解吸电喷雾电离质谱用于脂质表征和生物组织成像

摘要

1.简介

DESI是最近开发的一组质谱环境电离技术之一，在该技术中，样品在环境中进行检测，只需最少的预处理[1–三]. DESI已越来越多地用于生物样品的直接脂质分析，尤其是在医学领域。[4–6]这些特点加上易于执行，使得DESI在成像质谱领域具有一定意义[7]. DESI-MS成像实验是通过带电液滴的撞击喷雾在x和y方向直接扫描未改性样品进行的；获得的化学信息可以绘制成二维图像，记录特定离子的丰度[8]. 生物样品分析的许多有希望的结果都是基于脂质组成的差异[9,10]. 迄今为止，DESI-MS成像已用于分析多种类型的人体组织，包括病变组织、相邻正常组织和非病变组织。测量结果具有很高的重现性，尽管不是严格定量的。在这篇综述中，我们介绍了DESI-MS成像的原理，它在脂质分析和表征中的应用，描述了检测到的脂质类别，并讨论了该技术。

高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）和薄层色谱（TLC）传统上用于脂质分离，随后可进行MS分析[11,12]. 然而，这些都是冗长的方法，无法提供MS成像技术所获得的空间分布信息。成像质谱法可以直接分析各种化合物的空间分布，而不需要通常在组织化学方案中使用的荧光或放射性标记[13,14]. 目前大多数成像MS都是使用二次离子质谱（SIMS）的解吸电离方法进行的[15,16]和基质辅助激光解吸电离（MALDI）[17]. 这两种电离方法都是需要精密仪器的真空技术。尽管MALDI仍是生物样品分析的主要成像MS技术，但作为一种基于电喷雾的电离方法，DESI成像带来了不同的互补功能。MALDI传统上用于成像生物组织中的蛋白质和肽等较大的生物分子[18]尽管它对分析较小的分子如脂类也很有效[19]. MALDI进行小分子分析的一个限制是低分子中基体离子的干扰米/z质谱区[20]. 相比之下，脂质很容易电离并由DESI-MS测量。DESI-MS已被用于直接分析、表征和成像许多类别的脂质，包括脂肪酰基（FA）、甘油磷脂（GP）、甘油脂（GL）、鞘脂（SP）和甾醇脂（ST）。最近，DESI-MS主要应用于组织切片分析，试图根据脂质特征和特定脂质种类的存在进行疾病诊断，以串联MS实验为特征，并辅以数据的多元统计分析(图1) [21].

在单独的窗口中打开

图1

生物组织的DESI-MS成像示意图。将组织样本冷冻切片，并将组织切片解冻安装在载玻片上，然后通过常规或反应性DESI成像直接分析。根据检测到的脂质谱和通过串联质谱分析鉴定特定脂质种类，进行组织表征。对于癌症诊断，对整个图像数据进行统计分析，目的是生成分类规则。图部分改编自参考4.

脂质由一组具有不同结构和功能的不同分子组成，在细胞过程中发挥重要作用[22]. 作为表征生物样品特征的手段，对脂质成分的研究具有潜在的重要性，因为了解脂质在正常细胞中的作用可以帮助了解脂质在疾病状态下的作用[9]. 大量研究表明，组织中的脂质成分会因疾病状态而异[23]. 在癌症研究领域，许多研究侧重于细胞中发生的分子变化，标志着恶性肿瘤的开始，并为早期检测和治疗干预提供了手段[24,25]. 例如，GPs反映细胞生长、成熟和分化以及组织细胞类型。细胞膜上的GPs分布不均匀，特定物种特别出现在内膜或外膜中[26]. 这种分布的改变表明细胞转化，包括恶性肿瘤[27]. 在结肠癌中，与正常组织相比，原发性和结肠癌肝转移均表现出异常的GP分布，表明细胞膜的结构和功能发生了改变[28,29]. 脂质组织含量的变化也表明人类脑癌的肿瘤进展，在胶质瘤发展过程中，鞘磷脂（SM）、甘油磷酸丝氨酸（PS）和半乳神经酰胺（GalCer）含量发生了显著变化[30]. 作为GP的构建块，FA对细胞结构和功能非常重要，因此可以预计癌细胞的FA组成将不同于正常细胞。许多研究试图检测FA的变化特征，以了解恶性肿瘤的代谢途径。例如，FAs成分的变化发生在上皮内子宫颈病变、子宫颈癌和显示致癌途径的正常细胞之间[31,32]. 胃癌组织和正常胃粘膜的FA模式也不同，癌组织中的总FA含量增加[33]. 除癌症外，还有许多其他疾病的脂质成分改变，如神经变性阿尔茨海默病[34]和心血管疾病，包括动脉粥样硬化[35]. 越来越多的脂质组学研究报告了这些发现，强调了测定生物组织中脂质的组成对于确定和诊断疾病的预后价值的重要性。

2.DESI-MS脂质分析方法

在DESI-MS实验中，带电液滴的喷雾直接喷向样品。当喷雾冲击样品时，会形成一薄层溶剂，分析物可能会溶解在其中。当其他初级液滴到达样品表面时，它们会溅出含有溶剂膜中溶解的分析物的次级微液滴。这种机制，“液滴拾取”[36]，导致含有分析物的液滴在露天产生，然后通过加热的延伸毛细管输送到质谱仪。基础研究表明，在典型的DESI实验条件下，初级液滴的平均速度约为120 m/s，平均直径约为3µm[37]. DESI过程的模拟显示，从单个滴管-薄膜碰撞事件中释放出数十个0.8至3.3µm范围内的微液滴[36]. 解吸过程结束后，电离通过类似于电喷雾电离的机制发生。串联质谱或高质量分辨率实验通常用于单个脂质的详细表征。

2.2. 图像质量

DESI成像中使用的样品台沿x方向移动，同时连续记录质谱。x方向上的一系列线用于覆盖目标的整个样品表面[43]. 注意，当光栅穿过样品时，应选择y轴运动的方向，以避免将样品溅到尚未分析的区域。数据采集完成后，可以在二维图像中绘制从样品中检测到的特定离子的空间分布。虽然第一个2D DESI成像实验使用了一个半自动实验室建造的移动台，但DESI应用的扩展导致了DESI离子源的商业化。

据报道，几个实验参数会影响DESI-MS数据的质量[44]. 虽然对于标准的1D DESI-MS实验，喷雾点的大小、形状和方向没有那么重要，但为了获得高质量的2D图像，需要对DESI-MS成像实验的喷雾点进行优化[8,45]. 最重要的参数是DESI喷嘴的质量、喷雾源的几何参数（喷雾、样品和质谱仪入口之间的角度和距离）以及喷雾参数（气体和溶剂流速）[46]. 通过精确切割硅胶毛细管，使边缘不参差不齐，可以获得用于组织成像的小圆形喷雾点[45]. 大多数使用自制DESI成像源的报告使用内部熔融石英毛细管进行50µm i.d.和150µm o.d.的溶剂输送，以及外部熔融石英毛细管250µm i.d.和350µm o.d.的气体输送，对于常见的水溶剂系统，如甲醇：水（1:1），其产生直径约200µm或更小的喷雾点和ACN：水（1:1）[8]. 虽然可以实现较低的空间分辨率[47]在所有微探针实验中都涉及到图像质量和数据采集时间之间的权衡。分析时间随空间分辨率呈二次增加，对于环境MS成像的许多但并非所有生物应用，200µm的分辨率足以获得所需信息(图2). 在几何参数方面，一些研究报告了最佳设置，这些设置已成为成像目的的标准[43]. 尖端至表面距离为2–3 mm，入射角为50–54°，收集角为5–10°，喷雾至入口距离为4–8 mm通常是DESI-MS成像的理想参数[44]. 总的来说，喷雾参数应根据溶剂系统以及分析物在样品表面溶解和解吸的难易程度进行调整。喷雾造成的物理损伤取决于气体压力和溶剂流速的选择。虽然较强的喷雾通常会产生更丰富的信号，但空间分辨率会降低，从而影响图像质量[43]. 使用水性溶剂进行成像实验时，典型气体压力在130–180 psi之间，溶剂流速在1.5µL/min和5µL/min.之间。

在单独的窗口中打开

图2

在14种动物的正常脑组织的微阵列上记录的DESI-MS图像。从美国Biomax公司获得了三种连续冷冻组织阵列；一个用于负离子模式分析，一个用于正离子模式，另一个用于苏木精和伊红（H&E）染色。每个组织芯的直径为2 mm，厚度为5µm。使用甲醇：水（1:1）以1.5µL/min的速度分析样品。总分析时间约为2小时，即约8分钟/组织芯，空间分辨率为250µm。H&E染色阵列的光学图像如（A）所示。DESI-MS离子图像显示了检测到的主要离子，即脑组织的特征[45]，（B）米/z834.4，PS（40:6）；和（C）米/z888.5，负离子模式和（D）米/z782.6，聚碳酸酯（34:1）+钠⁺在正离子模式下。虽然不打算对图像进行详细比较，但离子图像显示，在所分析的许多不同动物物种的大脑中存在许多相同的脂质物种。不同物种之间脂质分布的差异主要归因于在选择用于显示的离子的情况下分析的组织切片中存在白色和/或灰质。

2.3. 溶剂系统

虽然几何和喷雾参数会影响DESI-MS图像质量，但所选溶剂系统的化学和物理特性会影响所获得的分子信息。许多研究表明，在DESI过程中，溶剂组成显著影响分析物的解吸和电离程度[48,49]. DESI的一个特点是能够修改喷雾成分以增强或促进不同物种的电离，这大大扩大了其在脂质分析中的应用。在传统的DESI-MS实验中，水与甲醇或乙腈（ACN）的混合物（有或没有酸性改性剂）是分析生物样品中脂质最常用的溶剂系统[38]. 通常对高脂含量的组织（如大脑和脊髓）进行分析时，不需要添加酸修饰剂，从而可以大量检测不同的FA、GP，如甘油磷酸乙醇胺（PE）、血浆苯基甘油磷酸乙醇胺（plasm-PE）、PS、甘油磷酸肌醇（PI）、甘油磷酸甘油（PG）和SP，如负离子模式下的硫酸酯类（ST），以及检测PE和甘油磷酸胆碱（PC）等GP，以及正离子模式下SP，如SM和Cer[45,50]. 在甲醇/水二元溶剂系统中添加弱酸改性剂（如乙酸或甲酸）也很常见，用于DESI-MS在正离子模式下分析极性脂质，如大鼠脑的报告[51]，小鼠胰腺[51]，小鼠肺提取物[42]，鸡心[51]和人类哮喘硬化斑块[52]. 其他组织类型（如犬膀胱）极性脂质的常规DESI-MS分析[53]，人类膀胱[10]，肾脏[4]，前列腺[54]和睾丸[55]使用乙腈和水的二元混合物（1:1），在没有任何酸改性剂的情况下，也成功地进行了试验。所用溶剂混合物的极性极大地影响了从组织中获得的信息，可以对其进行调整以增强来自其他化合物类别的信号。例如，我们最近观察到，通过使用二甲基甲酰胺（DMF）与水和甲醇/水的混合物，可以从小鼠脑切片中获得独特的脂质特征。而甲醇与水的混合物（1:1）产生的质谱中GPs的高信号米/z如前所述，范围为700–1000[45]DMF:water（1:1）的混合物大大增强了低分子量化合物的信号，例如小代谢物、FA和FA二聚体(图3). 此外，DMF：水-溶剂系统没有破坏性，可以对组织切片进行连续染色，甚至可以进行额外的DESI-MS分析。作为另一个例子，已经发现甲醇和氯仿（3:1）的二元溶剂体系可以显著增强几种神经节苷脂的解吸[56]. 最近的一项研究表明，DESI喷雾溶液的表面张力可以通过向传统溶剂系统中添加表面活性剂来控制，例如甲醇：水（1:1）。使用表面活性剂喷雾溶液研究的许多分析物的解吸电离信号增加了一个数量级以上[57]. 虽然使用普通溶剂可以很容易地分析富含脂质的组织，但含有相对高浓度蛋白质的组织可能会更加困难。通过DESI-MS成像对人类晶状体组织进行脂质分析在普通溶剂系统中是不可能的，但在甲醇：水（4:1）溶剂系统中添加0.5%盐酸（HCl）可以在正离子模式下检测多种不同的脂质[58]. 在这种情况下，只有当DESI喷雾物理破坏组织纤维细胞紧密致密的结构时，才能进行脂质检测。该组织结构内的空间分布与MALDI成像结果一致[59]通常情况下，比较是可能的。

在单独的窗口中打开

图3

在相同的实验条件下，使用（A）甲醇：水（1:1）和（B）DMF：水（1:1）作为溶剂系统，对安装在玻片上的小鼠脑组织切片（15µm）的负离子模式质谱进行分析。甲醇：水（1:1）光谱与之前报道的小鼠大脑光谱非常相似[45]而DMF:water（1:1）溶剂系统增强了从低米/z脂质和小代谢产物。

2.5. 反应式DESI

基于喷雾的技术的一个优点是，可以将试剂添加到溶剂喷雾中，以便样品中存在的特定化合物或官能团可以作为目标进行化学反应。这些反应性DESI实验[61]可用于提高不易被DESI-MS电离的分子的灵敏度和选择性[62,63]. 化学反应发生在采样点，同时采集质谱，从而实现目标化合物的成像。反应性DESI中使用的反应示例包括苯硼酸与顺二醇的环化[64]酰基离子的乙酰化[65]，肟的形成涉及类固醇和羟胺上的羰基[62]醇基和甜菜碱醛（BA）之间的半缩醛盐形成[63]以及肼和酮甾类羰基之间的肼生成[66].

通过用羟胺衍生类固醇羰基，将其添加到DESI喷雾溶液中，进行了反应性DESI脂质分析，以靶向未经处理的尿液样品中的合成代谢类固醇[62]. 在电喷雾过程中形成的质子化羟胺离子在溶液的初级微滴中被带向基底。它们在塌陷的液滴中与中性类固醇迅速反应，提高了所研究的所有七种类固醇的电离效率，包括一种糖基化类固醇。动物合成的主要甾醇胆固醇具有低质子亲和力和低酸度，因此通过ESI和MALDI等技术检测胆固醇具有挑战性[67,68]. 反应性DESI已成功用于直接快速分析干燥血清样品、脂质提取物和几种动物组织切片中的胆固醇。这是通过在DESI溶剂中加入甜菜碱醛来实现的，甜菜碱甲醛是一种化合物，通过亲核加成与胆固醇的醇基发生选择性和快速反应，形成一种带电的半缩醛，很容易被DESI-MS检测到。当使用BA作为试剂时，反应性DESI中不仅可以检测胆固醇，还可以检测维生素D2和维生素D3等其他ST。胆固醇的定量分析已经实现，纯胆固醇的检测限在1ng范围内。胆固醇检测的反应性DESI实验的成功可以从以下光谱中看到图4虽然传统DESI成像分析大鼠脑切片时完全没有胆固醇信号米/z直接从组织中观察到高丰度488.5。对该反应DESI实验的条件进行了优化，溶剂系统ACN:H₂O： 发现掺有65 ppm BA的DMF（8:3:1）是胆固醇成像的理想材料。除大鼠大脑外，动脉粥样硬化组织和猪肾上腺也可以对胆固醇进行反应成像[69]. 在人类动脉粥样硬化斑块组织中，胆固醇在组织中某些富含脂质的区域的分布更为丰富，这与已知的人类斑块形成情况一致[52].

在单独的窗口中打开

图4

（A） 大鼠脑组织作为溶剂ACN:H的反应DESI质谱（背景扣除）₂O： DMF（8:3:1）掺杂65 ppm BA，显示衍生胆固醇（S/N≥100）和各种磷脂。（B） 使用ACN:H的大鼠脑组织的正常DESI质谱（背景扣除）₂O： DMF（8:3:1）作为喷雾溶剂，不添加BA试剂。注意，在质量范围内看到的一些附加峰值米/z（z）与正常DESI光谱（B）相比，反应性DESI（A）的850到1000是PC与BA和水的反应产物。（C） 的机制就地BA阳离子与醇的羟基之间的反应。图改编自参考63.

3.DESI-MS应用程序

3.1. 脂质特征

串联MS

线性离子阱（LIT）质谱仪通常用于DESI实验，因此串联质谱已成为脂质表征和鉴定的主要方法。由于DESI给出的质谱与ESI给出的质谱相似，因此DESI可以通过串联质谱数据与现有ESI质谱文献或真实脂质标准的MS/MS数据进行光谱比较来确认脂质分配[70–74]. 已经进行了几项研究，目的是通过常规DESI-MS表征直接从组织或脂质提取物中检测到的脂质，重点是脂质类如PC、SM、PS、PE、ST、PI、PG和神经节苷脂的裂解途径[12,38,50,56,58]. 通过串联质谱测量和精确质量测量，实现了负离子模式下FA、DG、LPG和LST的识别和表征[66]. 脂质加合物的碎片可以提供加合物结构的信息。例如，负离子模式下PC醋酸盐加合物的主要片段对应于分子间S引起的乙酸甲酯的中性损失_N个胆碱头基团和醋酸盐之间的反应[38]. 序列产物离子（MS^三)选择主要片段离子进行进一步解离的光谱显示了与酰基链对应的峰，证实了附着在甘油主链上的FA的身份。同样，PC和SM氯加合物的主要碎片离子对应于胆碱头基团中中性氯甲烷的损失[52]. 当使用反应性DESI作为分析手段时，重要的是要了解所使用的反应产物，以便预测其解离时将形成的碎片离子。例如，BA和其他分子量为M的仲醇之间的反应被检测为米/z（M+102），其中102是BA的分子量[63]. DESI-MS成像也可以在串联MS模式下进行，通过该模式可以记录已知碎片的特定化合物的分布[75]. 药物氯氮平在不同组织切片中的分布已通过MS/MS模式下的DESI-MS成像报告，通过绘制其主要片段离子在米/z270 [76]. 当存在高化学噪声或绘制具有相同标称质量的两种化合物的不同分布图时，这种高度特异的成像方法非常有用。

鉴于天然存在的大量脂质及其相互之间的密切关系，异构体脂质和等压脂质之间的区别尤为重要。最近通过银加合物的形成证明了通过DESI-MS分析区分FA异构体的成功例子[60]. 根据银的串联质谱分析，评估并区分了三组异构体⁺-由这些FA形成的加合物。对于烯烃位置不同的一对FA异构体，例如α-亚麻酸（6Z，9Z，12Z–C₁₈H（H）₃₀哦₂)和亚麻酸（5Z、9Z、12Z–C₁₈H（H）₃₀哦₂)，数据达到MS⁵用于阐明烯烃键的位置(图5A). 乙酯衍生物与同源性较高的游离脂肪酸之间的区别，例如异构体对棕榈油酸乙酯（9Z）和油酸（9Z(图5B)，很容易使用简单的MS/MS实现，因为乙酯产生主要的乙烯损失裂解离子，而FA光谱主要由水消除。使用银加合物实现异构体区分的能力可以通过反应监测扫描纳入DESI成像。这将提供一种同时获取2D图像和获取FA结构确认的方法。

在单独的窗口中打开

图5

DESI分析中，银附着后的串联质谱可以成功区分异构体FA。（A） 不同烯烃位置的FA异构体，α-亚麻酸（6Z，9Z，12Z–C₁₈H（H）₃₀哦₂)和亚麻酸（5Z、9Z、12Z–C₁₈H（H）₃₀哦₂)和（B）乙酯衍生物及其游离FA异构体、棕榈油酸乙酯（9Z）和油酸（9Z）。图改编自参考60.

精确质量测量

脂质表征的另一种方法是使用FT-ICR或orbitrap等质量分析仪进行高分辨率测量。例如，DESI-MS使用轨道质谱仪对大鼠脑组织进行了高分辨率成像(图6) [77]. 选择30K质量分辨率进行成像实验，观察到虽然从大鼠脑组织获得的脂质剖面与之前在低分辨率下看到的类似，但可以识别出一些新的峰值。几对峰的差异小于0.1米/z单位。有趣的是，这项研究表明米/z834个先前使用线性离子阱确定为PS（40:6），由两种不同的分子物种组成，PS（40:6）和C20 ST，在大鼠大脑中具有独特的空间分布，突出了DESI成像实验中高质量精度的相关性。然而，与C20 ST相比，PS（40:6）的丰度更高，证明了之前的分配米/z834离子作为PS（40:6）；该离子产生了MS/MS实验中的主要碎片。

在单独的窗口中打开

图6

DESI-MS成像可以使用高分辨率测量进行，从而提高其脂质分析和鉴定的能力。负离子模式DESI-MS使用轨道质谱仪以30K质量分辨率对大鼠脑矢状切面进行成像的数据。[77]（A）质谱（B）m/z 834处的峰差小于0.1米/z单位鉴定为PS（40:6），米/z834.5279和C20磺胺，米/z834.5758. （C） 这些物种在大鼠脑切片中的独特分布，突出了DESI成像高质量分辨率分析的有用性。图改编自参考77.

TLC/HPTLC分离后的DESI-MS

虽然人们希望在一次快速分析中检测尽可能多的物种，但复杂生物样品中的基质效应会影响某些物种的检测难度，包括一些浓度相对较低的物种。一种解决方案是执行快速且相对粗糙的分离步骤，例如薄层色谱法（TLC），然后由DESI-MS进行直接分析。TLC提供了一种快速、稳健且廉价的方法，可以从含有复杂混合物的溶液中分离脂质[78]. HPTLC，然后通过DESI-MS直接询问TLC板上的成分，已用于猪脑脂质的分析[12]. 在未经HPTLC分离的情况下，DESI也对猪脑提取物进行了直接分析，这使得可以检测到更丰富的脂质物种PS（36:1）、PS（40:6）、PE（34:2）、PI（38:4）和ST（24:1）。等压化合物的峰重叠，¹³碳同位素的贡献、电离效率的差异和较低的绝对浓度使其他脂质的鉴定变得困难。然而，HPTLC分离后再进行DESI-MS成像，可以在负离子模式下对8个脂质类特异性斑点进行成像，并识别出50多个脂质。

除了用于分析脂质提取物外，HPTLC最近还与DESI-MS相结合，用于分析完整的组织切片。从直接安装在HPTLC板上的16µm厚大鼠脑组织切片中洗脱脂质，然后在负离子模式下进行DESI-MS分析脂质种类[56]. 检测到多种PI、PS、血浆PE、PE、羟化硫苷（hST）、ST以及神经节苷脂。检测到的神经节苷脂包括GQ1、GT1、GD1a/b和GM1。这些结果与大鼠脑组织的HPLC/DESI-MS分析显示出良好的定性一致性。HPTLC与DESI-MS联用是直接从薄组织切片中分析神经节苷脂和其他脂质的一种简单快速的方法。

3.2. 生物组织的DESI-MS成像

组织特征

2005年，利用正常小鼠胰腺组织、正常大鼠脑组织和鸡心周围的正常脂肪组织，首次以正离子模式对完整生物组织进行DESI-MS分析[51]. 通过DESI-MS成像从组织分析中获得的生物分子信息集中在正负离子质谱的不同区域。在负离子模式下，低m/z区域（100–400）由脂肪酸和代谢产物的单体主导，中心区域（m/z 500–700）由脂肪酸、二酰基甘油和赖氨酰磷脂的二聚体主导，高m/z区域（700–1100）由甘油磷脂和鞘脂等复杂脂质主导。在胰腺小鼠和大鼠脑组织记录的光谱中，最丰富的物种是质子化和钠化的PC和SM，这两种组织类型之间的特定物种和相对离子丰度不同[51]. 在不切割组织的情况下分析鸡心脂肪组织，并在负离子模式下通过直接在组织表面喷洒DESI来观察游离脂肪酸。在负离子模式下使用DESI-MS成像分析正常大鼠脑组织，并创建二维离子图像，显示特定脂质在整个组织切片中的空间分布[7]. 在记录的光谱中，最丰富的脂质种类是脱质子游离脂肪酸、PS、PI和ST。单个离子图像显示了这些种类在大脑白质和灰质中的不同分布。此后，DESI-MS成像应用迅速扩展。值得注意的是，使用小鼠大脑的连续冠状切片构建3D分子图像[45]. 正如在大鼠大脑上进行的初始实验所示，在所分析的大脑切片中，在负离子模式下观察到两种不同的MS峰值模式，对应于与白色和灰色脑物质的脂质组成相关的差异[45]. 因为PS（40:6）是灰质中含量最丰富的脂质，ST（24:1）是白质中含量最高的脂质[45]这两种化合物的相对分布提供了灰色/白色物质在3D中分布的大致指示。通过在所分析的36个2D小鼠脑切片中检测到的不同脂质种类的离子图像，可以揭示更多细节，从而生成3D小鼠脑模型，在该模型中可以识别几个解剖结构，例如胼胝体外侧部。这些模型提供了有关脑内脂质的三维分子分布以及这些分子与脑亚结构之间的相关性的全面信息(图7).

在单独的窗口中打开

图7

从DESI质谱（a）中检测到的许多不同的脂质物种中，可以在成像实验中跟踪特定的离子来构建2D离子图像（B）。在本例中，PS（40:6）的离子图像，米/z834.4（绿色）和ST（24:1），米/z888.8（红色）已覆盖。3D模型（C）可以由一组合适的2D数据构建。它们说明了特定生物分子在组织亚结构中的空间分布。通过在图像中添加深度维度，可以更好地可视化对象及其组成结构在空间中的相对位置。图改编自参考45.

脂质是脊髓组织中最常见的生物分子，占其干重的50%[50]. 利用DESI-MS对正常大鼠脊髓组织切片进行分析和成像，以确定其脂质组成和空间分布(图8) [50]. 与大脑一样，脊髓由白质组成，包括传感器和有髓轴突，围绕灰质，主要由神经元细胞体组成。在负离子和正离子模式下对大鼠脊髓横截面进行成像，以显示化学信息与形态学特征的相关性。生成的离子图像显示了特定物种在白质或灰质中的定位。在负离子模式质谱中最常见的物种是脱质子游离FA、PC、PE、血浆PE、PG、PS、SM和ST，而在正离子光谱中观察到PC、PE和SM。在负离子模式下米/z750.6，血浆PE（38:4）在白质内显示出近似均匀的分布，但在灰质内信号强度低得多[50]. 在正离子模式下，PC（24:1）和SM（42:1）的离子图像显示，这些脂质在脊髓横截面的白质区域内的定位相同。灰质的“蝴蝶”形状在离子图像中得到了解析，DESI的空间分辨率小于200µm。

在单独的窗口中打开

图8

通过DESI-MS成像进行组织表征。（A） 大鼠脑的光学图像；PS的DESI-MS离子图像（40:6），米/z834.4，在负离子模式下以单位分辨率获得；大鼠脑的代表性负离子模式DESI-MS质谱图，峰值对应于PS（40:6）星号。（B） 大鼠脊髓的光学图像；ST的DESI-MS离子图像（24:1），米/z888.8，在负离子模式下以单位分辨率采集；大鼠脊髓的代表性负离子模式DESI-MS质谱图，峰对应于ST（24:1）星号。（C） 猪肾上腺的光学图像；PC的DESI-MS离子图像（16:0/16:0），米/z756.6，在正离子模式下以单位分辨率采集；猪肾上腺的代表性正离子模式DESI-MS质谱图，峰值对应于PC（16:0/16:0）星号。（D） 示意图显示了用于选择人类晶状体区域的轮廓，外部区域标记为灰色；PE的DESI-MS离子图像（18:1e/18:1），米/z730在正离子模式下以单位分辨率采集；代表性的正离子模式DESI-MS质谱来自人类晶状体外层，其峰值对应于PE（18:1e/18:1）星号。根据参考文献改编7,50,69和58.

DESI-MS成像用于描述脊髓损伤（SCI）后脊髓组织中脂质谱的时间依赖性变化，并将这些变化与损伤相关的生化事件相关联[66]. 该研究的特点是与邻近正常组织进行比较，重点是在负离子模式下检测到的脂质种类[66]. 脊髓损伤后，损伤中心和邻近区域的脂肪酸、二酰甘油（DAG）、溶血磷脂（+120%至+240%）的相对强度增加，脂质强度（-30%）略有下降[66]. 该数据表明，由于磷脂酶A的激活，脱髓鞘过程中发生脂质水解₂酶。在损伤的信号索组织中检测到前列腺素和羟基二十碳四烯酸丰度的增加表明损伤后的氧化降解。此外，反应性DESI成像检测到丙二醛（脂质过氧化的产物和氧化应激的标志物），显示与正常样本相比，受损脊髓组织背侧区域丙二醛的相对丰度增加，由于SCI引发的过氧化生化事件。DESI-MS成像可以提供化学和空间信息，有助于加深对脊髓损伤期间发生的脂质生物化学的了解。

利用DESI-MS对猪和兔肾上腺组织进行成像，以研究多种脂类以及肾上腺素和去甲肾上腺素等小分子的空间分布(图8) [69]. 肾上腺被分成两个不同的结构，髓质和皮质，髓质中有静脉。发现位于髓质内的特定GP物种有PC（36:0）、PC（44:4）、PC“30:1”、PC“32:1”和PC“34:0”[69]. 位于皮质内的包括PC（36:4）、PC（36:1）和PC（38:4）。在负离子模式下，花生四烯酸、油酸、二十碳三烯酸、DHCer（34:0）、PE（38:4）、PI（36:4）和PI（38:5）等物种定位于肾上腺皮质。相比之下，在髓质中发现抗坏血酸、血浆PE（38:4）、血浆PE和PS（40:4）。利用反应性DESI实验也绘制了猪肾上腺的胆固醇图。由此产生的DESI-MS离子图像显示，与皮层相比，髓质内靠近静脉的区域的信号强度较小。虽然在兔子肾上腺中观察到类似的脂质分布，但肾上腺素和去甲肾上腺素的分布和相对比例（已知为物种特异性）与在猪肾上腺中观察的不同。肾上腺素的DESI-MS离子图像显示，其信号在猪肾上腺髓质的顶部边缘以更高的丰度被检测到，而在兔肾上腺髓质中均匀分布。DESI-MS成像清楚地显示出直接从不同动物物种组织中分析内源性小分子的巨大潜力。

通过DESI-MS分析和成像人类晶状体的脂质成分(图8). 人类晶状体中的二氢鞘磷脂（DHSM）含量很高，最丰富的GP是不寻常的1-O-烷基醚连接的PE和PS[58]. 在较低质量范围内，米/z在以下质量范围内观察到350–650种胆固醇、LPE、Cer和Cer1P米/z675至米/z在正离子模式下鉴定出975种SM、PE、PS、PC和LacCer物种。通过DESI-MS分析，可以在一次测量中全面了解人类晶状体的脂质组成。DESI-MS还用于创建人类晶状体组织的2D图像，以显示检测到的广泛脂类的丰度分布[58]. SM（d18:0/16:0）和SM（d18:24:1）在晶状体的外部和屏障区域更丰富。最丰富的1-O-烷基GP，PE（18:1e/18:1）主要分布在晶状体外代谢活性区域的一个薄环中，而相关的脂质PS（18:1e/18:1）以及所有其他低丰度1-O-烷基PE和PS脂质的分布相同。胆固醇几乎均匀地分布在整个晶状体中，在最内侧区域的信号强度最低。特殊的脂质，如Cer（d18:0/16:0）、Cer1P（d18/0/16:0[58]. 观察到LPE（18:1e）有一个有趣的分布，因为它有一个环形分布，集中在PE（18:1e/18:1）的环形分布中，转换发生体内通过酶或化学途径，一种可能性是LPE（18:1e）可以通过PE（18:1e/18:1）中酰基18:1 FA的水解产生。人类晶状体脂质的组成和分布随年龄而改变，来自28岁、50岁和58岁个体的DESI-MS晶状体图像表明，随着年龄的增长，晶状体内部的Cer浓度（d18:0/16:0）增加。为了将生成的DESI-MS离子图像与特定脂质的绝对量进行比较，从每个区域、外部、屏障、内部和核心提取脂质，并通过ESI-MS进行量化。对于PE（18:1e/18:1），ESI-MS测定的区域浓度与DESI-MS测定的相对丰度密切匹配。DESI-MS成像确定的空间和强度分布似乎代表了晶状体内的实际脂质分布[58].

疾病状态评估

生物组织样品的DESI-MS成像最初应用于动物组织，但第一个旨在诊断疾病的实验是使用人类肝脏进行的[51]. 在正离子模式下获得的脂质谱可以区分健康组织和疾病组织[51]. 在随后的工作中，参考方法是标准组织病理学检查，通常使用苏木精-伊红（H&E）染色组织。虽然DESI-MS成像有可能将癌症与正常组织区分开来，但仍需要对更大、更多样化的队列进行大量研究(图9).

在单独的窗口中打开

图9

DESI-MS成像已被用于分析人类癌组织，包括人类乳头状肾细胞癌和人类生殖细胞精原细胞瘤。A）DESI-MS离子图像米/z885.7，识别为PI（18:0/20:4），B）使用所有离子和C）H&E染色组织切片的PLS-DA合成图像，实现癌症诊断。通过DESI成像对人类生殖细胞组织进行分析，发现hat D），而seminolipid（16:0/16:0），米/z795.4，在正常小管中大量存在，E）抗坏血酸，米/z175.2，在癌组织中呈高强度。癌组织和正常生殖组织之间的区别与从H&E染色组织切片的病理分析中获得的F）诊断一致。根据参考文献改编4和55

DESI-MS成像已应用于分析犬膀胱癌和邻近正常组织，并根据多标记脂质成功区分肿瘤和正常组织[53]. 在负离子模式下，与邻近正常组织相比，PS（36:1）、PG（36:2）、PI[53]. 当以正离子模式成像时，在病变组织切片中检测到PC（34:1）和PC（36:2）的钠和钾加合物的强度增加，而在正常组织切片中可以看到较高的SM（34:1.）强度。除了传统的DESI-MS实验外，喷雾溶剂还掺杂了银离子，以便通过形成阳离子加合物来增强对烯烃的检测[60]. 在正离子模式下，检测到的主要化合物，游离脂肪酸、油酸和花生四烯酸的银加合物在癌组织中的丰度增加。此外，在大于米/z900，在犬膀胱组织中检测到一种特殊的TAG，TG（52:3），但分布在整个组织中，对癌症诊断无效[60]. 将DESI-MS分析和诊断的所有组织切片与H&E染色的连续切片进行比较，以进行病理诊断。

DESI-MS成像实验已在多种人类癌症组织中进行，成功诊断了疾病。令人惊讶的是，虽然多种正常组织中存在许多相同的脂质种类，但恶性肿瘤期间发生的异常代谢对每种癌症来说都是独特的，导致脂质种类的不同特征，DESI-MS很容易识别，并与特定疾病明确相关。对于人类膀胱癌，使用DESI-MS对20名不同患者的组织样本（包括肿瘤和每个患者的相邻正常组织）进行成像[10,81]. 在负离子模式下，癌组织中观察到特定物种，如PS（36:1）、PI（38:4）、FA（18:1）和FA（作为单体和二聚体）的强度增加，并作为疾病的假定分子标记物。脂肪酸特别是二聚体的强度增加可能表明存在脂滴，脂肪酸的共同定位增加导致二聚体形成增加。脂滴被认为是炎症疾病和多种癌症的关键调节器，癌细胞中脂滴积聚增加[82]. 这些脂滴在细胞内具有复杂的功能，控制对恶性肿瘤重要的细胞过程，如细胞活化、迁移、增殖和凋亡[82]. 人类膀胱组织的DESI-MS脂质图谱使癌组织和正常组织之间有了清晰的视觉区别。使用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法，使用多元统计分析可视化组织切片并创建诊断规则，以表征组织切片。虽然仅解释离子图像通常很有价值，但数据的统计评估对于诊断应用更为有利。统计方法依赖于采集的整个质谱数据集，而不是选定的离子图像。DESI-MS离子图像与统计生成的图像关联良好，这些图像与88%的膀胱癌检查病例的病理诊断相关[10].

在随后的DESI-MS研究中，分析了两种人类肾癌的癌组织和邻近正常组织[4]. 利用成像DESI检查11对人乳头状肾细胞癌（RCC）和邻近正常组织的薄组织切片和9对透明细胞RCC和相邻正常组织的薄层切片的脂质谱。DESI-MS图像显示了负离子模式下癌组织和正常组织中特定GPs和游离FAs的不同空间分布，与H&E染色的连续组织切片进行了比较米/z885.7（PI（18:0/20:4）），米/z788.5（PS（18:0/18:1）），米/z773.5（PG（18:1/18:1））和米/z913.5（PI（22:4/18:0）），正常组织在米/z215.3（FA（12:0））。与乳头状肾细胞癌样品不同，对于透明细胞肾细胞癌组织样品，无论是癌组织还是正常组织，脂质种类的绝对或相对强度都没有明显的视觉趋势，这突出表明需要使用整个质谱数据进行多元统计分析。使用PLS-DA处理的潜在结构正交投影进行多元统计分析，以全质谱作为预测因子，对组织对进行可视化和分类。PLS-DA成功区分了乳头状和透明细胞RCC的肿瘤和正常组织，验证集的错误分类率分别为14.3%和7.8%。它还用于区分乳头状和透明细胞RCC，以及与联合正常组织的区别，根据验证集确定的合理误分类率为23%。整体DESI-MS成像结合多变量统计分析能够区分两种类型的肾癌和配对正常组织，并根据GP谱区分每种类型的癌症和合并的正常样本。

来自34名不同患者的人类前列腺癌组织标本也在负离子模式下进行了DESI-MS成像检查[54]. 脂质的分布存在差异，发现一种单分子硫酸胆固醇（CS）在癌前病变或癌症中过度表达，而在邻近正常组织中几乎没有信号。CS在前列腺癌进展中的许多生物学作用已被假设，包括其影响细胞信号传导、细胞分化和凋亡的能力[83–85]. 与前列腺癌类似，在负离子模式下使用DESI-MS成像分析人类精原细胞瘤组织和邻近正常组织[55]. 在正常小管组织中只发现了一类化合物，即半醇脂（半醇脂32:0）和半醇脂30:0），从而可以确定这种组织类型。此外，在大多数癌组织中，抗坏血酸发出强度显著增加的信号，提供了一种单一的化合物来识别癌组织[55].

使用DESI-MS在负离子和正离子模式下对包括WHO II级、III级和IV级（胶质母细胞瘤）在内的7名人类受试者的胶质瘤标本进行检测[5]. 在II级星形细胞瘤的负离子模式质谱中观察到的主要离子对应于ST、PS和PI类脂质。相比之下，IV级胶质母细胞瘤（GBM）的光谱显示PS、PI和血浆苯基-PE类脂质的负离子丰度最高。在分析的少量GBM组织中，低级别星形细胞瘤观察到的ST离子完全缺失。虽然在II级和IV级星形细胞瘤中观察到的脂质谱是不同的，但从III级星形细胞肿瘤中获得的负离子模式质谱显示了过渡性脂质成分[5]. 在正离子模式光谱中观察到随着恶性肿瘤的增加，组织脂质分布的类似趋势。在II级星形细胞瘤的阳性模式谱中观察到一系列被鉴定为半乳神经酰胺（GalCer）的离子最为丰富，而在III级星形细胞肿瘤的谱中则观察到较低的丰度，并且在GBM样品的谱中没有这些离子。在连续切片上进行标准组织学H&E染色，以确认通过DESI-MS分析获得的诊断。这些初步发现表明，通过阴性和阳性离子DESI-MS分析，可以建立三种不同的脂质谱，分别对应星形细胞肿瘤的恶性程度II、III和IV。由于使用DESI-MS成像可以很容易地评估这些独特的脂质特征，因此这种方法可能可以转化为胶质瘤的原位分析，以帮助术中手术决策[5].

除了试图建立诊断癌症所需的数据基础外，DESI-MS还用于表征其他疾病状态的组织。DESI-MS用于人体动脉斑块的化学分析和成像[52]. 由于动脉粥样硬化与血管壁内脂蛋白的积累有关，人们希望确定斑块内的脂质组成及其空间分布。PC、SMs和溶血甘油磷酸胆碱（LPC）分别以钠加合物和氯加合物的形式在正离子和负离子模式下被检测到。在DESI喷雾中添加氯化铵，可以在正离子模式下检测和成像CE。检测这些CE的能力是重要的，因为它们构成了富含脂质的斑块的主要部分，并且它们的丰度与斑块破裂有关。还使用BA反应性DESI实验对斑块组织中的胆固醇进行成像。斑块的脂质组成会随着时间变化而变化，因此能够表征和成像这些脂质以更好地了解动脉粥样硬化是很有价值的。

4.DESI-MS分析中常见并发症

成像质谱的一个普遍局限性是基质效应的发生。生物组织含有各种不同化学类别的脂质以及许多其他化合物类型。在被研究组织的同一区域中，盐或甚至不同种类的脂质的存在会改变特定脂质的电离效率[86]. 因此，与其他成像技术一样，如果不使用LC-MS并行进行提取和定量，则不可能确保观察到的脂质准确、完整地代表组织成分。这是因为可以通过预分离步骤将离子抑制效应降至最低，而这是以损失空间分布信息为代价的。2D–TLC分离后，DESI-MS对猪脑提取物中的脂质进行了分析，这证明了这一点，与直接分析提取物而不进行任何分离相比，该方法可以识别更多的脂质[12]. 离子抑制使脂质分析不能完全定量。虽然DESI-MS成像还不是一种定量技术，但观察到的特定物种的信号强度与组织中存在的绝对数量相关；人晶状体组织中的内源性脂质和动物组织中的外源性药物代谢产物[58,76]. 通过DESI-MS成像对人类疾病组织和正常组织中的脂质化合物进行研究所获得的定性结果尚未得到平行LC-MS实验的跟进。然而，如果成像条件允许检测感兴趣的生物标记分子，那么数据在多大程度上代表了样本中所有物种是一个有趣但次要的问题。主要要求是可以从不同的组织秒中获得比较数据。与MS脂质分析相关的还有结构对脂质种类的精确归属。与其他未经事先分离的电离技术一样，DESI光谱包括等压（相同标称质量）和同分异构化合物的贡献。令人眼花缭乱的各种脂质分子包括许多结构异构体和立体异构体。例如，GP是高度相关的复合脂质，其构建块FA通常包含12到22个碳原子，可以位于sn-1型或sn-2型位置在甘油主链中，并且可能在FA链上不同碳的一个或多个碳-碳键中不饱和。此外，游离脂肪酸中双键的异构使精确的结构分配复杂化；这就是为什么在DESI实验中通常根据负离子模式下分子离子的质量暂时指定FA的主要原因[50]. 暂定任务基于有关样品中出现的异构体的先验知识。在给定的米/zDESI-MS光谱中的值，尤其是使用离子阱分析仪提供的单位质量分辨率时。然而，脂质分析中结构归属的困难并没有阻止DESI-MS的脂质图谱绘制。对于大多数MS成像应用，异构体物种的精确归属并不像蛋白质二级结构测定那样至关重要。这是因为在大多数通过DESI成像进行的诊断研究中，鉴定质谱中的脂质对于组织病理学和MS数据的经验相关性来说是不必要的[10]. 此外，当目标是使用多元统计分析对MS数据进行可视化和分类时，对精确脂质鉴定的需求进一步降低[4]. 尽管如此，脂质种类的鉴定和结构表征非常重要，因为了解特定脂质在正常细胞中的作用可以帮助了解脂质在疾病状态下的功能。

5.观点和结论

脂质很容易被DESI成像实验检测到，并且由于其不同的生理和病理作用、分子多样性和结构多样性，具有明确的诊断价值。正在进行有潜力推进DESI成像技术的基础研究。由于溶剂组成、掺杂和极性会影响DESI-MS的脂质离子化，因此，通过优化溶剂组合来分析和评估溶剂依赖性DESI对组织的形态影响，可以扩大生物组织的脂质组学和代谢组学信息，如图3此组合对于之前提交给DESI分析的切片的显微镜分析和术中DESI应用是不可或缺的。另一个基本技术问题涉及扩大反应性DESI应用，以专门针对传统DESI中不易电离的脂质类别，或抑制特定类别的电离，以提高分析特异性。在反应性DESI实验期间，对尚未探索的反应系统从表面飞溅的微滴中反应速率加速几个数量级的最新观察也可能有价值[61].

快速筛选正常或病理组织样本是DESI成像研究的主要目标，该方法在组织微阵列的DESI成像手稿中得到了例证(图2). 组织微阵列的高通量化学分析可以通过添加内部标准来进行，以允许脂质定量，这项工作可以与DESI成像并行进行。虽然通过DESI成像获得的200μm的标准空间分辨率足以用于疾病诊断和肿瘤边缘信息，但越来越多的迹象表明，对于DESI成像可能有用的许多其他应用，这种空间分辨率将是一个很大的限制。因此，我们目前正在努力大幅提高DESI的空间分辨率，并将很快就此进行报告。另一个研究领域是评估药物对动物模型的影响或在多种动物物种之间绘制脂质图谱。此外，DESI成像尚未广泛解决代谢物的直接组织分析及其在不同病理中的变化。

该综述仅涉及DESI的单环境电离成像方法。介绍中提到了DESI成像与其他MS成像方法的关系。所研究的系统与DESI（特别是MALDI成像）获得的数据有许多相似之处。例如，两种MALDI都检测到神经节苷脂[87]和DESI[56]在负离子模式下经平面色谱分离脑脂提取物。胆固醇在米/z369.3由MALDI作为其脱水产物[M+H–H₂O]⁺在生物流体中[88]而在人类晶状体DESI成像中也观察到脱水胆固醇[58]. DESI也报告了从人类肝组织中检测到质子化和钠化形式的PC和SM[51]和MALDI[89]. MALDI对负离子模式下大鼠脑切片的成像[90]和DESI[7]在白质区显示ST（24:1）的优先分布。除DESI外，其他环境电离方法也可能越来越多地用于成像。已经有大量关于激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）等基于激光的方法的使用的文献[91]激光烧蚀与流动大气压力余辉（LA-FAPA）耦合[92]大气压力飞秒激光成像质谱（AP fs-LDI IMS）[93]用于环境图像等。还必须注意，DESI和其他环境电离方法不需要在成像模式中使用。据报道，生物组织实验中直接从组织样品或TLC提取物中检测脂质成分[56]. 本质上的非成像实验，如纸喷雾电离，也在生物组织分析中发挥作用[94]. 例如，可以通过将组织切片放在纸三角上并施加高压来检查其脂质组成[95]. 另一种最近开发的非成像技术，快速蒸发电离质谱（REIMS），允许体内和就地外科干预期间MS组织分析[96]. 这项技术检测组织直接电热解吸产生的手术烟雾的脂质成分。使用光谱库匹配和PCA开发了组织识别系统，可以实时诊断和识别组织特征。

图10总结了DESI脂质成像技术发展的基准，以及通过筛选其他癌组织和脂质相关疾病并在大样本中验证生物标记物，将其“转化步骤”应用于常规医学应用的开始。DESI电离源可用于多种类型的质谱仪。包括DESI成像功能的便携式仪器很可能会上市。由于高分辨率不是MS脂质分析的基础，因此小型仪器具有许多优点[97–99].

在单独的窗口中打开

图10

可视化表示与DESI成像技术开发和翻译相关的里程碑。本综述详细介绍了发展的“步骤”，随后应进行转化研究阶段，目的是将常规医学诊断用于肿瘤分类或进展，以及体内DESI成像应用程序

新鲜组织分析的发展应该为最具挑战性的DESI应用，即手术中的应用铺平道路。手术仍然是大多数人体实体瘤最重要且通常是首选的治疗方式。虽然最大限度的肿瘤全切除手术是可取的，但在实践中，边缘的描绘非常困难，因为肿瘤可以与正常组织非常相似[5]. 因此，在大多数类型的肿瘤，尤其是脑胶质瘤的手术中，关于正常组织和癌组织边界的信息非常重要。基于DESI的探针的开发体内肿瘤切除或微创手术中的组织分析有助于确定肿瘤边界，然后根据mm尺度上的化学组织成分切除肿瘤。

总之，DESI脂质成像在生物医学和生命科学中的应用应包括与异常脂质代谢相关的人类疾病的诊断、癌组织定位的生物标记物、分级和术中手术边缘评估。组织中特定类脂的具体分布尚不清楚[100]因此，与胚胎学和组织工程相关的基础科学和生物技术也应受益于DESI脂质成像。

确认

缩写

脚注

工具书类