自然医学。作者手稿；PMC 2011年11月7日发布。
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美国国立卫生研究院：NIHMS332478号
血管内皮细胞向多能干样细胞的转化
,1 ,2,三，4 ,2,4 ,2,4,5 ,1,6,7和8
达米安·美第奇
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝斯以色列女执事医学中心医学部矩阵生物学部，邮编02115
艾琳·M·肖
2宾夕法尼亚大学医学院矫形外科，费城，宾夕法尼亚19104，美国
三宾夕法尼亚大学医学院遗传学系，费城，宾夕法尼亚州19104，美国
4美国宾夕法尼亚大学医学院FOP及相关疾病研究中心，费城，PA 19104
维塔利·卢涅夫
2宾夕法尼亚大学医学院矫形外科，费城，宾夕法尼亚19104，美国
4美国宾夕法尼亚大学医学院FOP及相关疾病研究中心，费城，PA 19104
弗雷德里克·卡普兰
2宾夕法尼亚大学医学院矫形外科，费城，宾夕法尼亚19104，美国
4美国宾夕法尼亚大学医学院FOP及相关疾病研究中心，费城，PA 19104
5宾夕法尼亚大学医学院医学系，美国宾夕法尼亚州费城19104
拉胡·卡卢里
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝斯以色列女执事医学中心医学部矩阵生物学部，邮编02115
6美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院生物化学和分子药理学系，邮编02115
7哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术部，美国马萨诸塞州波士顿02115
比约恩·R·奥尔森
8哈佛牙科学院发育生物学系，美国马萨诸塞州波士顿02115
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝斯以色列女执事医学中心医学部矩阵生物学部，邮编02115
2宾夕法尼亚大学医学院矫形外科，费城，宾夕法尼亚19104，美国
三宾夕法尼亚大学医学院遗传学系，费城，宾夕法尼亚州19104，美国
4宾夕法尼亚大学医学院FOP及相关疾病研究中心，美国宾夕法尼亚州费城19104
5宾夕法尼亚大学医学院医学系，费城，宾夕法尼亚19104，美国
6美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院生物化学和分子药理学系，邮编02115
7哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术部，美国马萨诸塞州波士顿02115
8哈佛牙科学院发育生物学系，美国马萨诸塞州波士顿02115
通信：Damian Medici，博士，医学讲师，Beth Israel Deaconess Medical Center，Harvard Medical School，330 Brookline Avenue，CLS 11090，Boston，MA 02215，（617）735-4603[电话]，（617]735-4604[传真]，ude.dravrah.cmdib@icidemd; Bjorn R.Olsen，医学博士，博士，哈佛医学院细胞生物学赫西教授，哈佛牙科医学院研究院长，马萨诸塞州波士顿Longwood Ave.REB 409 188号，邮编：02115，电话：（617）432-1874，传真：，ude.dravrah.smh@neslo_nrojb 这篇文章已被更正。请参阅第514页第17卷中的更正。
- 补充资料
1
GUID:8D5A00A3-01B4-4C05-AE12-59A3A93FD11A
摘要
间充质干细胞可以产生多种类型的细胞，但由于分离方法和组织来源的不同，其在临床医学中的用途引起了争议。在这里，我们发现血管内皮细胞可以通过ALK2受体依赖机制转化为多能干样细胞。在进展性骨化性纤维增生症患者的病变中，软骨细胞和成骨细胞表达内皮标记物，这是一种由于激活ALK2突变或突变的ALK2转基因小鼠模型而发生异位骨化的疾病。Tie2-Cre血统追踪也表明这些细胞来源于内皮细胞。在内皮细胞中表达突变的ALK2，或用ALK2配体TGF-β2或BMP4处理，可导致内皮-间质转化和获得干细胞样表型。在选择性培养基中，这些细胞分化为成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。该过程被ALK2特异性siRNA抑制。内皮细胞向干细胞样细胞的转化可能为组织工程提供一种新的途径。
简介
上皮和内皮细胞可塑性对胚胎发育和疾病进展至关重要1上皮细胞转化为间充质细胞（上皮-间充质转化，EMT）调节原肠形成、神经嵴和体节分离、颅面发育、伤口愈合、器官纤维化和肿瘤转移2-5同样，内皮-间充质转化（EndMT）对心内膜垫的形成至关重要6-11最近的研究表明，EndMT在肿瘤微环境中生成癌相关成纤维细胞12可能对癌症的发展至关重要1在心脏过程中形成许多成纤维细胞13和肾脏14-16纤维化起源于内皮细胞。EndMT也与动脉粥样硬化有关17，肺动脉高压18和伤口愈合19然而，成熟内皮细胞能否被诱导分化为多种细胞命运尚不清楚。
进展性骨化性纤维增生症（FOP）患者，急性炎症导致软组织异位骨化并形成异位骨骼20，在编码转化生长因子β（TGF-β）/骨形态发生蛋白（BMP）1型受体活化蛋白样激酶2（ALK2）的基因中携带杂合激活突变（R206H）21-23FOP病变中的异位骨化始于间充质冷凝，然后是软骨生成和软骨内骨化20FOP病变中异位软骨和骨的来源尚不清楚。
我们发现FOP损伤的软骨细胞和成骨细胞表达内皮标记物，表明它们来源于血管内皮细胞。异位软骨和骨的谱系追踪也表明其起源于内皮细胞。在人内皮细胞中表达突变体（R206H）ALK2导致EndMT和获得多能干细胞样表型。EndMT通过TGF-β2或BMP4处理细胞来促进，而这可以通过抑制ALK2特异性siRNA来阻止。
结果
异位软骨和骨的内皮起源
为了确定EndMT是否会导致FOP患者异位骨和软骨的形成，我们对FOP患者的病变组织进行免疫组织化学染色，使用内皮标记物TIE2和血管性血友病因子（vWF）特异性抗体和骨钙素和SOX9特异性抗体检测成骨细胞和软骨细胞，分别是。软骨形成病变中的细胞显示TIE2和vWF与SOX9共同表达，而成骨病变中钙化组织衬里细胞中TIE2、vWF和骨钙素的共同表达很强。来自髋关节的正常人类骨骼和软骨没有TIE2或vWF阳性软骨细胞或成骨细胞的证据(,补充图1a、b).组成活性ALK2（caALK2）转基因诱导的小鼠异位骨化模型(),软骨和成骨病变的免疫组织化学显示Tie2和vWF阳性的软骨细胞和成骨细胞，分别用Sox9或Tie2与vWF与骨钙素共同染色，表明它们来自内皮细胞。相比之下，野生型小鼠膝关节的骨和软骨没有Tie2或vWF阳性软骨细胞或成骨细胞的证据(,补充图1c、d).
异位骨化中内皮细胞的分化。（a）具有激活ALK2突变的进行性骨化纤维增生症（FOP）患者和Cre依赖性组成性活性ALK2（caALK2）转基因小鼠的软骨生成性病变（左起第一和第三列）和成骨性病变（右起第二和第四列）的免疫组化。软骨源性病变显示内皮标记物TIE2和vWF与软骨细胞标记物SOX9共同表达。成骨病变显示TIE2和vWF与成骨细胞标志物骨钙素共同表达。来自人类髋关节（顶行）或野生型（WT）小鼠膝关节（第三行）的正常软骨和骨骼没有TIE2或vWF阳性软骨细胞或成骨细胞的证据。比例尺，40μm。（b）Cre诱导的caALK2转基因小鼠异位骨化（红圈）的X射线图像。（c）BMP4诱导的Tie2-Cre报告小鼠异位软骨和骨的免疫组织化学显示EGFP阳性软骨细胞（顶行）和成骨细胞（底行）。这些EGFP阳性细胞显示内皮标记物vWF、Tie1和VE-cadherin的表达。比例尺，20μm。
为了确认异位软骨和骨的内皮起源，我们使用IRG报告小鼠与携带Tie2-Cre转基因小鼠杂交，以进行细胞谱系追踪。在后代中，增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在Tie2阳性谱系的细胞中表达。肌内注射ALK2活化配体BMP4，用Sox9和骨钙素特异性抗体对异位软骨和骨进行染色，结果表明大多数软骨细胞和成骨细胞呈EGFP阳性。此外，这些EGFP阳性细胞与内皮标记物vWF、Tie1和VE-cadherin共同表达().
ALK2突变导致内皮-间充质转化
用编码野生型或突变型（R206H）ALK2的腺病毒构建体感染人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人皮肤微血管内皮细胞（HCMECs）导致ALK2水平显著升高().免疫印迹还显示，突变诱导了ALK2的磷酸化，而编码野生型ALK2或载体的结构物的感染则没有().突变的ALK2表达导致内皮细胞形状改变为间充质形态，并诱导间充质标记物FSP-1和内皮标记物TIE2的共同表达().免疫印迹证实EndMT，突变体ALK2的表达降低了内皮标志物VE-cadherin、CD31和vWF的水平，增加了间充质标志物FSP-1、α-SMA和N-cadherin的表达。TIE2的表达没有改变().EndMT相关转录因子表达增加24ELISA证实了表达突变ALK2的细胞中的蜗牛、Slug、ZEB-1、SIP-1、LEF-1和Twist(补充图2a).
组分活性ALK2促进内皮-间充质转化。（a）免疫印迹显示，感染内皮细胞中野生型（WT）和突变型（Mut）ALK2的His-Tag阳性表达，以及总ALK2表达增加。β-actin作为内部对照。（b）免疫沉淀显示突变ALK2受体的构成性酪氨酸磷酸化（P-Y）。（c）DIC成像（上排）显示了表达突变ALK2的内皮细胞中细胞形态的变化。流式细胞术分析（最下面一行）显示含有突变ALK2结构的细胞中TIE2和FSP-1的共同表达。比例尺，10μm。（d）免疫印迹显示内皮标记物VE-cadherin、CD31和vWF的表达减少，间充质标记物FSP-1、α-SMA和N-cadherin在表达突变ALK2的内皮细胞中的表达增加，但在感染载体或野生型ALK2腺病毒构建物的细胞中没有。TIE2水平保持不变。β-actin作为内部对照。（e）Tie2-Cre报告小鼠早期BMP4诱导的异位骨化病变的免疫组织化学显示EGFP阳性的间充质细胞。大多数EGFP阳性细胞也表达内皮标记物vWF、Tie1和VE-cadherin。比例尺，20μm。
异位骨化始于软骨形成前的间充质冷凝20我们的Tie2-Cre报告小鼠在BMP4诱导的异位骨化早期病变中显示EGFP阳性的间充质细胞（与FSP-1抗体共同染色）。这些间充质细胞也表达内皮标记物vWF、Tie1和VE-cadherin().
EndMT诱导干细胞样表型
为了了解表达突变ALK2的内皮细胞是否获得干细胞样表型，我们使用内皮标记物TIE2和间充质干细胞标记物STRO-1特异性抗体对细胞进行流式细胞术。突变体ALK2表达细胞显示两种蛋白的共同表达，但在野生型ALK2或载体处理的细胞中未发现STRO-1表达().免疫印迹显示腺病毒突变体ALK2处理的细胞裂解液表达干细胞标记物25STRO-1、CD10、CD44、CD71、CD90和CD117。骨髓源间充质干细胞的裂解液也显示所有这些蛋白的阳性表达，但成人角膜成纤维细胞没有().此外，当用腺病毒突变株ALK2处理的内皮细胞用His-tagged蛋白特异性抗体染色并通过荧光激活细胞分选分离时，只有His-tag阳性细胞群通过免疫印迹法表达间充质（FSP-1）和干细胞（STRO-1，CD44，CD90）标记物(补充图3).
组成活性ALK2诱导内皮衍生多能干样细胞的形成。（a）流式细胞术分析显示TIE2和STRO-1在表达突变ALK2的内皮细胞中共同表达。（b）免疫印迹显示间充质干细胞标记物STRO-1、CD10、CD44、CD71、CD90和CD117在表达突变ALK2的内皮细胞中的表达。人骨髓间充质干细胞（MSC）表达这些标记物，但人角膜成纤维细胞（HCF）不表达。β-actin作为内部对照。（c）免疫印迹显示，在用突变ALK2处理48小时，然后暴露于成骨、软骨或脂肪培养基的细胞中，成骨细胞（osterix）、软骨细胞（SOX9）或脂肪细胞（PPARγ2）标记物的表达增加。（d）经突变ALK2（而非载体或野生型ALK2）处理的内皮细胞培养物中，成骨细胞（碱性磷酸酶和茜素红）、软骨细胞（阿尔西安蓝）或脂肪细胞（油红O）产物分别在成骨、软骨或脂肪培养基中生长48小时后呈阳性染色。比例尺，100μm。（e）将突变ALK2转化的内皮细胞植入裸鼠体内，在含有内皮细胞的聚乳酸支架中对成骨细胞（茜素红）、软骨细胞（阿尔西安蓝）或脂肪细胞（油红O）产物进行阳性染色，然后每隔72小时局部注射成骨、软骨或成脂介质，持续6周。比例尺，100μm。
由于间充质干细胞具有多潜能，我们评估了接受EndMT的内皮细胞的分化能力。内皮细胞暴露于腺病毒表达构建物48小时，然后在成骨、成软骨或成脂介质中生长。使用成骨细胞（osterix）、软骨细胞（SOX9）和脂肪细胞（PPARγ2）标记物特异性抗体进行免疫印迹试验表明，突变的ALK2在细胞在各自的分化培养基中生长时增加了这些标记物的表达().添加成骨培养基后7天，用突变ALK2处理的培养物显示碱性磷酸酶阳性染色，而野生型ALK2或载体处理的培养液则无阳性染色。经突变ALK2处理并在成骨培养基中生长21天的细胞通过茜素红染色显示出高水平的基质钙化。载体处理的细胞未显示茜素红染色。使用软骨蛋白多糖染色阿尔西安蓝在软骨生成培养基中培养14天，或使用油红O染色在脂肪生成培养液中培养7天，也发现了类似的结果().内皮源性间充质干细胞的分化潜能与骨髓源性间质干细胞相似。在相同条件下，人角膜成纤维细胞没有分化活性(补充图4).我们发现，将含有经腺病毒构建物预处理的HUVEC或HCMEC的聚乳酸海绵植入免疫缺陷裸鼠体内，然后每隔72小时局部注射相应的分化培养基，持续6周，也可以发生分化().
EndMT的配体特异性诱导
TGF-β2和BMP4是已知的激活ALK2的配体26,27因此，我们检测了用这些因子处理的内皮细胞中的受体磷酸化。使用ALK2特异性抗体进行免疫沉淀分析，然后使用磷酸酪氨酸（P-Y）特异性抗体免疫印迹，表明TGF-β2或BMP4治疗15分钟可诱导受体磷酸化，但使用载体治疗不会().重组TGF-β2或BMP4处理48 h后，HUVEC和HCMEC的内皮细胞形态从鹅卵石样向成纤维细胞样转变。当使用内皮标记物TIE2和间充质标记物FSP-1特异性抗体对细胞进行联合染色并通过流式细胞术分析时，载体处理的细胞TIE2阳性，但FSP-1未染色。TGF-β2或BMP4处理的细胞显示两者的染色().免疫印迹显示，TGF-β2或BMP4处理的细胞中VE-cadherin、CD31和vWF水平降低，而FSP-1、α-SMA和N-cadherin水平升高。TIE-2表达水平保持不变().对EndMT相关转录因子Snail、Slug、ZEB-1、SIP-1、LEF-1和Twist的ELISA分析表明，这些蛋白在TGF-β2或BMP4处理的细胞中的表达远高于对照细胞(补充图2b).
TGF-β2和BMP4激活ALK2并诱导内皮-间充质转化。（a）免疫沉淀物的免疫印迹证实通过TGF-β2或BMP4刺激15分钟ALK2磷酸化。（b）DIC成像、免疫细胞化学和流式细胞术显示经TGF-β2或BMP4处理48小时的内皮细胞的细胞形态和TIE2和FSP-1的共同表达发生变化。比例尺，20μm。（c）免疫印迹法证实，经TGF-β2或BMP4处理的细胞中VE-cadherin、CD31和vWF表达降低，FSP-1、α-SMA和N-cadherin表达增加，EndMT。TIE2水平保持不变。
为了进一步评估干细胞样表型的获得，内皮细胞与内皮标记物TIE2和间充质干细胞标记物STRO-1的特异性抗体共同染色。TGF-β2或BMP4处理的细胞显示两种标记物的大量联合表达，但载体处理的细胞未显示STRO-1的表达().对在相同实验条件下处理的细胞收集的裂解物进行免疫印迹分析表明，STRO-1和其他间充质干细胞标记物CD10、CD44、CD71、CD90和CD117在载体处理的细胞中不表达，但在TGF-β2或BMP4处理的细胞内强烈表达().
通过TGF-β2或BMP4治疗转化的内皮细胞表达间充质干细胞标记物并表现出多潜能。（a）流式细胞术显示经TGF-β2或BMP4处理48小时的内皮细胞中TIE2和STRO-1的共同表达。（b）免疫印迹证实用TGF-β2或BMP4处理的细胞中间充质干细胞标志物STRO-1、CD10、CD44、CD71、CD90和CD117的蛋白表达增加。β-actin作为内部对照。（c）免疫印迹显示经TGF-β2或BMP4处理48 h后，分别暴露于成骨、成软骨或成脂培养基中，成骨细胞（osterix）、软骨细胞（SOX9）或脂肪细胞（PPARγ2）标记物的表达增加。（d）经TGF-β2或BMP4处理48小时的内皮细胞培养物中成骨细胞（碱性磷酸酶和茜素红）、软骨细胞（阿尔西安蓝）或脂肪细胞（油红O）产物阳性染色，随后在成骨、成软骨或脂肪培养基中生长。比例尺，100μm。（e）将TGF-β2或BMP4转化的内皮细胞植入裸鼠皮下，在含有内皮细胞的聚乳酸支架中对成骨细胞（茜素红）、软骨细胞（阿尔西安蓝）或脂肪细胞（油红O）产物进行阳性染色，然后每隔72小时局部注射成骨、软骨或成脂介质，持续6周。比例尺，100μm。
为了评估内皮细胞的分化潜能，用载体、TGF-β2或BMP4处理内皮细胞48小时，然后在成骨、软骨或脂肪培养基中生长。使用经TGF-β2或BMP4处理的内皮细胞裂解物进行免疫印迹，然后在成骨培养基中生长7天、软骨培养基中培养14天或脂肪培养基中培育7天，结果显示成骨细胞标记物osterix、软骨细胞标记物SOX9和脂肪细胞标记物PPARγ2的蛋白表达增加。载体处理的细胞不表达这些标记().用TGF-β2或BMP4处理的培养物，在成骨培养基中7天后用碱性磷酸酶染色，在成骨性培养基中21天后用茜素红染色，在软骨培养基中14天后用阿尔西安蓝染色，或在脂肪培养基中7d后用油红O染色，分化为其他细胞类型，而用载体处理的细胞没有分化成其他细胞类型().通过将含有经载体、TGF-β2或BMP4预处理的内皮细胞的聚乳酸海绵植入免疫缺陷裸鼠体内，然后每隔72小时局部注射分化培养基，持续6周，证实了体内的多功能性。只有用TGF-β2或BMP4处理过细胞的植入物显示出骨、软骨或脂肪的形成().在进一步的实验中，在治疗和植入之前，用荧光量子点预标记HUVECs和HCMEC。用TGF-β2或BMP4处理的标记细胞在体内分别暴露于成骨、成软骨或成脂培养基时显示出骨钙素、SOX9或脂联素的表达，而载体处理的细胞则没有(补充图5).
EndMT的受体特异性
接下来，我们询问ALK2是否是获得内皮细胞中多能干细胞样表型所必需的。细胞转染具有ALK2敲除特异性siRNA双链的细胞24小时。使用一个非特异性干扰siRNA双链作为阴性对照。细胞裂解物的免疫印迹显示ALK2特异性siRNA完全抑制ALK2的表达().随后用载体、TGF-β2或BMP4处理转染细胞48小时，然后对间充质细胞和干细胞标记物FSP-1和STRO-1进行裂解和免疫印迹。用对照siRNA转染的TGF-β2或BMP4处理的细胞比载体处理的细胞FSP-1和STRO-1表达更高，而ALK2 siRNA处理阻止了这些增加().用TIE2和FSP-1特异性抗体染色的悬浮细胞流式细胞术证实了这些结果。用对照siRNA或ALK2 siRNA转染的载体处理的细胞未显示FSP-1的阳性染色。转染对照siRNA的TGF-β2或BMP4处理细胞显示大多数细胞表达FSP-1，而转染ALK2 siRNA的培养物显示很少细胞表达FSP().用ALK2抑制剂背吗啡治疗也能阻断EndMT(补充图6a).
对于EndMT，ALK2是必需的。（a）免疫印迹证实ALK2 siRNA在HUVEC和HCMEC培养物中敲低ALK2表达。（b）免疫印迹显示，转染阴性对照siRNA的TGF-β2或BMP4处理的内皮细胞中FSP-1和STRO-1的表达增加，但转染ALK2 siRNA的细胞中此表达受到抑制。β-actin用作内部对照。（c）流式细胞术分析证实，当用TGF-β2或BMP4处理时，表达FSP-1的内皮细胞数量增加，并且用ALK2 siRNA处理的细胞中这种表达受到抑制。（d）在转染阴性对照siRNA并用TGF-β2或BMP4处理48小时的培养物中，成骨细胞（碱性磷酸酶[AP]和茜素红[AR]）、软骨细胞（阿尔西安蓝[AB]）或脂肪细胞（油红O[or]）产物呈阳性染色，然后在成骨、成软骨或成脂培养基中生长。相反，ALK2 siRNA的表达阻止了这些细胞的分化。比例尺，100μm。
当在相同实验条件下生长的细胞在成骨培养基中培养7天时，转染对照siRNA的TGF-β2或BMP4处理的培养物显示碱性磷酸酶阳性染色，而转染ALK2 siRNA的载体处理培养物和细胞则无阳性染色。在成骨培养基中孵育21天后，茜素红染色、软骨细胞蛋白聚糖在软骨培养基中培养14天后，阿尔辛蓝染色、脂肪细胞在脂肪培养基中培育7天后，油红O染色也发现类似结果().
有趣的是，虽然一些ALK2配体（TGF-β2，BMP4）刺激EndMT，但BMP7是一种抑制EndMT的ALK2活化配体13(补充图6b).为了确定不同ALK2配体诱导的信号差异，我们评估了Smad2和Smad5的磷酸化水平。免疫印迹显示，TGF-β2或BMP4处理1h后，Smad2和Smad5的磷酸化均被促进，而BMP7仅刺激Smad5磷酸化(补充图7a).因为ALK2通常与Smad5相关，但与Smad2无关26，我们探索了ALK2与ALK5的潜在相互作用，已知ALK5可诱导Smad2磷酸化2用ALK2抗体免疫沉淀的裂解物的免疫印迹显示，用TGF-β2或BMP4处理的细胞沉淀中存在ALK5。在载体或BMP7处理的细胞中未发现ALK2和ALK5的相互作用(补充图7b).我们进一步证实了突变型（R206H）ALK2的这种信号特异性。表达突变ALK2的内皮细胞裂解物的免疫沉淀和免疫印迹显示ALK2与ALK5的相互作用以及Smad2和Smad5的磷酸化，而野生型ALK2或载体处理的细胞没有(补充图7c，d).
为了进一步明确ALK受体在EndMT中的作用，我们使用ALK特异性siRNA对所有ALK受体进行了表达敲除研究。ALK2 siRNA或ALK5 siRNA抑制了与EndMT相关的VE-cadherin减少和TGF-β2或BMP4诱导的CD44表达增加。ALK1、ALK3、ALK4、ALK6或ALK7表达的抑制对EndMT无影响(补充图8).这些数据表明，ALK2和ALK5都是EndMT所必需的。
我们的实验表明，内皮标记物vWF、TIE1和VE-cadherin的表达减少，但在EndMT中仍然可以检测到。TIE2水平在TGF-β2或BMP4治疗48小时后保持不变，但治疗96小时后可观察到轻微下降(补充图9a).因此，我们认为所有这些标记物都可以用于检测内皮衍生细胞，这些细胞通过内皮-干细胞机制分化为其他细胞类型。为了证实来源于内皮细胞的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞表达这些标记物，我们对从HCMEC培养物中收集的裂解物进行免疫印迹，这些裂解物用载体、TGF-β2或BMP4处理48 h，并在成骨培养基中生长7 d、软骨培养基中培养14 d或脂肪培养基中培育7 d。成骨培养基诱导成骨细胞标志物骨钙素的表达，软骨培养基增加软骨细胞标志物SOX9的表达，脂肪培养基诱导脂肪细胞标志物PPARγ2的表达。在相同分化培养基中生长的骨髓间充质干细胞（MSCs）也显示出这些蛋白的阳性表达，但在常规培养基中培养的细胞没有。最重要的是，MSCs和来自MSCs的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞未检测到内皮标记物TIE2、vWF、VE-cadherin和TIE1的表达。原代人成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞也没有这些标记物的表达。然而，来自内皮细胞的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞显示这些内皮标记物的表达(补充图9b).此外，虽然造血干细胞表达TIE2和低水平的TIE1，但它们不表达内皮特异性标志物vWF或VE钙粘蛋白(补充图10).
讨论
我们的发现为EndMT的机制和潜在作用提供了新的见解。首先，数据表明，EndMT导致间充质干细胞样细胞的生成，可分化为多种细胞系。目前的观点是，EndMT产生的成纤维细胞参与特定的发育过程，参与癌症进展和器官纤维化1但内皮衍生干细胞的证据拓宽了EndMT在正常发育、组织修复和疾病中的作用范围。例如，观察到骨折修复部位的软骨细胞和成骨细胞被内皮标记物特异性抗体染色为阳性28表明EndMT可能有助于骨折修复的生理过程。骨折修复中软骨细胞和成骨细胞来源及牵张成骨相关过程的研究29应该感兴趣。
其次，我们的数据表明，ALK2的活化/磷酸化对于EndMT在HUVEC和HCMEC等细胞中的发生是必要的和充分的在体外本研究中使用的条件。发现ALK2激活突变的小鼠和人类异位骨化病变中软骨细胞和成骨细胞的主要部分可能来自内皮细胞，这表明该过程也可能发生体内我们的数据表明，TGF-β2和BMP4是EndMT的刺激物，并证实BMP7和血管内皮生长因子（VEGF）是EndMP的抑制剂13,30,31(补充图6b).VEGF对ALK2介导的EndMT的负作用可能解释为什么FOP患者的病变中发生软骨内骨形成而非直接（膜性）骨形成。软骨生成发生在抗血管生成、缺氧的环境中32这可能是有利于ALK2介导的EndMT和损伤部位软骨生成的条件，因为炎症导致缺氧33相反，骨形成需要血管生成，而成骨细胞产生VEGF34导致FOP中内皮衍生细胞转化为软骨细胞的因素目前尚不清楚。然而，炎症细胞因子可能起着关键作用，因为异位骨化病变是由炎症触发的20.
第三，我们的数据表明，以病理性骨形成为标志的FOP是一种基于内皮细胞转化为间充质干细胞样细胞的血管疾病。间充质细胞的积累是FOP病变形成的早期步骤，这以前被认为是成纤维细胞增殖的结果23我们的数据表明，软骨形成之前的间充质冷凝可能是EndMT对干细胞的作用，干细胞通过模仿骨骼发育早期步骤的过程冷凝并分化为软骨细胞32我们的数据表明，在人类FOP病变以及FOP小鼠模型病变中发现的大多数软骨细胞和成骨细胞表达内皮标记物。不表达这些标记的相对较小部分细胞的来源尚不清楚，但这些细胞可能来自骨髓或周围组织中招募的间充质干细胞。
方法
细胞培养
如前所述分离的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人皮肤微血管内皮细胞（HCMEC）35。对细胞进行纯度测试，发现没有淋巴管内皮细胞或基质细胞（周细胞、平滑肌细胞等）的标记36流式细胞术分析再次证实了这一点(补充图11a).克隆群体用PYREX 8×8mm克隆圆柱体（Corning）分离，并显示出与我们实验中使用的培养物相同的反应方式(补充图11b-d).在所有实验条件前24小时，使用含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的EGM-2培养基（Cambrex）培养细胞，然后使用人内皮无血清培养基（Gibco）培养细胞。骨髓源性间充质干细胞（ScienceCell Research Laboratories）在间充质细胞培养基中生长。骨髓源性造血干细胞（Lonza）在HPGM培养基（Lonsa）中生长。人类角膜成纤维细胞来源于Elizabeth Hay博士（哈佛医学院）提供的原料，在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基中生长。从Cell Applications，Inc.获得原始人类成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞及其各自的生长介质。将重组TGF-β2、BMP4和BMP7蛋白（R&D系统）添加到无血清培养基中进行所有相关实验，浓度为10 ng ml−1将重组VEGF（研发系统）以25 ng ml的浓度添加到培养物中−1将多索啡肽（Sigma-Aldrich）以5μM的浓度添加到培养物中。本研究的所有实验均至少进行了三次。
老鼠
所有程序均由宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会审查和批准。Floxed caALK2转基因小鼠37是密歇根大学Yuji Mishina博士的礼物。诱导caALK2，AV-Cre的表达（宾夕法尼亚大学载体核心；1×1011每只小鼠的颗粒数）注射到一个月大的小鼠的左后肢。对侧肢体注射空载体作为对照。A V-Cre注射后14-21天，通过X射线（Senographe DS技术，通用电气医疗系统）检测异位骨和软骨。Tie2-Cre和IRG报告小鼠来自Jackson实验室。注射浓度为0.05μgμl的BMP4（由遗传研究所提供，目前为辉瑞公司）在Tie2-Cre和IRG报告小鼠杂交后代中诱导异位骨化−1植入后7天和14天，肌肉注射生长因子诱导的Matrigel（BD Biosciences）组织得到恢复。如前所述，组织固定在异戊烷（2-甲基丁烷）中23并在10μm下切割冷冻切片。使用蓝色（以红色显示）荧光AlexaFluor二级抗体（Invitrogen）对Tie2-Cre IRG报告小鼠的切片进行反染色。在任何组织中均未发现报告者的渗漏或异常表达(补充图12).
人体组织
所有FOP患者样本均获得宾夕法尼亚大学研究审查委员会批准的知情同意书和方案。所有活检均在诊断FOP之前进行，因为FOP中的组织创伤经常导致异位骨化。来自髋关节的正常人体骨和软骨组织由Beth Israel Deaconess医疗中心的病理科提供，样本是在知情同意和调查审查委员会批准的方案下获得的。
免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光
使用各自制造商推荐的浓度（和使用方案）的以下抗体进行免疫分析：FSP-1（H00006275-M01；Stressgen）、phospho-Smad2（3101）、Smad2（3122）、phos-Smad5（9516）、Smad5（9517；Cell Signaling Technology）、ALK1（sc-19547）、ALK2（sc-25449）、ALK3（sc-20736）、ALK 4（sc-31297）、，ALK5（sc-398）、ALK6（sc-25455）、ALK7（sc-135001）、磷酸酪氨酸（sc-7020）、VE钙粘蛋白（sc-6458）、TIE1（sc-342）、TIE2（sc-324，sc-9026）、STRO-1（sc-47733）、CD10（58939）、CD44（sc-71220）、CD71（sc-32272）、CD90（sc-9163）、CD117（sc-17806）、骨钙素（sc-74495，sc-23790）、SOX9（sc-20095）、PPARγ2（sc-22022；Santa Cruz生物技术），osterix（ab22552）、脂联素（ab22554）、N-钙粘蛋白（ab76057）、NG2（ab83508）、vWF（ab68545；Abcam）；CD31（IR610；Dako），His（A00174；GenScript）；α-SMA（A5228），β-actin（A1978；Sigma-Aldrich）。样品使用标准预制SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad）进行测定。HRP-结合IgG TrueBlot试剂（18-8814、18-8816、18-8717；eBioscience）以1:1000的稀释度使用。TrueBlot IgG珠（eBioscience）用于免疫沉淀实验。AlexaFluor次级抗体（Invitrogen）以1:200的稀释度使用。使用尼康80i荧光显微镜采集图像。
流式细胞术
使用TIE2、FSP-1、STRO-1、α-SMA、NG2和His（如上所述）特异性抗体及其各自制造商提供的方案对内皮细胞进行悬浮染色。流式细胞术是在哈佛医学院病理学系流式细胞仪核心设施使用FACSDCalibur（BD Biosciences）细胞分选机进行的，每个样本分离30000个细胞。
多重ELISA
LEF-1（细胞信号技术）、VE-cadherin（sc-6458）、CD44（sc-71220）、CD90（sc-9163）、蜗牛（sc-10433）、ZEB-1（sc-134159；圣克鲁斯生物技术）、FSP-1（H00006275-M01；Stressgen）、SIP-1（AV33694；Sigma-Aldrich）、Slug（ab27568）和Twist（ab49254；Abcam）使用Bio-Plex胺偶联试剂盒（BioRad），用独特的光学编码将抗体偶联到Bio-Pplex羧基化珠上。β-肌动蛋白抗体（A1978；Sigma-Aldrich）也与Bio-Plex羧基化珠结合，用作内部对照。使用通用细胞信号测定试剂盒和protoco！（密理博）。实验值除以β-肌动蛋白对照值以提供标准化数据。
CeH分化
细胞在StemPro成骨、成软骨或成脂培养基（Invitrogen）中生长。使用碱性磷酸酶试剂盒和方案（Sigma-Aldrich）对在成骨培养基中培养7天的培养物进行碱性磷酸酶染色，以检测成骨细胞。对在成骨培养基中培养21天的培养物进行茜素红（Sigma-Aldrich）染色30分钟，以检测基质钙化。Alcian Blue（Sigma）染色用于在软骨生成培养基中培养软骨细胞蛋白聚糖染色5分钟，染色时间为14天。油红O（Sigma-Aldrich）染色用于脂肪生成培养基培养7天，染色时间15分钟。为了进行体内分析，使用Qtracker 525 Ce∏标记试剂盒（Invitrogen）用荧光量子点标记内皮细胞。在培养基中处理细胞以诱导EndMT，然后将其吸收到OPLA聚乳酸支架（BD Biosciences）中。通过手术将支架植入免疫缺陷裸鼠皮下（Nu/Nu株；Charles River Laboratories）。每隔72小时在植入物区域局部注射StemPro分化培养基（如上所述），持续6周。如上所述，对支架进行冷冻切片并用茜素红、阿尔西安蓝或油红O染色。所有程序都经过了哈佛医学院机构动物护理和使用委员会的审查和批准。
RNA干扰
使用TriFECTa RNAi试剂盒（集成DNA技术）和相应的protocoL进行siRNA基因表达敲除研究。按照制造商的指南，使用X-tremeGene siRNA转染试剂（Roche）将每个27mer siRNA双链转染到细胞中。siRNA是用以下序列合成的（集成DNA技术）：ALK1：5′-CUGGGCUAUGAAUCACACUUUAGGCUUC-3′；ALK2：5′-GCACACUCUCCAUCUCUUAACCAG-3′；ALK3：5′-CAUCUCAUGAAUUCCAAGAGAGAUUA-3′；ALK4：5′-AUGAGGGAUCUUCCAUGUCGAGUCUCU-3′；ALK5：5′-CUCAGAAUGUUCUUAGCUACCACCUC-3′；ALK6：5′-AUCUGAAUCUGCUUAGCUAGUCCUU-3′；ALK7：5′-ACUUAAAUACUGUACUCUUAUCUUU-3′；阴性对照：5′-UCACAAGGAGAGAAAGAGAGAGA-3′。
统计分析
使用GraphPad Prism 4软件进行单因素方差分析（ANOVA），并通过双尾配对学生t检验进行确认。P值小于0。05被认为是显著的。
致谢
我们感谢M.Xu提供的技术援助，J.Bischoff（波士顿儿童医院）提供的人类内皮细胞原代培养，A.Maidment提供的X射线，Y.Mishina（密歇根大学）提供的caALK2转基因小鼠。这项工作得到了美国国立卫生研究院对B.R.O.、R.K.、F.S.K.、E.M.S.和宾夕法尼亚大学Vector Core的资助。其他支持来自IFOPA、Ian Cali和Weldon家庭基金会、Penn肌肉骨骼疾病中心、Isaac和Rose Nassau骨科分子医学教授以及Rita Allen基金会。
脚注
作者贡献
D.M.设计并执行实验，分析数据，并撰写手稿。V.Y.L进行了实验。E.M.S、F.S.K和R.K提供了研究材料，编辑了手稿，并提供了技术建议。B.R.O设计了实验，分析了数据，并撰写了手稿。
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