组织工程A部分。2011年11月；17(21-22): 2879–2889.
三维胶原支架内诱导弹性基质沉积
，理学学士。1和，博士。
1,,2 拉瓦尼亚·文卡塔拉曼
1南卡罗来纳州克莱姆森市克莱姆森大学生物工程系。
阿南·拉马穆尔蒂
1南卡罗来纳州克莱姆森市克莱姆森大学生物工程系。
2俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所生物医学工程系。
1南卡罗来纳州克莱姆森市克莱姆森大学生物工程系。
2俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所生物医学工程系。
通讯作者。 通信地址：Anand Ramamurthi博士，克利夫兰诊所生物医学工程系，俄亥俄州克利夫兰市ND 20欧几里德大道1500号，44195。电子邮件：aumamar的gro.fcc 2010年12月27日收到；2011年6月24日接受。
摘要
完整的弹性基质及其主要蛋白弹性蛋白的存在维持了周期性扩张的弹性动脉的结构稳定性和血管平滑肌细胞（SMC）的健康功能。一些血管疾病中出现的弹性基质加速降解，再加上成年SMC再生丢失的弹性蛋白的能力较差，可能会对血管内稳态产生不利影响。同样，我们无法诱导成体细胞合成原弹性蛋白前体并将其交联为天然弹性基质的结构模拟物，这限制了组织工程弹性基质结构的努力，尤其是在SMCs/成纤维细胞主要沉积大量胶原的工程结构中。在本研究中，我们发现转化生长因子β1（TGF-β1）和透明质酸低聚物（HA-o）协同增强了植入由非生成性I型胶原组成的静态加载三维凝胶中的成年大鼠主动脉平滑肌细胞（RASMC）的弹性基质沉积。虽然与非添加对照培养物相比，实验病例中的原弹性蛋白生成在3周内没有显著增加，但我们观察到基质弹性蛋白沉积显著增加；在接受最低剂量TGF-β1和相应剂量HA-o的构建物中的可溶性基质弹性蛋白，以及在与升高的赖氨酰氧化酶蛋白量相对应的最高剂量下的不溶性基质弹性蛋白。然而，尽管进行了弹性诱导，但在所有实验情况下，总的基质产量仍然很低。在所有提供的剂量下，这些因素都降低了基质金属蛋白酶（MMP）-9的生成，尤其是活性酶的生成，尽管MMP-2水平仅在与高剂量TGF-β1培养的构建物中降低。免疫荧光显示胶原结构中的弹性纤维不连续，结构边缘除外。Von Kossa染色显示所有病例均无钙化沉积。这项研究证实了在胶原环境中，利用TGF-β1和HA-o诱导成年RASMC合成基质弹性蛋白的益处，而不是非添加性对照，这本质上不利于弹性发生。
介绍
T型他功能正常各种软结缔组织的细胞外基质（ECM）中存在完整的弹性纤维网络，从而维持了它们之间的联系。在弹性动脉内，如主动脉，主要由弹性蛋白组成的弹性纤维占干组织重量的～50%。1虽然弹性基质负责为血管提供必要的反冲和顺应性以适应血流，但完整的弹性纤维也通过机械转导调节血管平滑肌细胞（SMC）的行为，2尤其是在形态发生和疾病进展期间。三一旦受伤，弹性基质就无法修复，因为（a）成体细胞合成的弹性蛋白前体（原弹性蛋白）较差，（b）原弹性蛋白在弹性基质中的招募和交联效率低下，以及（c）进一步组织成弹性纤维。4因此，当受到损伤或疾病破坏，或先天畸形或缺失时，无法恢复健康基质，可能会严重影响组织的体内平衡。这就是为什么这些病变节段的人工移植物置换（例如ePTFE）虽然能够恢复血管弹性和顺应性，但无法提供生物刺激来恢复健康的血管细胞表型和组织内稳态的原因之一。
使用接种在可生物降解支架（天然或合成）上的自体成年血管SMC进行组织工程弹性血管置换的替代策略受到了挑战，因为这些细胞类型的弹性原性较差，并且缺乏仿生复制和增强原弹性蛋白合成的材料和方法的知识，招募、交联和基质组装。4弹性基质沉积不良的问题在此类组织工程结构中的细胞微环境中尤其严重，这些结构中始终富含再生胶原，从而将SMC转换为合成更少、弹性更少的表型。5
对于克服成人血管细胞弹性差的潜在益处，我们的实验室先前确定了透明质酸低聚物（HA-o）和转化生长因子-β1（TGF-β1）对培养的成年大鼠和人SMC合成弹性蛋白前体、弹性基质沉积和纤维形成的协同作用。6,7我们还发现TGF-β1增加了原弹性蛋白和基质交联酶赖氨酰氧化酶（LOX）mRNA的表达水平，同时抑制基质降解基质金属蛋白酶（MMPs）的活性。7,8负电荷HA也被认为能凝聚原弹性蛋白分子，从而更有效地将这些前体进行局部交联并组织成成熟纤维，就像糖胺聚糖（GAG）在发育中的主动脉中的作用一样。9,10我们之前的数据也表明HA的低聚物形式，特别是4-和6-单体也能增强弹性蛋白mRNA的表达。胶原基质的存在是复制血管组织结构和力学的中心，11而血管细胞，无论选择何种支架，都能强力合成胶原蛋白。4,12因此，必须研究预先存在的胶原微环境对细胞自身合成纤维弹性基质的能力的影响，以及细胞对提供的弹性因子的反应。5为了利用上述因素实现并增强胶原组织内弹性基质沉积，在本研究中，我们研究了这些因素在静态加载三维（3D）细胞化胶原构建物中不同剂量组合的影响。
材料和方法
大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养
根据南卡罗来纳医科大学批准的动物实验方案，从成年Sprague-Dawley大鼠中获取腹主动脉。刮去内膜和外膜后，主动脉的中层被切成1-2 mm长的碎片，首先在含有20%v/v胎牛血清（加拿大安大略省PAA科学公司）、1%v/v Penstrep（伊利诺伊州罗克福德Thermo Scientific公司）、，和175 U/mL胶原酶II（新泽西州莱克伍德市沃辛顿生物化学公司）在37°C下持续1小时。然后在含有上述溶液并添加0.25 mg/mL弹性蛋白酶III（沃辛顿生化制品）的第二消化混合物中培养这些碎片45分钟。最后在200克持续5分钟，然后重新配制颗粒并在含有20%v/v血清和1%v/v Penstrep的DMEM-F12中培养。由此获得的原代大鼠主动脉平滑肌细胞（RASMCs）在T-75烧瓶中培养和传代。低传代细胞（P3-P5）用于接种胶原蛋白构建物。
细胞化胶原蛋白构建物的制备
利用细胞需要的胶原蛋白收缩并形成致密凝胶的固有特性来制造3D结构。胶原蛋白-细胞混合物在矩形（3.8×2×1.5 mm）硅橡胶（Smooth-On，Inc.，Easton，PA）孔内进行校准，该孔浇铸在直径为100 mm的玻璃小孔中。13,14模具/器皿在121°C下蒸汽灭菌30分钟。为了在静态张力下直接压实胶原蛋白凝胶，用不锈钢针固定的聚氨酯管（均在1 N HCl中灭菌20分钟，并在无菌磷酸盐缓冲盐水中冲洗）固定在每个孔的末端。
将酸溶性I型胶原蛋白（BD Biosciences，Bedford，MA）与5×DMEM/F12和0.1 N NaOH混合并逐滴添加以滴定混合物至生理pH值。将RASMCs（第3-5代）胰蛋白酶化、离心并重新悬浮在培养基中，并添加到上述溶液中，以获得最终浓度为2 mg/mL胶原蛋白、1×106DMEM-F12中的细胞/mL、20%v/v血清和1%v/v Penstrep。所有的混合都是在冰上进行的，以防止达到生理pH时胶原蛋白过早聚合。然后将等量的胶原蛋白-SMC混合物分配到每个孔中，并在CO中培养237°C培养箱。几小时内，胶原蛋白-细胞混合物开始凝胶并固定在聚氨酯端部支架周围。这些支架防止了凝胶的纵向收缩，但能够在垂直于油井长轴的方向上收缩().
在生长培养基中以六种不同的剂量组合（0.1、1和10 ng/mL TGF-β1，分别含有0.2和2μg/mL HA-o）外源性补充HA-o和TGF-。由于这是一项开创性研究，将HA-o和TGF-β1结合用于三维培养物中SMC的弹性基质合成，因此缺乏文献表明这种模型的合适剂量。因此，我们根据二维（2D）培养的结果推断了当前研究的剂量范围，并利用一个范围来包括比二维培养中使用的浓度低和高一个数量级的浓度，以评估最佳条件。7,15,16本研究中使用的HA低聚物混合物主要由4单体组成（～75%），其中6单体和8单体构成平衡。它们是通过消化高分子量HA（1.5×106Da；Genzyme Biosurgery，马萨诸塞州剑桥市），含睾丸透明质酸酶（37°C时为40 U/mg；沃辛顿生物化学公司），如我们之前所述。17培养21天，每2天更换一次培养基。将每个微孔中的废培养基与之前从相同微孔中取出的小份培养基混合，并在−20°C下冷冻，直到培养期结束时进行生化分析。
施工压实
所有结构均使用数码相机定期拍摄，并使用ImageJ（NIH，Bethesda，MD）成像软件测量其中心宽度。在第21天，测量每个结构的收缩程度（压实比），作为井宽和结构中心宽度的百分比差异。每个结构上至少进行了三次测量。
细胞定量的DNA分析
在培养21天时测量胶原结构中RASMCs的DNA含量，以估计细胞数量相对于播种时的增加。简单地说，将凝胶从支架上分离出来，并在65°C的10 mg/mL蛋白酶-K（Gibco-Invitrogen）中消化10 h，直到基质结构完全溶解。通过将溶液煮沸10分钟使酶失活。然后将消化后的溶液在冰上超声3分钟以溶解细胞，并使用基于Hoescht染料的荧光测定法测量DNA含量。假设每细胞6 pg的DNA计算细胞数。18结果以细胞增殖率（21天时的细胞计数/初始播种密度）表示，并以该比率与对照组相比的折叠变化表示。
弹性蛋白含量的快速测定
RASMCs合成的总弹性蛋白使用商用Fastin分析试剂盒（纽约州韦斯特伯里市Accurate Scientific and Chemical Corporation）进行测量。对三种不同的弹性蛋白组分进行了分析，即（a）原弹性蛋白，即细胞合成的弹性蛋白的可溶性前体，存在于中等组分中，（b）交联度较低的碱溶性基质弹性蛋白，以及（c）高度交联的碱不溶性基质弹力蛋白。混合培养基的体积分数直接用于测量原弹性蛋白。为了测量基质弹性蛋白，首先用0.1 N NaOH在95°C下处理构建物1 h并离心。产生的上清液由碱溶性基质弹性蛋白组成，而颗粒由碱不溶性基质弹力蛋白组成。将可溶性基质部分在110°C下用等体积的6 N HCl中和16 h，过夜干燥，在水中重新配制，并使用试剂盒定量。由于Fastin试剂盒仅测量可溶性α-弹性蛋白（～60 kDa），因此首先用0.25 M草酸在95°C下溶解不溶性基质颗粒1 h，然后用10 kDa截止膜（Millipore，Billerica，MA）过滤离心。然后用检测试剂盒定量保留在过滤器上方的可溶性基质弹性蛋白。由此测量的Tropoelastin和总基质（碱溶性+碱不溶性）归一化为各自结构中的细胞计数。计算基质产量（即基质弹性蛋白/（原弹性蛋白+基质弹性蛋白）的比值×100）。
LOX和MMPs-2和-9的蛋白质印迹
通过Western blotting半定量比较不同处理条件下RASMCs合成的LOX酶蛋白和弹性基质金属蛋白酶-2和-9的数量。第21天，将收获的构建物在液氮中研磨成粉末，在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中提取（Invitrogen，Carlsbad，CA），然后使用BCA分析试剂盒（Thermo Scientific）分析总蛋白含量。19在还原条件下，将相当于3μg蛋白质的体积加载到用于LOX分析的4%-12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶和用于MMP分析的10%SDS-PAGE凝胶中，以及预沉淀的分子量梯（Invitrogen）。然后将凝胶湿性转移到聚偏氟乙烯膜上。之后，用含有5%w/v牛奶的TBST（含0.01%v/v吐温-20的Tris缓冲盐水，pH 7.4）封闭膜1小时，并用多克隆抗体（1:1000，1.5）进行免疫染色h） 针对LOX（圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州圣克鲁斯）、MMP-2（马萨诸塞州剑桥Abcam）、MMP-9（Millipore）和HRP-结合二级抗体（1小时内1:10000）（宾夕法尼亚州匹兹堡GE Healthcare Biosciences），并使用ECL-plus化学发光检测试剂盒（GE Health Bioscienses）进行检测。然后剥离印迹后的膜，并对其进行重新保护，以进行β-肌动蛋白负荷控制（Abcam）。使用ImageJ软件（NIH）量化条带，表示为相对密度单位（RDU），并将其归一化为对照。对每种情况下3个斑点产生的条带进行分析。
明胶酶谱法检测MMPs-2和-9
将含有消化构建物中5μg蛋白质的体积加载到每行10%明胶酶谱（Invitrogen）中，并在90 V下沿着预处理蛋白阶梯运行2 h。然后将凝胶在2.5%V/V Triton X-100中洗涤30 h分钟以除去SDS，随后将它们在底物缓冲液中孵育过夜以激活MMPs。然后将凝胶在考马斯亮蓝溶液中染色45分钟，并脱色1.5小时，直到在蓝色背景下可以看到清晰的条纹。19使用ImageJ量化带强度，并表示为实验病例的RDU值，与对照培养物的RDU数值标准化。对每种条件下三种凝胶产生的条带进行分析。
弹性基质和矿化的观察
培养21天时，将构建物固定在4%w/v福尔马林中并嵌入石蜡中。然后使用基于Verhoeff Van Gieson（VVG）的弹性染色试剂盒（ScyTek Laboratories，Inc.，Cache，UT）对组织切片（5μm厚）进行弹性蛋白染色。为了使用免疫荧光观察弹性蛋白，将切片置于0.05%w/v蓬塔明天蓝色（西格玛，圣路易斯，密苏里州）中培养30分钟，使用含有DAPI（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories，Inc.）的Vectashide进行安装，盖上盖子，并使用可见红色（德克萨斯红）荧光滤光片进行观察。蓬塔明天蓝色熄灭发射光谱可见绿色区域中弹性蛋白和胶原蛋白的自荧光，并将弹性蛋白的自发光转移到光谱的红色区域。20用兔抗大鼠弹性蛋白抗体检测同一样品的不同切片中的弹性基质，从而确认以这种方式标记的切片的弹性蛋白特异性荧光。使用荧光显微镜对切片进行成像，并通过计算其角度标准偏差来量化结构中弹性纤维的排列。21使用Image Pro软件（马里兰州贝塞斯达）测量单个纤维的长度和角度。长径比大于2（长轴：短轴）的弹性蛋白沉积被假定为纤维，仅用于量化。
通过使用基于Von Kossa的钙染色试剂盒（ScyTek Laboratories Inc.）标记切片来确定构筑物中是否存在钙化沉积物。
统计分析
所有定量结果的分析来自n个=每个病例6次独立重复，并报告为平均值±标准偏差。采用双向方差分析确定各组间的统计显著性。结果被认为对第页-值≤0.05。
结果
构件压实
不同剂量TGF-β1和HA-o组合培养的构建物的压实率低于不受因素影响的对照构建物(). 在接受两种最低剂量组合之一的构建物中，压实率最低，具体而言，0.1 ng/mL TGF-β1和2μg/mL HA-o（46.57%±4.12%，第页<0.05).
与第0天相比，第21天构件中心宽度的百分比变化(n个=每箱6个）*与对照文化相比差异的重要性，视为第页<0.05.#单杠配对治疗之间结果差异的重要性，视为第页<0.05.
细胞定量
如中所示在TGF-β1（0.1 ng/mL）和HA-o（2μg/mL），最低（21天内增加1.96±0.23倍；第21天时对照培养物中细胞计数的63%±13%）。
弹性因子对细胞增殖率的影响。根据接种后0天和21天DNA检测计算出的每个细胞6 pg DNA的估计值计算细胞数，并测定其比率并与对照组进行比较(n个=每个治疗6个重复构建）。与对照组相比，差异被认为是显著的第页<0.05 (*).#水平杆配对治疗结果差异的显著性第页<0.05.
弹性蛋白含量
弹性蛋白含量标准化为相应结构中的细胞计数，这些比率进一步标准化为为因子处理对照结构确定的类似比率。在21天内，对照组中的细胞合成了4.4±0.5 ng/细胞的原弹性蛋白，9.4±3.4 pg/细胞的基质弹性蛋白，包括4.5±1.8 pg/细胞碱性可溶性基质弹性蛋白和1.5±1.1 pg/细胞碱不溶部分。除了在提供的最高剂量组合（10 ng/mL TGF-β1和2μg/mL HA-o）下，每个细胞的前胶原合成不受TGF-β1和HA-o培养的影响，在该剂量组合下，观察到显著增加（与对照相比为1.5±0.2倍）(). 另一方面，与对照组相比，大多数实验病例中每个细胞的弹性基质沉积显著增加，在使用低剂量TGF-β1（0.1 ng/mL）和HA-o（0.2或2μg/mL）组合培养的构建物中增加最多（5.4±0.8倍和5.3±1.1倍）(). 还注意到，基质弹性蛋白的增加，尤其是在提供的因子剂量较低时，与交联度较低、碱溶性基质弹性蛋白组分的增加相比，与交联性较强、碱不溶性基质弹力蛋白组分增加更多相关；在所提供的最高剂量组合下，两种组分与对照组相比增加的倍数相似(). 矩阵产量()在低剂量因子组合培养的构建物中，TGF-β1浓度为0.1 ng/mL，HA-o浓度为0.2μg/mL（0.6%±0.2%）2μg/mL，分别为0.6%±0.1%。
TGF-β1和HA-o对弹性蛋白合成的影响。（A）与对照培养物相比，用HA-o和TGF-β1培养的样品中每个构建物的原弹性蛋白和总基质弹性蛋白合成的差异。（B）因子处理对合成碱溶性基质弹性蛋白和交联碱不溶性基质弹力蛋白的影响。（C）因子处理对基质弹性蛋白产量的影响，即沉积在基质中的细胞产生的总弹性蛋白量的分数第页<0.05 (n个=每种情况下为6）。#水平杆配对治疗结果差异的显著性第页<0.05. 转化生长因子-β1、转化生长因子-beta1；HA-o，透明质酸低聚物。
MMP蛋白分析
显示了MMPs-2和-9的代表性免疫印迹和MMP-2的酶谱。比较用TGF-β1和HA-o因子处理的胶原构建物与未处理对照构建物中测得的MMP-2和−9含量。在Western blot上检测到MMP-2为两条不同的带，分别对应于酶原形式（～72 kDa）和活性形式（～62 kDa”）。MMP-9在其酶原（～92 kDa）和活性（～82 kDa。与对照组相比，在使用低剂量因子组合培养的构建物中，MMP-2蛋白总量（活性和非活性形式）的增加最大。总的来说，与对照组相比，经因子处理的构建物中MMP-9的合成减少，尽管在TGF-β1因子含量最高（10 ng/mL TGF-α1和0.2或2μg/mL HA-o）、剂量组合最低（0.1 ng/mL TGF-βl和0.2μg/mL HA-o）的构建物上，MMP-9合成的减少最大，且具有统计学意义。
影响酶合成和活性形式的因素。代表性免疫印迹（A）MMP-9和（B）MMP-2表示每种情况下的活性和非活性蛋白带，以及（C）液氧。（D）MMP-2的典型明胶酶谱显示62kDa处的活性酶带和72kDa的酶原。赖氨酰氧化酶；基质金属蛋白酶。
根据两种蛋白酶的免疫印迹测定，实验病例与对照组相比，MMP-2和−9的总蛋白合成差异*与对照组相比的统计差异第页<0.05 (n个=每箱3个）。#水平杆配对治疗结果差异的显著性第页<0.05摄氏度(n个=每箱3个）。
比较因子处理结构和对照结构中MMP-2的活性和非活性形式。MMP-9活性没有显示，因为条带不存在或太微弱而不能可靠地定量。一般来说，在对照组和因子处理组中，MMP-2酶原水平都很低，除了那些用低剂量HA-o（0.2或2μg/mL）和TGF-β1（0.1 ng/mL）培养的细胞。除低剂量HA-o（0.2或2μg/mL）和TGF-β1（0.1 ng/mL）培养的细胞外，构建物之间MMP-2活性形式的数量也大致相似，其中酶活性显著增加。
明胶酶谱法测定MMP-2含量的影响因素。数据表明，与对照培养物相比，实验病例中酶谱带的相对密度单位发生了翻倍的变化*与对照组相比差异的显著性第页<0.05 (n个=每箱3个）。#基质金属蛋白酶数量的显著差异(第页<0.05）。
LOX蛋白质合成
培养物中LOX酶（31kDa）合成的Western blot分析显示，与对照组相比，所有病例中的LOX酶水平均升高(). 从蛋白质的三个独立印迹中量化带强度()就RDU而言，表示为控制的折叠变化。在含有10 ng/mL TGF-β1和0.2μg/mL HA-o的培养物中，LOX蛋白合成增加最多（是对照组的3.5±0.5倍）。
通过western blotting测定，与未经处理的对照培养物相比，含有TGF-β1和HA-o因子的培养物中LOX蛋白水平的折叠变化*与对照组的差异对于第页<0.05 (n个=每箱3个）。#水平杆配对治疗结果差异的显著性第页<0.05.
弹性基体的观察
弹性蛋白VVG染色()Pontamine天蓝猝灭后的免疫荧光标记()显示在所有受因素处理的结构中都存在弹性纤维，尽管由于截面厚度有限，无法确定单个纤维的连续性和总长度。弹性纤维更加丰富，在结构边缘处显得更加完整。
显示绿色细胞核分布的结构切片的代表性荧光显微照片（A），红色弹性蛋白/弹性纤维（B）以及两者的叠加（C）石蜡包埋切片用蓬塔明天蓝色处理，以熄灭胶原蛋白的自体荧光，并将弹性蛋白的自体荧光素转换为红色波长。细胞核用DAPI染色。放大倍数：20×（比例尺=100μm）。在线提供彩色图像www.liebertonline.com/tea
根据角度标准偏差计算的弹性纤维排列在不同培养条件下没有差异(). 然而，有大量的弹性纤维()存在于所有接受弹性因子的培养物中（接受1 ng/mL TGF-β1和2μg/mL HA-o的培养物除外）。Von Kossa染色()钙化矿床表明，所有构造中均缺乏基质矿化。
胶原凝胶结构中的弹性纤维排列以度表示的角度标准偏差（A）以及对齐光纤的数量（B）.*与非因子处理对照培养物差异的显著性，视为第页<0.05.#水平杆配对治疗结果差异的显著性第页<0.05.
矿床的Von Kossa染色。没有任何黑点/沉积物表明在研究的剂量范围内缺乏TGF-β1诱导的基质矿化。动脉瘤大鼠主动脉染色为阳性对照，显示内膜下钙化沉积物（黑色）。在所有情况下，细胞核都染成粉红色。比例尺=500μm。在线提供彩色图像www.liebertonline.com/tea
讨论
迄今为止，新生后细胞类型合成原弹性蛋白和将前体交联成纤维基质的能力较差，这对工程化弹性组织构建（如血管置换）的尝试提出了挑战。22,23从文献中也可以明显看出，细胞外微环境对细胞表型和行为具有关键影响。在这种情况下，大量工作证明，当体外分离和培养SMCs时，完整血管壁内SMCs的收缩表型以及向更合成（即增殖和ECM生成）表型的转变，5,24无论是在组织培养聚苯乙烯（TCPS）上，还是在由多种天然物质（如纤维蛋白）之一制成的支架内22)或合成（例如，聚乙醇酸[PGA]25)聚合物。从弹性蛋白再生的角度来看，与这些支架接触的血管平滑肌细胞可以增强原弹性蛋白的合成。尽管细胞支架可能为细胞粘附和增殖提供初始框架，但预期支架将逐渐生物降解，细胞合成的ECM将积累并承担主要的承重作用。这些ECM蛋白中的关键是胶原蛋白，细胞在培养的早期阶段就能够大量优先合成和沉积胶原蛋白。虽然从主动脉内复制3D胶原基质的角度来看，这种胶原纤维沉积是有利的，但也有重要且无可辩驳的证据表明，这种微环境促进了SMC中更静止、更收缩的表型（与其他支架材料如PGA和纤维蛋白相比），这并不特别有利于它们合成弹性蛋白和建立弹性基质结构的能力。25–29因此，工程化软弹性组织（如血管组织）的努力将从弹性蛋白再生刺激中受益匪浅，该刺激可以克服胶原基质对弹性蛋白合成施加的不利微环境，这是大多数应用的标准。
此前，我们的实验室确定了TGF-β1和HA-o对增加RASMCs的原弹性蛋白前体生成和交联基质沉积的弹性益处。7,8,30然而，这些研究是在2D TCPS表面上培养的RASMC层上进行的，已知SMC在2D TCPS表面上呈现出比它们在完整血管内表现出的更具增殖性的合成表型。为了将上述因素的具体益处转化为一种培养模型，该模型更接近于胶原三维基质微环境，胶原三维基质微观环境自然存在于脱细胞血管组织支架内，并且由接种在其他支架上的细胞生成，我们研究了上述因素对种植在静态张力下维持的三维胶原结构中的成人RASMC的影响。
与未经处理的对照组相比，用HA-o和TGF-β1培养的组内细胞数量通常稍大，只有中间因子剂量存在显著差异。仅在提供的最高剂量下（即10 ng/mL TGF-β1和2μg/mL HA-o），细胞计数增加显著减弱。虽然这些结果与其他组的观察结果一致，其中TGF-β1浓度增加会降低细胞密度，31这些结果与我们之前观察到的TCPS表面SMC增殖的剂量依赖性抑制形成了鲜明对比。6目前的结果表明：（a）与胶原ECM的相互作用与2D培养相比改变了SMC的行为，（b）这种胶原-SMC相互作用使细胞对TGF-β1和HA-o不敏感，仅在提供的最高剂量下细胞数量显著减少就证明了这一点。从我们的结果中也可以明显看出，与我们最近在2D培养中发表的观察结果类似，TGF-β1的作用主要是在两种HA-o剂量下对TGF-α1的双相剂量依赖性增殖反应。32然而，从组织工程应用的角度来看，其中组织质量的增长取决于ECM生成细胞的可用性的增加，最理想的是为SMC增殖提供更大动力的HA-o/TGF-β1剂量组合（即0.1 ng/mL的TGF-β1和0.2或2μg/mL的HA-o）。
在胶原3D基质中，SMC可能会转变为更具收缩性的表型，其特征是ECM合成减少，这是以前的报道。25–29同时，我们的结果表明，在三维胶原结构中，HA-o和TGF-β1共同对原弹性蛋白的合成几乎没有影响。唯一的例外是最高因子剂量，这导致了适度但显著的增加。虽然这与我们之前发表的2D培养研究完全相反，在2D培养中，我们甚至注意到我们在这里测试的因子的最低剂量组合，与非添加对照组相比，诱导原弹性蛋白合成的倍数增加，并且差异可能归因于2D和3D培养中SMC表型的转换。
本研究中HA-o和TGF-β1似乎对原弹性蛋白交联和基质沉积过程的影响比原弹性蛋白合成本身的影响更大；弹性基质沉积的增强似乎是这些因素的主要作用，尽管缺乏关于这些因素弹性诱导细胞的确切机制的信息，这目前仍是一个未经证实的观察结果。如中所示在两种HA-o剂量（即0.2和2μg/mL）下，弹性基质沉积表现出典型的双相TGF-β1剂量反应，最低测试TGF-。我们的结果还表明，在较高剂量下，HA-o降低了对TGF-β1的双相弹性基质合成反应；尤其是在较高的TGF-β1剂量（即1和10 ng/mL）下，增加HA-o剂量导致弹性基质沉积显著增加。基质弹性蛋白的增加主要与交联度较低的碱溶性组分的沉积增强有关。
在大多数情况下，我们发现与对照组相比，LOX酶的合成显著增强，据信LOX酶在将原弹性蛋白交联为成熟弹性基质中起着核心作用。这与我们之前发表的研究结果一致7,33其中，我们显示HA-o/TGF-β1可增强弹性蛋白交联酶的mRNA表达、蛋白质合成和活性。然而，在用0.2μg/mL HA-o和10 ng/mL TGF-β1处理的细胞培养物中观察到LOX合成的最显著增加（参见). 同样，在比较碱不溶性（即高度交联）基质弹性蛋白的数量与碱溶性部分的数量之比时（参见)我们发现，对于所有病例，尤其是低剂量因子处理的培养物，比率远小于1，但在LOX合成最显著增强的单一病例中，比率大于1（即0.2μg/mL HA-o和10 ng/mL TGF-β1）。因此，我们假设LOX蛋白数量的增加有助于弹性基质更有效地交联为碱不溶形式。
一个非常有趣的观察结果是，对照胶原蛋白构建物中的基质产率（即交联成基质的总弹性蛋白输出的质量%）比我们在非胶原蛋白基质上的2D培养中观察到的相同细胞类型的基质产率低得多（～0.2%）（10%-15%）。虽然我们已经表明，在TGF-β1和HA-o因子的存在下，基质产率增加了数倍，但在最低测试剂量下最显著，产率仍然<1%。我们将在未来的研究中确认，沉积的弹性基质水平低的一个可能原因可能是SMC过度生产GAG，如硫酸软骨素，正如黄的研究所示等.34和Allison等.35显示，抑制弹性蛋白的合成和组装，并显示与胶原基质沉积增加相关。无论如何，尽管在HA-o和TGF-β的存在下可能存在LOX介导的原弹性蛋白交联，但本研究中获得的低弹性基质产率表明，在增强更牢固交联的沉积方面，还有改进的余地，因此，更稳定的碱不溶性弹性基质部分。
在增强三维胶原结构中的弹性蛋白基质的情况下，导致临床上足够的可植入组织的组织工程，因此可能需要以更高的细胞密度植入支架，以克服每个细胞获得的基质产量低的问题（即使是在弹性诱导的情况下）或者可替代地共递送弹性蛋白交联促进因子（例如LOX或LOX活性增强铜纳米颗粒），我们已经证明这对该目的非常有用。36,37
MMPs-2和-9代表一类锌2+-对基质蛋白，特别是弹性蛋白进行蛋白质水解的依赖性明胶酶。38由于完整的弹性纤维是组织新的弹性基体结构的成核点，并且弹性基体的净积累取决于相对于其再生的基体降解程度大大减弱，因此需要尽量减少基质金属蛋白酶的产生/活性。39在这种情况下，我们的研究表明，TGF-β1和HA-o的最低但最具弹性的剂量组合显著减弱了基质金属蛋白酶9的合成，但增强了SMC产生基质金属蛋白酶2。在提供的最高剂量下，也被认为是弹性生成的，但较少，MMP-9的生成可以忽略不计，MMP-2水平与未经治疗的对照组相似。同样，在最低TGF-β1和HA-o剂量组合下，MMP-2蛋白的活性形式增强，而在较高剂量下则不受影响。然而，在最低测试TGF-β1和HA-o剂量下，上述MMP-2蛋白合成量（酶原和活性形式）的增加在绝对值上是否足以破坏基质，尚不确定；如果是这样，提供抑制MMP的培养条件，或者提供更高的非MMP增强因子剂量，可能是一种理想的方法。
在静态负载胶原凝胶中培养SMC的另一个有利观察结果是合成弹性纤维中的高度对齐，如尽管不论培养条件如何，排列程度或多或少是一致的，但与非添加性对照培养物相比，所有接受弹性因子的培养物（TGF-β1的浓度为1 ng/mL，HA-o的浓度为2μg/mL的培养物除外）都含有大量的排列纤维().
当TGF-β1过度表达时，尤其是持续表达时，可以诱导SMC呈现更多成骨表型，并增强基质钙化。15然而，我们的研究没有发现任何钙化，即使在最高剂量为10 ng/mL TGF-β1的培养物中也没有发现钙化。
结论
本研究证明了在静态加载的胶原凝胶构建体的非弹性3D构建体中，HA-o和TGF-β1因子对RASMC的弹性诱导作用。虽然与在胶原蛋白凝胶中对SMC进行的其他研究相比，为了增强原弹性蛋白和基质合成，需要比早期2D培养研究中显示的有用剂量更高的剂量组合，但我们已经证明，在存在这些因素的情况下，可以合成大量基质弹性蛋白。组织工程为满足人类使用需求而构建的弹性蛋白的最佳含量，是我们获得最佳弹性蛋白的能力面临的一个主要挑战，即弹性基质的产率相当低（<1%），需要解决。利用上述因素共同传递弹性蛋白交联LOX或铜纳米粒子的研究将解决这一不足。这些结果对于解决血管组织工程中一个普遍缺失的基本方面最为有用，即恢复完整、成熟和可行的弹性基质。
致谢
作者感谢南卡罗来纳医科大学的Aimee Phelps女士在组织学处理方面的帮助。这项工作得到了NIH授予Ramamurthi，A.的资金支持（5RO1HL092051-02，RO1HL20092051-01S）。
工具书类
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