从而导致缺血性梗死(中濑等, 1997b条). 我们发现，在100范围内，血流量降至基线值的～20%μm闭塞AVs，在该水平上，蛋白质合成的细胞抑制和能量衰竭开始发生(Mies公司等, 1991). 这些血流减少不足以导致急性细胞死亡，但如果时间过长，可能会导致脑功能障碍(Iadecola，2010年). 这一结论得到了肠系膜循环研究的支持，研究表明，静脉阻塞会导致实质细胞死亡，并随着时间的推移而增加(Takase公司等, 1999). 此外，流速和方向改变引起的血管壁切应力变化可能会促进内皮细胞的炎症和氧化应激(哈里森等, 2006). 最后，血管内毛细血管压力增加可能导致血脑屏障通透性增加(Mayhan公司等, 1986)会导致脑水肿和炎症(Mayhan公司等, 1986;罗森博格，1999年). 静脉不足与越来越多的脑部疾病有关，从多发性硬化症到痴呆症(黑色等, 2009;穆迪等, 1995;Singh和Zamboni，2009年). 尽管静脉改变在这些疾病发病机制中的作用尚不明确，但这些结果表明，静脉闭塞对脑微循环有着广泛而深刻的影响，突显了静脉功能不全的潜在致病性。

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

补充信息随附《脑血流与代谢杂志》网站上的论文(网址：http://www.nature.com/jcbfm)

JN获得了NSF GK-12项目的奖学金（0841291）；NN获得了美国国立卫生研究院（1F32AG031620-01A2）、美国心脏协会（09POSST2550177）和欧莱雅美国女性科学研究院的博士后资助；CI从国家卫生研究所获得资金（NS37853）；哥伦比亚广播公司获得了美国心脏协会（0735644T）和埃里森医学基金会（AG-NS-0330-06）的资助。

补充材料

补充电影1

补充信息

工具书类

  • Black S，Gao F，Bilbao J.了解白质疾病：血管认知障碍的影像病理相关性。(打、击等的)一下。2009;40：S48–S52。[公共医学][谷歌学者]
  • Blinder P，Shih AY，Rafie C，Kleinfeld D。血液向啮齿动物新皮质稳健分布的拓扑基础。美国国家科学院程序。2010;107:12670–12675. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chen BR、Bouchard MB、McCSlin AF、Burgess SA、Hillman EM。血流动力学反应的高速血管动力学。神经影像学。2011;54:1021–1030. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Clendenon JL、Phillips CL、Sandoval RM、Fang SF、Dunn KW。Voxx：用于生物显微镜的基于PC的近实时体绘制系统。美国生理细胞杂志。2002;282：C213–C8。[公共医学][谷歌学者]
  • Fernandez-Klett F、Offenhauser N、Dirnagl U、Priller J、Lindauer U。毛细血管中的周细胞具有收缩性体内但小动脉介导小鼠脑功能性充血。美国国家科学院程序。2010;107:22290–22295. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 拉库内斯：小而深的脑梗死。神经病学。1965;15:774–784.[公共医学][谷歌学者]
  • Frerichs KU、Deckert M、Kempski O、Schurer L、Einhauple K、Baethmann A。大鼠脑窦和静脉血栓形成导致脑功能长期受损，并提供细胞毒性发生的形态学证据。大脑血流代谢杂志。1994;14:289–300.[公共医学][谷歌学者]
  • Fung YC，Zweifach BW，Intaglie M.毛细床的弹性环境。圆形Res。1966;19:441–461.[公共医学][谷歌学者]
  • Gefen A、Gefen N、Zhu QL、Raghupathi R、Margulies SS。大鼠大脑和脑壳材料特性的年龄依赖性变化。神经病学杂志。2003;20:1163–1177.[公共医学][谷歌学者]
  • Harrison DG、Widder J、Grumbach I、Chen W、Weber M、Searles C.内皮机械传导、一氧化氮和血管炎症。实习医学杂志。2006;259:351–363.[公共医学][谷歌学者]
  • Iadecola C.神经退行性和血管因素在痴呆发病机制中的重叠。神经病理学报。2010;120:287–296. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kleinfeld D，Delaney KR。用电压敏感染料显示的体感皮层上层触须运动的分布式表现。《计算机神经学杂志》。1996;375:89–108.[公共医学][谷歌学者]
  • Kovari E、Gold G、Herrmann FR、Canuto A、Hof PR、Michel JP、Bouras C、Giannakopoulos P。皮层微梗死和脱髓鞘显著影响大脑老化的认知能力。(打、击等的)一下。2004;35:410–414.[公共医学][谷歌学者]
  • Kurokawa Y，Hashi K，Okuyama T，Uede T。大鼠上矢状窦栓塞闭塞所致脑静脉高压的区域缺血。外科神经病学。1990;34:390–395.[公共医学][谷歌学者]
  • 利波斯基HH。微血管流变学和血流动力学。微循环。2005年；12：5-15。[公共医学][谷歌学者]
  • Mayhan WG，Faraci FM，Heistad DD。急性高血压时大脑和脑干血脑屏障的破坏。美国生理学杂志。1986年；251：H1171–H1175。[公共医学][谷歌学者]
  • Mies G、Ishimaru S、Xie Y、Seo K、Hossmann KA。大鼠大脑中动脉闭塞后大脑蛋白质合成和能量状态的缺血阈值。大脑血流代谢杂志。1991;11:753–761.[公共医学][谷歌学者]
  • Miyake K，Takeo S，Kaijihara H。大鼠微球栓塞后大脑区域血流持续减少。(打、击等的)一下。1993;24:415–420.[公共医学][谷歌学者]
  • Mok VC、Wong A、Lam WW、Fan YH、Tang WK、Guok T、Hui AC、Wong KS。脑卒中后与小血管疾病相关的认知障碍和功能结果。神经外科精神病学杂志。2004;75:560–566. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Moody DM、Brown WR、Challa VR、Anderson RL。脑室周围静脉胶原蛋白病与脑白质疏松症的相关性。放射科。1995;194:469–476.[公共医学][谷歌学者]
  • Nakase H、Kempski OS、Heimann A、Takeshima T、Tintera J.通过激光多普勒扫描评估脑静脉闭塞后的微循环。神经外科杂志。1997年a；87:307–314.[公共医学][谷歌学者]
  • Nakase H、Nagata K、Ohtsuka H、Sakaki T、Kempski O。大鼠术中静脉损伤的实验模型。颅底外科。1997年b；7:123–128. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nguyen QT、Tsai PS、Kleinfeld D.MPScope：多光子显微镜的通用软件套件。神经科学方法杂志。2006;156:351–359.[公共医学][谷歌学者]
  • 西村N、罗西迪NL、伊德科拉C、谢弗CB。单个皮质穿透小动脉闭塞后侧支循环的限制。大脑血流代谢杂志。2010;30:1914–1927. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nishimura N、Schaffer CB、Friedman B、Lyden PD、Kleinfeld D。穿透小动脉是新皮质灌注的瓶颈。美国国家科学院程序。2007;104:365–370. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nishimura N、Schaffer CB、Friedman B、Tsai PS、Lyden PD、Kleinfeld D。使用超短激光脉冲对皮下皮质血管进行靶向性损伤：三种中风模型。自然方法。2006;三:99–108.[公共医学][谷歌学者]
  • Peppiatt CM，Howarth C，Mobbs P，Attwell D.周细胞对CNS毛细血管直径的双向控制。自然。2006;443:700–704. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Putnam TJ。以“脑脊髓炎”和多发性硬化-静脉血栓形成为主要改变。美国医学会杂志。1937;108:1477–1480. [谷歌学者]
  • 罗地丁JA。哺乳动物静脉毛细血管、小静脉和小集合静脉的超微结构。超微结构研究杂志。1968;25:452–500.[公共医学][谷歌学者]
  • Rosenberg GA。缺血性脑水肿。心血管疾病进展。1999;42:209–216.[公共医学][谷歌学者]
  • Schaffer CB、Friedman B、Nishimura N、Schroeder LF、Tsai PS、Ebner FF、Lyden PD、Kleinfeld D。皮层表面微血管的双光子成像揭示了血管闭塞后血流的强劲再分配。普洛斯生物公司。2006;4:258–270. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Singh AV，Zamboni P.多发性硬化症的异常静脉血流量和铁沉积。大脑血流代谢杂志。2009;29:1867–1878.[公共医学][谷歌学者]
  • Srinivasan VJ、Atochin DN、Radhakrishnan H、Jiang JY、Ruvinskaya S、Wu W、Barry S、Cable AE、Ayata C、Huang PL、Boas DA。用于脑血管生理定量研究的光学相干断层扫描。大脑血流代谢杂志。2011;31:1339–1345. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Takase S，Delano FA，Lerond L，Bergan JJ，Schmid Schonbein GW。慢性静脉功能不全的炎症：是一个无法克服的问题。血管研究杂志。1999;36:3–10.[公共医学][谷歌学者]
  • Ueda K，Nakase H，Miyamoto K，Otsuka H，Sakaki T。沙土鼠上矢状窦闭塞模型中脑静脉系统解剖差异对微循环的影响。神经病学学报（维也纳）2000;142:75–82.[公共医学][谷歌学者]
  • Ungersbock K，Heimann A，Kempski O.1993年大鼠脑窦血栓形成模型的脑血流变化冲程 24563–569讨论9–70[公共医学][谷歌学者]
  • Vermeer SE、Prins ND、den Heijer T、Hofman A、Koudstaal PJ、Breteler MM。无症状性脑梗塞与痴呆和认知能力下降的风险。N英格兰医学杂志。2003;348:1215–1222.[公共医学][谷歌学者]
  • Vogel A，Noack J，Huttman G，Paltauf G。细胞和组织的飞秒激光纳米手术机制。应用物理B-Lasers O。2005年；81:1015–1047. [谷歌学者]
  • Watson BD、Dietrich WD、Busto R、Wachtel MS、Ginsberg MD。光化学引发血栓形成诱导可再现性脑梗塞。Ann Neurol公司。1985;17:497–504.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhang SX，Murphy TH.皮层微循环对突触结构和感觉诱发血流动力学反应的影响成像体内.普洛斯生物公司。2007;5:1152–1167. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自脑血流与代谢杂志由以下人员提供SAGE出版物