投资眼科视觉科学。2011年10月；52(11): 8271–8277.
年龄相关应激上调CCR3通过VEGF依赖和非依赖信号促进脉络膜内皮细胞迁移
,1 ,2 ,1 ,1 ,三和
1 王海波
从1犹他州盐湖城犹他大学约翰·莫兰眼科中心眼科；
埃里卡·维特琴
这个2北卡罗来纳大学教堂山分校细胞与发育生物学系；和
姜燕超
从1犹他州盐湖城犹他大学约翰·莫兰眼科中心眼科；
巴拉默里·安巴蒂
从1犹他州盐湖城犹他大学约翰·莫兰眼科中心眼科；
汉斯·格罗斯尼克劳斯
这个三乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里眼科中心眼科。
M.伊丽莎白·哈特内特
从1犹他州盐湖城犹他大学约翰·莫兰眼科中心眼科；
从1犹他州盐湖城犹他大学约翰·莫兰眼科中心眼科；
这个2北卡罗来纳大学教堂山分校细胞与发育生物学系；和
这个三乔治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院埃默里眼科中心眼科。
通讯作者。 2011年7月15日收到；2011年9月2日修订；2011年9月7日接受。
趋化因子受体CCR3的表达因年龄相关的应激而增加。激活的CCR3促进脉络膜内皮细胞迁移和Rac1激活，这可能与VEGFR2信号的激活有关。
摘要
目的。
探讨C–C趋化因子受体3型（CCR3）和趋化因子（C–C基序）配体11（CCL11）调节脉络膜内皮细胞（CEC）迁移的分子机制以及与血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的相互作用。
方法。
对青年和老年供体正常眼的人视网膜切片进行免疫标记。通过实时PCR，在年轻和老年人供体眼的视网膜色素上皮（RPE）/脉络膜和暴露于过氧化氢的培养CEC中检测CCR3 mRNA。CCR3配体和CCL11-或VEGF-刺激的CEC迁移也在CCR3抑制剂或对照存在的情况下使用荧光显微镜进行测量。在与CCL11、VEGF或CCL11/VEGF联合孵育的CEC中，检测Rac1的激活、磷酸化Akt作为磷酸肌醇3-激酶信号转导的读数以及VEGFR2的激活。
结果。
与年轻人视网膜或RPE/脉络膜相比，CCR3在老年人中的表达水平更高。配体激活的CCR3增加了CEC的迁移，CCR3抑制剂抑制了CEC迁移。在与CCL11孵育的CEC中，Rac1活性、p-Akt和p-VEGFR2显著增加。CCR3抑制剂阻止VEGF诱导的CEC迁移和CECs中Rac1激活。与单独使用CCL11或VEGF治疗的细胞相比，CCL11和VEGF处理的CEC中Rac1活性增加。配体激活的CCR3导致VEGFR2磷酸化和VEGFR2和CCR3的共同免疫沉淀。
结论。
激活的CCR3促进CEC迁移和Rac1激活，并导致VEGFR2的关联和激活。CCR3和VEGF信号之间存在交叉传递，可能在人类年龄相关性黄斑变性的脉络膜新生血管形成中起重要作用。
新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）占美国人口（即60岁以上的人口）中80%的合法失明。1抗血管内皮生长因子（VEGF）治疗的结果有所改善，2但只有40%的病例视力仍在提高，重复眼内注射会带来严重的眼部风险，包括眼内炎和视网膜脱离。三此外，反复玻璃体内注射血管内皮生长因子抗体后，治疗效果会消失，4通过改变血管生成和抑制生长因子或其他信号的调节，引起代偿机制引起的潜在视网膜毒性或复发性脉络膜新生血管（CNV）。5–8因此，在开发新血管性AMD治疗方法时，考虑VEGF途径以外的途径非常重要。据报道，G蛋白偶联受体（GPCR）、C–C趋化因子受体3（CCR3）在新生血管性AMD中起重要作用。9其他证据支持其在CNV中的作用。10然而，最近的一项研究报告称，当使用CNV凝胶蛋白混合物（Matrigel；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）模型时，CCR3在CNV发育中并不重要。11因此，需要进一步研究CCR3在AMD中的潜在作用。
AMD是一种复杂的疾病，受环境和遗传因素的影响。在本研究中，我们重点研究了与AMD相关的环境应激对脉络膜内皮细胞（CECs）CCR3表达的影响。我们研究了CCR3信号激活CECs迁移的机制，这是视觉威胁性视网膜感觉CNV发生之前的一个关键事件。我们从人类供体眼睛获得数据，并使用培养的人类CEC和视网膜色素上皮（RPE）。我们还探讨了CCR3和VEGF在触发下游信号通路中协同工作的假设。我们报告CCR3配体，即趋化因子（C–C基序）配体11（CCL11），激活VEGF受体2以触发小GTPase Rac1的激活，我们之前报告的小GTPase-Rac1是RPE CEC迁移所必需的。12–14
方法
细胞培养
如前所述，CEC是从北卡罗来纳州眼库获得的年轻捐赠者的眼睛中分离出来的。15通过标记EC标记物（CD31、vwF和VE-cadherin）来确认富集条件（EC）表型，并在实验中使用第2代至第5代。CECs保存在含有10%胎牛血清（FBS）的内皮生长介质-2（EGM-2；Lonza，Walkersville，MD）中。ARPE-19细胞取自美国型培养物收集中心（马里兰州Rockville），并在Dulbecco改良的Eagle's培养基/F12（DMEM/F-12；Invitrogen，加利福尼亚州Carlsbad）加上10%FBS和青霉素-链霉素中生长。第18代以下的细胞用于实验。
CEC迁移测定
CCL11和VEGF（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）在0.1%的BSA中重建，然后与凝胶蛋白混合物提取物（Matrigel；BD Biosciences）混合，用无血清内皮基底培养基（EBM-2；Lonza）稀释1:1。对照组为0.1%BSA中的PBS，混合在凝胶蛋白混合物提取物中。将一种小分子CCR3抑制剂溶解在二甲基亚砜中，并以1至1000 nM的浓度使用，该抑制剂可专门防止配体与IC50为28 nM的CCR3结合（US 2010/0273795 A1；Axikin Pharmaceuticals的礼物，加利福尼亚州圣地亚哥）。将EBM-2（500μL）添加到24孔板的每个孔中，然后插入直径为6.5 mm的插件（8-μm孔；Transwell；Corning，Inc.，Corning，NY）。用细胞标记溶液（Vybrant DiO；Invitrogen，Carlsbad，CA）在37°C下预处理EBM-2中的人CEC 30分钟，并以每200μL无血清EBM-2培养基中50000个细胞的速度接种到插入物中。让平板在37°C、5%CO下培养24小时2用培养显微镜和显微镜数码相机（分别为奥林巴斯CK40和奥林巴斯DP71；奥林巴斯美国公司位于宾夕法尼亚州中央山谷）对迁移的细胞进行成像。
Rac-1活性测定
人CECs在含有10%FBS的EGM-2中培养。在开始检测之前，用基础培养基EBM2（Lonza）对细胞进行血清饥饿处理至少2小时。用CCL11（10 ng/mL）或/和VEGF（20 ng/mL。将等量的裂解物（500μg）在4°C下孵育30分钟，并与谷胱甘肽一起旋转S公司-转移酶–p21活化激酶1 p21结合域琼脂糖珠（密立波，特梅库拉，加利福尼亚州），以降低活性鸟苷三磷酸（GTP）结合的Rac-1。随后使用抗Rac-1抗体（加利福尼亚州圣何塞BD Transduction Laboratories）通过Western blot分析对样本进行结合Rac-1分析。
磷蛋白-Akt和磷蛋白-STAT3分析
人类初级CEC生长在6孔板中。在无血清EBM-2中饥饿后，将细胞与CCL11（10 ng/mL）、VEGF（20 ng/mL）或两者共同孵育30分钟。在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中对细胞进行裂解，以使用p-Akt和Akt1抗体或磷酸-STAT3和总STAT3抗体来探测磷酸-Akt和总Akt（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）。
免疫沉淀法检测磷酸-VEGFR2
将人CEC植入6孔板中。在无血清EBM-2中饥饿2小时后，用CCL11（10 ng/mL）处理细胞0、15、30或60分钟。在RIPA缓冲液中采集细胞，并通过免疫沉淀和Western blot分析检测细胞裂解物，以使用VEGFR2（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）和磷酸酪氨酸（BD Transduction Laboratories）抗体检测磷酸-VEGFR2。作为阳性对照，在与VEGF（20 ng/mL）孵育15分钟后，在细胞中测定磷酸化-VEGFR2。
CCR3免疫标记
通过佐治亚眼库获得的91岁男性捐赠者的人类视网膜石蜡切片在免疫染色前进行脱蜡，并使用抗原回收溶液（Dako North America，Inc.，Carpintia，CA）进行抗原回收步骤。从犹他州狮子眼库获得了一名25岁男性捐赠者眼睛的人类视网膜冷冻切片。为了在CECs中进行免疫标记，用4%多聚甲醛将生长在无涂层盖玻片上的人CECs固定20分钟，然后在PBS中冲洗。细胞和视网膜切片在2%正常山羊血清和PBS/0.5%Triton X-100中培养1小时，以阻止一级抗体的非特异性结合。将切片与兔抗CCR3抗体（1:50稀释；Santa Cruz Biotechnology）在4°C下孵育过夜。在PBS中清洗三次后，用1:500稀释的染料结合山羊抗兔二级抗体（Alexa Fluor 488；Invitrogen，Carlsbad，CA）将切片孵育1小时，用于CCR3。切片在PBS中冲洗，用核染料4′，6′-二氨基-2-苯吲哚染色，并安装在水溶性非氟化合物中（Fluoromount-G；SouthernBiotech，Bermingham，AL）。图像由倒置显微镜（日本东京奥林巴斯1X81）捕获，并进行数字存储以供分析。
RNA分离和实时PCR
从培养基中取出细胞并用冷PBS清洗。使用单步RNA分离试剂（Tri-reagent；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）提取总RNA。通过使用微体积仪器（NanoDrop；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA）对RNA进行量化。cDNA是使用商业试剂盒（高容量cDNA档案试剂盒；加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）生成的。在基因序列检测仪（ABI Prism 7500；Applied Biosystems）上使用探针（TaqMan探针；AppliedBiosystes）对人类进行RT-PCR资本充足率3和β-肌动蛋白CCL11、CCL24和CCL26的基因和引物（SYBR Green qPCR Master Mix；Clontech，Mountain View，CA）。将所有基因的表达水平标准化为内部对照人类β的平均值-肌动蛋白引物（SYBR Green）序列如下：人CCL11：正向5′-AGAGAAGTGGGTGCAGATCCA-3′，反向5′-TTAGGCAACACTCCGTT-3′；人CCL24：正向5′-AGAGAGTGGTGCAGATTCCA-3′，反向5′-TTAGGCAACACTCTCTCT-3′；人类CCL26：正向5′-AGAAGAGTGGGTGCAGATCCA-3′，反向5′-TTAGGCAACACTCCGTT-3′。
统计分析
各组间的显著差异通过ANOVA确定，并采用事后保护t吨-测试，如图图例中的特定实验所示。所有实验都有一个n个=3至n个= 6. 细胞迁移实验和Rac1活性测定重复三次。最小值为P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
CCR3在青年和老年人视网膜和RPE/脉络膜中的表达
年龄是导致AMD风险增加的主要因素。16我们之前报道过，与20至40岁的捐赠者相比，70岁以上捐赠者眼中的所有VEGF剪接变体在RPE中显著增加。14因为我们发现CCR3在人类新生血管性AMD中很重要，9我们预测，与年轻捐赠者的眼睛相比，年龄增加捐赠者眼睛中CCR3的表达更高。A和B显示，与CCR3免疫标记相比，91岁供体的视网膜中CCR3的免疫标记质量更高(B） 来自一个25岁捐赠者的(A） ●●●●。然后，我们测量了年轻和老年供体眼RPE/脉络膜中CCR3 mRNA的表达(n个=3个）。老年人与年轻人相比，RPE/脉络膜CCR3 mRNA显著增加(C） ●●●●。接下来，我们测定了CCR3在培养的CEC和RPE细胞中的表达水平。我们发现CCR3 mRNA在CEC中高度表达，与RPE相比增加了近10倍(A） ●●●●。培养的CEC中CCR3阳性标记证实了这一发现(B） 而培养的RPE中没有CCR3标记（数据未显示）。
CCR3在人类视网膜切片和RPE/脉络膜中的表达。25岁人视网膜切片中CCR3的代表性免疫染色(一)和91岁(B类)供体使用抗CCR3抗体（放大倍数，×40）。(C类)通过实时PCR检测老年和年轻供体RPE/脉络膜CCR3 mRNA的表达*P（P）<0.05 vs.年轻(n个=每组3只供眼）。
AMD相关应激增加了CECs和RPE细胞中CCR3的表达。CCR3在CECs和RPE细胞中的表达(一,C类)及其在RPE细胞中的配体(D类)通过实时PCR检测。(一)培养的人CECs和RPE细胞***P（P）<0.001与RPE(n个= 6). (B类)培养CEC中的CCR3免疫染色。(C类)人类CEC暴露于H2O（运行）2以不同剂量（100、300和600μM）持续6小时*P（P）<0.05与0μM H2O（运行）2(n个= 6). (D类)人类ARPE-19细胞用300μM H培养2O（运行）2持续6小时**P（P）与对照组相比<0.01(n个= 6).
AMD相关应激增加培养CECs中CCR3的表达
证据支持外源性和内源性活性氧化物质（ROS）是AMD病理过程中的相关因素。12,17–20因此，我们确定了H的影响2O（运行）2CCR3在CECs中的表达水平。我们之前报告过600μM H2O（运行）2导致VEGF的显著选择性上调189RPE中的拼接变体。14然而，在CEC中，VEGF剪接变异体、VEGF的表达水平没有变化121、血管内皮生长因子165、和VEGF189.14确定H的影响2O（运行）2关于CCR3在CECs中的表达，用H进行了剂量-反应实验2O（运行）2浓度为100、300或600μM。孵育24小时后，发现在300μM浓度下，CECs中CCR3的表达比对照组增加4倍(C） ●●●●。在培养的RPE中，H2O（运行）2与对照组相比，暴露也导致CCR3 mRNA显著增加，尽管表达水平仍比CCR3低10倍（数据未显示）。当RPE暴露于300μM H时2O（运行）2，所有三种CCR3配体（CCl11、CCl24和CCl26；D） 而暴露于300μM H后，所有三种配体的CEC表达与对照组相比没有变化2O（运行）2（未显示数据）。因此，年龄和氧化应激似乎上调了CECs和RPE中的CCR3，并且仅在RPE细胞中诱导CCR3配体生成增加。
CCR3配体增加CEC迁移
然后我们对CCR3信号转导对CEC迁移的影响感兴趣。我们测量了CCR3配体CCL11刺激后CEC的迁移。我们发现，当剂量为10 ng/mL时，CCL11诱导CECs迁移，与对照组相比增加了两倍。CCR3抑制剂以剂量依赖的方式显著抑制了这种配体诱导的CEC迁移，这与以前的研究结果一致9().
CCR3配体CCl11促进CEC迁移。与对照组或CCR3抑制剂以不同剂量（1 nM、10 nM、100 nM、1μM和10μM）孵育24小时后，测量混合有10 ng/mL CCL11或对照组的凝胶蛋白混合物提取物（Matrigel；BD Biosciences）向凝胶蛋白混合物迁移的CEC数量。将不含CCL11的向凝胶蛋白混合物提取物迁移的CEC作为对照（No-CCL11）。整体单因素方差分析P（P）< 0.0001; 事后Newman-Keuls多重比较测试：***P（P）<0.001与否-CCL11，##P（P）< 0.01,###P（P）<0.001与CCL11单独(n个= 9).
CCR3对EC信号通路的影响
多种信号通路可导致CEC迁移。Janus激酶/信号转导子和转录途径激活子可以通过磷酸化STAT3介导EC和其他细胞迁移。21我们报道了可溶性VEGF激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-激酶）信号和VEGF受体2（VEGFR2），两者在RPE的CEC迁移中都很重要13,15通过调节CEC中小GTPase Rac1的激活。12–14如所示A、 在用CCL11（10ng/mL）刺激30分钟后，我们发现通过增加p-Akt来确定PI3-激酶的显著激活。然而，当使用VEGF刺激p-Akt时，我们没有发现在CCL11刺激p-Akt的同一时间点激活，也没有发现在用CCL11或VEGF激发后CEC测试的时间点p-STAT3增加（数据未显示）。接下来，我们测量了与CCL11孵育不同时间的CEC中的Rac1活性。当剂量为10 ng/mL时，CCL11在30分钟时显著诱导Rac1活性，并且该作用持续60分钟(B） ●●●●。这与我们之前在CEC中观察到的VEGF刺激Rac1激活的时间过程类似。12然后我们确定CCL11诱导的Rac1激活是否通过CCR3受体介导。CEC在用CCL11刺激前用小分子CCR3抑制剂预处理30分钟，并测定Rac1活性。CCL11诱导的Rac1激活在100nM时被CCR3抑制剂显著抑制，在1μM剂量时，CCR3抑制剂完全阻断CCL11刺激的Rac1激活(C） ●●●●。
CCL11通过CCR3刺激PI 3-激酶和Rac1活化。在CEC中通过下拉试验测量Rac1的活化。(一)在与CCL11（10 ng/mL）孵育30分钟的CEC中测量p-Akt-1和总Akt-1，作为PI 3-激酶活性的读数*P（P）<0.05与对照组(n个=3，代表性实验）。(B类)CEC用10 ng/mL CCL11孵育0、5、15、30和60分钟，或用20 ng/mL VEGF处理60分钟，作为阳性对照*P（P）<0.05 vs.CCL11治疗0分钟(n个= 6). (C类)用CCR3抑制剂以两种剂量（100 nM和1μM）预处理CEC 30分钟，然后将细胞暴露于10 ng/mL CCL11中60分钟。整体单向方差分析P（P）< 0.0001; 事后Newman-Keuls多重比较测试：***P（P）<0.001与对照组相比；#P（P）<0.05和###P（P）<0.001与CCL11单独(n个= 6).
CCR3和VEGF信号之间的交叉对话
中的结果表明配体激活的CCR3通过PI3-激酶/Rac1信号传导诱导CEC迁移。我们之前的研究还表明，VEGF激活PI3-激酶和Rac1，导致RPE的CEC迁移。13,15然后我们确定CCR3和VEGF信号通路之间是否存在串扰来介导CEC激活。CEC向VEGF迁移165在存在不同浓度的CCR3抑制剂的情况下进行测量。我们发现CCR3抑制剂导致VEGF诱导的CEC迁移呈剂量依赖性下降，在所有测量剂量下均显著(A） ●●●●。然后我们确定CCR3抑制剂是否能够阻止VEGF诱导的Rac1激活。CEC用CCR3抑制剂预处理30分钟，并暴露于VEGF或对照组1小时。使用下拉分析在细胞裂解液中测量Rac1。CCR3抑制剂显著抑制VEGF诱导的Rac1激活(B） ●●●●。
CCR3抑制剂阻断VEGF诱导的CEC迁移和Rac1激活。(一)在细胞与对照或CCR3抑制剂以不同剂量（1 nM、10 nM、100 nM、1μM和10μM）孵育24小时后，测量CEC向混合有20 ng/mL VEGF或对照的凝胶蛋白混合物提取物（Matrigel；BD Biosciences）迁移的情况。将CEC迁移至不含VEGF的凝胶蛋白混合物提取物作为阴性对照，将中和VEGF抗体作为阳性对照。整体单向方差分析P（P）< 0.0001; 事后Newman-Keuls多重比较测试：***P（P）<0.001与非VEGF，##P（P）与仅VEGF相比，<0.01。#P（P）< 0.05,###P（P）<0.001与CCL11单独(n个= 6). (B类)用CCR3抑制剂预处理CECs 30分钟，然后暴露于20 ng/mL VEGF或对照组中1小时，通过下拉试验测定Rac1活性。整体单向方差分析P（P）< 0.0001; 事后Newman-Keuls多重比较测试：***P（P）<0.001和**P（P）与对照组相比<0.01；###P（P）<0.001与VEGF(n个= 6).
信号通路之间发生串扰的一种机制是通过受体的共定位。我们对与CCL11（10 ng/mL）和VEGF（20 ng/mL）孵育30分钟的CEC中的VEGFR2和CCR3进行联合免疫沉淀分析。我们发现CCL11和VEGF联合治疗后，CCR3与VEGFR2结合(A） ●●●●。当仅用CCL11刺激CEC时，与对照组相比，在15分钟时，p-VEGFR2显著增加，在60分钟时达到最大值，这与单独刺激VEGF的效果相似(B） ●●●●。这一发现为CCL11诱导的CCR3刺激也能诱导VEGFR2磷酸化提供了证据。然后我们确定CCR3和VEGFR2之间的相互作用是否影响下游Rac1的激活。在用VEGF、CCL11或这两种配体共同刺激1小时后，我们发现CCL11和VEGF分别导致Rac1活化显著增加，并且暴露于这两种配体导致Racl活性增加(C） ●●●●。
配体激活的CCR3与VEGFR2共免疫沉淀并激活VEGFR2，导致Rac1协同激活。(一)使用CCR3抗体和VEGFR2印迹法，在与VEGF（20 ng/mL）和CCL1（10 ng/mL(n个= 3). (B类)用抗VEGFR2抗体免疫沉淀法和CCL11（10 ng/mL）处理0、15、30和60分钟的CEC中磷酸酪氨酸印迹法检测磷酸VEGFR2；暴露于VEGF（20 ng/mL）15分钟的CEC中VEGFR2磷酸化为阳性对照。整体单向方差分析P（P）< 0.0001; 事后Newman-Keuls多重比较测试：*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001 vs.CCL11治疗0分钟(n个= 3). (C类)对CCL11（10 ng/mL）和VEGF（20 ng/mL。单独使用CCL11或VEGF治疗的细胞中的Rac1活性作为对照。整体单向方差分析P（P）< 0.0001; 事后Newman-Keuls多重比较测试：**P（P）<0.01和***P（P）<0.001与对照组相比；#P（P）<0.05，仅与CCL11相比；$P（P）<0.05 vs.仅VEGF(n个= 3).
讨论
在这项研究中，我们发现在与AMD风险增加相关的条件下，即老龄化和氧化应激，趋化因子受体CCR3在CEC中显著表达。我们还发现CCR3配体（CCL11、CCL24和CCL26）的mRNA在RPE中表达，并且随着H2O（运行）2挑战。与年轻供体眼相比，老年人视网膜中的CCR3标记更高，例如在人类新生血管性AMD的标本中报道的。9然而，Li等人。11据报道，CCR3与凝胶蛋白混合物提取物（Matrigel；BD Biosciences）通过巩膜注入视网膜下间隙引起脉络膜新生血管时引起的CNV无关。这可能有几个原因。CCR3可能在某些条件下表达：年龄增加或氧化应激，这两个已知因素都与晚期AMD相关。我们在细胞培养研究中发现了支持这一点的证据。此前我们发现，激光诱导小鼠视网膜CNV可通过激活NADPH氧化酶增加ROS的生成。12在本报告中，我们发现ROS增加了CECs中CCR3的表达和RPE中CCR3配体的表达。在体内凝胶蛋白混合物提取物（Matrigel；BD Biosciences）CNV检测中，尚不清楚视网膜ROS生成是否受到影响。
在本研究中，我们探讨了CCR3信号转导导致新生血管性AMD的潜在机制，重点关注CEC的激活和迁移。与我们之前的报告一致，9CCR3配体CCL11介导CEC迁移和Rac1激活，这被一种阻止配体与受体结合的CCR3抑制剂所抑制。我们之前曾报道过Rac1对RPE的CEC迁移至关重要。12–14Rac1是Rho家族的一种小GTPase，被鸟嘌呤核苷酸交换因子激活。在GTP结合激活状态下，Rac1可以通过与效应蛋白结合来调节细胞行为。通过GTPase激活蛋白（GAP）将其恢复到非活性状态，GAP促进结合GTP水解为二磷酸鸟苷（GDP）。22种族122,23具有多种细胞功能，许多功能与调节肌动蛋白细胞骨架有关，如控制细胞运动和迁移。24–26Rac1也是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）的一个亚单位，它生成ROS，然后作为第二信使发挥作用，如在血管生成中。27我们发现VEGF激活Rac1并介导NADPH氧化酶在激光损伤后CEC和CNV中生成ROS。12从本报告中的数据来看，Rac1似乎也在CCL11刺激的CCR3信号的下游被激活。
我们发现在CCL11刺激的CECs中PI3-激酶被激活。我们以前曾报道过PI3-激酶作为Rac1的上游调节因子参与可溶性VEGF介导的CEC迁移。13然而，与VEGF和CCL11在激活Rac1方面具有相加效应不同，我们没有发现VEGF与p-Akt之间存在协同效应。
CCR3作为一种GPCR，其在嗜酸性粒细胞趋化和最近的血管生成中的作用历来被研究。9,28在本报告中，我们研究了VEGF和CCR3信号通路在介导CEC向趋化因子CCL11迁移中的相互作用。研究VEGF和CCR3信号之间的潜在串扰有几个原因。VEGF和CCR3信号传导在人类新生血管性AMD中都很重要。2,9我们之前发现，RPE产生的VEGF在CEC中触发VEGFR2信号和活性Rac1，导致CEC的RPE迁移。14,15我们发现CCL11刺激的CCR3信号也刺激Rac1激活和CEC趋化迁移。在这项研究中，我们现在报告了一些证据表明CCR3和VEGF信号通路之间存在串扰。首先，我们发现CCR3和VEGFR2之间的物理相互作用是通过CCR3与VEGFR2的共同免疫沉淀来响应配体CCL11和VEGF的刺激。趋化因子及其受体通常与其他趋化因子受体或受体酪氨酸激酶（RTKs）在复杂网络中起作用，包括同二聚体和异二聚体，29我们的联合免疫沉淀结果表明，这是VEGFR2和CCR3之间的一种可能性。我们还发现CCL11治疗激活了VEGFR2，即VEGFR2磷酸化增加。GPCR可以通过受体（包括RTK）的转录激活与其他受体相互作用，29例如VEGFR2。我们报告中的数据表明，CCL11可能能够通过CCR3作用于VEGFR2。我们的数据还显示，活化的CCR3和VEGFR2之间的相互作用对Rac1的下游活化具有协同作用，这在RPE的CEC迁移中很重要。12–14
总之，我们已经表明，年龄增加和与AMD相关的应激，如氧化应激，导致CECs及其配体在RPE中CCR3的表达增加。CCR3本身能够介导CEC迁移，也可以调节VEGFR2信号传导并加剧Rac1激活。CCR3与VEGF信号的相互作用表明，抑制CCR3可能是预防或治疗威胁视力的新生血管性AMD的另一种方法。然而，在老年人眼的切片中，我们发现CCR3标记出现在其他视网膜神经元中。这可能表明抑制CCR3可能对视网膜存活不利。Rac1介导的NADPH氧化酶激活可产生ROS和细胞因子，据报道，这也会导致视网膜神经元损伤。30因此，抑制CCR3诱导的Rac1激活可以选择性地促进神经元存活。在未来的研究中，我们将研究串扰的其他机制以及通过途径的潜在下游信号传导，如ERK（细胞外信号调节激酶），31在其他疾病中被CCR3信号激活。
鸣谢
作者感谢凯文·培根博士（Axikin Pharmaceuticals）在本研究中使用的CCR3抑制剂，并为本研究提供部分资金，感谢沙米·卡内卡博士在标记人类视网膜切片方面的帮助。
脚注
由国家眼科研究所拨款R01 EY015130（MEH）和EY017011（MEH。
披露：H.王，Axikin Pharmaceuticals（F）；E.S.威琴，Axikin Pharmaceuticals（F）；Y.Jiang（江），无；B.安巴蒂，无；格罗斯尼克劳斯阁下，无；M.E.哈特内特、Axikin Pharmaceuticals（F）
工具书类
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