引言
为了进入宿主细胞，大多数动物病毒利用细胞的内吞机制。在摄取后，病毒或其衣壳通常从早期或晚期内体（EE或LE）进入胞浆。由于内吞作用和内体成熟是一种复杂且受严格调控的活动，因此成功进入和感染依赖于许多细胞因子和过程。最近的高通量siRNA筛选清楚地说明了这一点，该筛选已识别出数百种不同病毒感染所需的宿主细胞基因[1],[2]我们研究的起点是对A549细胞中的流感a X31株（a/Aichi/2/68）（H3N2）进行7000个药物基因组RNAi筛选，表明组蛋白脱乙酰酶（HDAC）是早期感染的调节剂。
IAV是一种具有分段负义RNA基因组的包膜动物病毒。点突变、重组和种间传播导致人类、鸟类和动物的反复流行和全球流行病[3]在细胞水平上，病毒首先与细胞表面糖蛋白和脂质上的唾液酸残基结合，然后通过网格蛋白介导的内吞作用或非网格蛋白依赖的大胞吞作用样的吸收过程内化[4],[5],[6],[7].病毒颗粒被输送到内体系统。血凝素（HA）糖蛋白是一种酸激活的膜融合因子，它介导基因组进入细胞液[8]HA激活的低pH阈值（pH5.4-4.9）表明，通过膜融合渗透发生在LEs或内溶酶体中，通常位于细胞的核周区域[9],[10]穿透后，基质蛋白（M1）解离，病毒核糖核蛋白（vRNP）通过核孔复合体进入细胞核，在那里进行复制和转录[11],[12].
中心体是动物细胞的主要微管组织中心。中心体结合100多种调节蛋白，其身份表明其在多种细胞功能中发挥作用[13]中心体通过成核和锚定微管（MT）影响大多数依赖于MT的过程，包括细胞器运输、细胞形状、极性、粘附、运动和分裂。在S期两个中心粒重复之后[14]，由此产生的两个中心粒加倍体继续作为单个MTOC发挥作用，直到它们在有丝分裂开始时分离。
乙酰化是一种可逆的翻译后修饰，可中和赖氨酸的正电荷，以多种方式改变蛋白质功能[15]通过组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）修饰组蛋白尾部，在基因表达的表观遗传调控中发挥中心作用[16]乙酰化蛋白通常是大分子复合物的亚单位，参与染色质重塑、细胞周期调节、剪接、核转运、MT稳定性和肌动蛋白成核等过程。通过蛋白质组学分析鉴定了1700多个底物蛋白，赖氨酸乙酰化的调节范围很广[17].
HDAC分为三个子类[18]在本研究中，我们重点关注I类HDAC（HDAC1、2、3、8）及其在感染中的作用。我们发现，其中一些病毒通过调节内吞作用、影响MT网络的特性以及影响内体的成熟来增加或减少IAV的生产进入。HDAC8通过促进LE/LY运动和中心体MT组织以及增加中心体凝聚力支持感染。相反，HDAC1降低中心体内聚力并抑制IAV感染。因此，这两种酶通过改变MT网络和中心体来控制内体功能，从而对IAV进入表现出相反的作用。
结果
需要HDAC8才能有效进入IAV
在高通量RNAi筛选中，HDAC8成为A549细胞中高效感染a型流感X31株（a/Aichi/2/68）（H3N2）所需的蛋白之一。这个屏幕的读数是新合成的病毒核蛋白（NP）的表达。为了验证这一发现并将其扩展到其他I类HDAC，我们采用了siRNA沉默方法，并测试了几种针对HDAC 1、2、3和8的寡核苷酸对IAV感染的影响。siRNAs的特异性和有效性在蛋白质水平上通过Western blotting和mRNA水平上通过实时PCR得到证实(图S1A和B). HDACs 1、3和8的蛋白质消耗效率分别为90%、80%和95%(图S1A). siRNAs的作用是特定的，因为它们每一个都只会导致预期HDAC的耗竭(图S1B).
用这些siRNAs转染72小时后，细胞感染流感病毒A X31株（A/Aichi/2/68）（H3N2），10小时后，通过免疫荧光染色对新合成的NP定量感染细胞的分数。为了进行成像，使用自动显微镜，以及使用我们实验室开发的算法通过MATLAB程序量化感染细胞的比例[19]为了检测感染细胞数量的增加和减少，对条件进行了调整，使20%的细胞感染了转染对照寡核苷酸（All*Neg）的细胞。
研究发现，消耗HDAC3和HDAC8可将IAV感染性分别降低至对照组的28%和36%，而消耗HDAC1可使感染性增加两倍以上(). 消耗HDAC2没有影响（未显示）。在缺乏负责内体酸化的vATPase亚单位（ATP6V1B2）和CAS（CSE1L）（流感病毒vRNP核输入所需的因子）的细胞中，感染几乎被完全抑制。在HeLa ATCC细胞中，HDAC1、3和8沉默对感染的影响与A549细胞相似(图S1D).
HDAC8是IAV X31感染、内吞作用和HA酸化所必需的。（A） IAV X31感染检测。在缺失HDAC1、3、8、vATPase亚单位ATP6V1B2和CAS（CSE1L）的A549细胞中定量感染72 h。细胞在TCID50=7.5×10时感染X31三/感染培养基（D-MEM，50 mM HEPES，pH 6.8，0.2%BSA）中的ml。固定后，细胞在渗透缓冲液（0.1%皂苷，PBS中1%BSA）中培养，并用单克隆抗体HB-65间接IFA染色NP。细胞核用Hoechst染色。通过自动显微镜获取图像，并使用基于MATLAB的感染评分程序（the MathWorks，Inc.）量化表达NP的细胞分数，并将其归一化为对照（All*Neg）细胞。20%的对照细胞在这些条件下被感染。（B–F）IAV X31进入分析。A549细胞缺乏HDAC1、3、8，以及ATP6V1B2或CAS（CSE1L）。在所有实验中，细胞首先与TCID50=2.4×10结合6/ml病毒在4°C下保存1小时。（B） 结合分析。结合后，清洗细胞并固定。结合在细胞表面的病毒颗粒用抗X31 Pinda抗体间接IFA染色。（C） 细胞内吞试验。结合后，清洗细胞并加热至37°C，30分钟后固定。用Pinda抗体阻断细胞外血凝素（HA）抗原后，用HA1特异性单克隆抗体间接IFA染色内吞病毒颗粒。为了阻止动态素依赖性内吞，在内吞试验之前和期间，用120µM动态素对细胞进行预处理。（D） HA酸化试验。结合后，将细胞清洗和/或加热至37°C，并在30、60、120、210和300分钟后固定。用抗A1单克隆抗体（一种识别HA酸诱导构象的单克隆抗体）间接IFA对酸化的HA进行染色。将巴非霉素A添加到对照细胞中以阻止内体酸化。（E） 计算5小时内HA的累积酸化，并将其归一化为对照细胞。（F） vRNP核导入分析。结合后，清洗细胞，在1 mM环己酰亚胺存在下加热至37°C，并固定5 h。传入NP（vRNP）用HB-65间接IFA染色。将巴非霉素A添加到对照细胞中以阻止内体酸化。（G） 酸介导的内吞旁路。细胞与TCID50=1×10结合6/ml病毒在4°C下培养1小时，清洗，然后在37°C的低pH介质（pH 5.0）中培养2.5分钟，以诱导病毒包膜和质膜融合，从而将vRNP直接释放到胞浆中。细胞在缓冲至pH 7.4且含有20 mM NH的培养基中再培养12 h4Cl阻止内体酸化。感染量按感染试验进行量化。所有数据均表示为平均值±SEM。
为了确定感染周期中的哪些步骤受到了影响，我们使用了一系列定量的、基于显微镜的分析，通过监测与质膜的结合、内吞作用的内化、HA转化为酸诱导构象、，以及将vRNP导入核心。中的结果研究表明，HDAC1耗竭导致的感染增加与病毒暴露于低pH值的效率加倍相关，这取决于HA向使用特定单克隆抗-HA抗体检测到的酸诱导构象的转化增加(). vRNPs向细胞核的输入相应增加了约1.3倍(). 由于病毒结合和内化未受影响()这表明经过酸化和生产性渗透的内吞病毒比例升高。
在缺乏HDAC8或HDAC3的细胞中，感染性的丧失被解释为对内吞和酸化的双重影响。摄取后30分钟测量时，IAV的内吞率分别降至48%和41%(). 与对照组相比，总酸化率分别降低到30%和17%，这意味着大约一半的内吞病毒经历了酸暴露(). 因此，vRNP的核进口也减少了(). 当动力蛋白抑制剂dynasole时[20]使用后，内化水平下降至29%(). 巴非霉素A（一种vATP酶抑制剂）几乎完全阻断了酸转化和核导入(). HA转化为酸诱导构象的动力学不受任何HDAC耗竭的影响。酸性HA在升温后1小时左右达到峰值，随后出现下降，这很可能是由于内溶酶体中HA的降解引起的。在HDAC8-和HDAC3-缺失细胞中，酸性HA的数量在所有时间点都保持较低水平().
分析表明，HDAC耗竭后流感感染性的下降涉及内吞途径的预穿透步骤。HDAC1和HDAC8通过诱导感染而无需病毒进行内吞作用而得到证实。这种旁路是通过向带有结合病毒的细胞中添加低pH介质来实现的，从而诱导病毒包膜直接与质膜融合[21]在缺乏HDAC1的细胞中，与对照细胞相比，感染性没有增加，并且在缺乏HDAC 8的细胞中也没有观察到感染性的丧失(). CAS耗尽的细胞作为穿透后的对照：这里的阻塞不能被绕过。我们得出结论，HDAC8和HDAC1的作用涉及内吞途径中的预穿透步骤。然而，HDAC3缺失细胞中的旁路仅部分恢复了感染性（对照组的55%），这意味着这种酶参与了穿透前和穿透后的步骤(). 我们没有进一步研究HDAC3。
综上所述，结果表明I类HDAC参与了内吞途径的调控，尤其是EEs到LYs的途径。HDAC的扰动对IAV进入的效率有重大影响。HDAC1耗竭后生产进入增强，HDAC8或HDAC3耗竭后抑制。在HDAC8-和HDAC3-缺失细胞中，病毒的内吞内化和酸转化效率低下，结果是很少vRNP到达细胞核。在HDAC1缺失的细胞中，初级内吞正常，但酸暴露、穿透和vRNP向细胞核的传递显著增强。
HDAC8缺失导致高尔基体和LE/LYs扩散
当我们用间接免疫荧光显微镜检查LE/LY标记LAMP1阳性细胞器在HDAC8缺失细胞中的分布时，我们观察到空泡主要分布在细胞质中，而不是主要聚集在近核区(). 高尔基复合体也被分散开来，它是用巨蛋白作为标记进行可视化的。相反，HDAC1缺失导致这些细胞器在核周区域聚集增加。一些液泡比对照组大。EEA1存在时确定的EE[22]HDAC1缺失的细胞比对照组大，但其细胞内分布正常（未显示）。
HDAC8缺失导致LE/Lys扩散。（A） 高尔基复合体（giantin，红色）和LE/LY（LAMP1，绿色）在对照（All*Neg）、HDAC8缺失（si HDAC8）和HDAC1缺失（si HDAC1）A549细胞中的定位。细胞被固定并通过间接IFA用抗giantin和抗LAMP1抗体染色。细胞核用DRAQ5染色。（B） LE/LY扩散指数的测定。A549细胞缺乏HDAC1、8、KIFC1、KIFC2和动力蛋白亚基ACTR10和DCTN2。细胞固定后用抗LAMP1抗体间接IFA染色。肌动蛋白用指骨肽染色，DNA用Hoechst染色。使用20倍物镜自动采集图像并进行分析，以得出LAMP1阳性内体的分散指数。对照（All*Neg）细胞的分散指数设置为零，用30µM诺可达唑处理1小时（All*Neg+nocode）的细胞的分散指数设置为1.0。数据表示为平均值±SEM，KIFC1、KIFC2、ACTR10除外，其中显示了4种不同siRNA的平均值（2个独立实验）。（C） EGF降解。A549细胞耗尽HDAC1，8在96周的基质板中，耗尽48小时后，在无血清培养基中饥饿24小时。EGF-AF647（200 ng/ml）在冰上结合30分钟。清洗后，将细胞在含血清的培养基中加热至37°C，以使EGF内化。在加温后15分钟和4小时，在酸性缓冲液（0.1 M甘氨酸，pH 3）中在冰上清洗细胞2分钟，以去除细胞外EGF，清洗并固定，并用Hoechst染色。使用10倍物镜自动成像EGF和细胞核。使用ImageJ量化EGF信号强度，并显示每个核在4小时（与15分钟相比）时EGF降解的百分比。通过Student t检验（*）评估统计显著性，p<0.05。数据表示为平均值±SEM。（D）转铁蛋白（TF）摄取。12孔板中的A549细胞缺乏HDAC1，8。在耗尽的第三天，细胞在无血清培养基中饥饿4小时，然后将TF-AF488（5µg/ml）结合在冰上30分钟。清洗后，将细胞在37°C下加热10 min，并在酸性缓冲液中在冰上清洗2 min，以去除细胞外TF。通过FACS分析每个细胞的TF信号，并将其归一化为对照（All*Neg）细胞。数据表示为平均值±SEM。
为了量化色散效应，我们使用中描述的算法导出了色散指数材料和方法诺卡唑处理的细胞中LAMP1阳性空泡的分散指数为1.0，未受干扰的细胞为零，HDAC8缺失的细胞的阳性指数为0.52(). 两种动力蛋白亚单位（ACTR10和DCTN2，是MT和动力蛋白依赖性小泡逆行运输所必需的）的耗竭[23]导致了与诺卡唑类似的分散表型。在耗尽KIFC1（0.89）和KIFC2（0.52）后，也观察到分散的小泡，这两个都是负向终末驱动蛋白马达[24]最后，HDAC1缺失的细胞的负指数（-0.33）与空泡的核周聚集增加一致。
为了确定这些影响是否是一般性的，是否影响内源性物质，我们检测了表皮生长因子（EGF）和转铁蛋白（TF）的去向，EGF通常被转运到LY并被降解，而TF则从EEs循环到质膜[25],[26],[27]我们观察到HDAC1缺失对两种配体均无影响。HDAC8缺失的细胞EGF降解部分减少（p=0.049，Student’s t检验），细胞内TF增加40%，表明内吞增加或再循环减少().
LE/LYs在HDAC8-缺失细胞中的扩散表型表明HDACs影响MT系统。因此，有兴趣确定MT的破坏和稳定是否会影响感染。诺卡唑对IAV内吞作用无影响，但HA酸化减少46%，感染减少约50%(). 紫杉醇没有效果。因此，通过分散内体，诺可唑对感染和酸化有类似于HDAC8耗竭的作用：它将内吞的IAV的感染力降低到一半。
有效感染IAV X31需要完整的MT。（A） 诺卡唑对IAV X31进入的影响。用30µM诺卡唑或dmso预处理A549细胞30分钟。在药物存在的情况下进行病毒内吞试验（摄取后30分钟）和HA酸化试验（1小时）。数据表示为平均值±SEM。（B）MT扰动物的冲刷分析。用30µM诺卡唑、50 nM紫杉醇或dmso预处理A549细胞30 min。细胞在4°C下与病毒结合30 min，在药物存在下洗涤并加热15、30、45 min和1、2、3、4 h，然后用缓冲至pH 7.4的含有20 mM NH的培养基替换培养基4Cl阻断内体酸化。在12 h时分析感染情况。数据显示为平均值±SEM。（C）IAV X31颗粒的实时成像。将WGA-AF647（5µg/ml）（以绿色假彩色显示）和R18标记的病毒（红色）与对照（All*Neg）、去HDAC8（si-HDAC8）A549细胞在4°C下结合30分钟。清洗后，加热细胞，3小时后用20倍物镜成像（另见视频S1). 单个和聚集的X31粒子显示为黑色圆圈。细胞边界和细胞核用虚线表示。（D） HA酸化发生在Rab7/LAMP1阳性的LE中。对照组（All*Neg），在耗尽后48小时，用表达Rab7-EGFP和LAMP1-mCherry的质粒转染HDAC8-缺失（si-HDAC8）A549细胞。质粒转染24小时后进行HA酸化试验。插图被放大并显示在右侧。蓝色（All*Neg）和黄色箭头（si HDAC8）表示LEs对酸化HA呈阳性。
当Alexa Fluor 647（AF647）标记的小麦胚芽凝集素（WGA）（一种与细胞表面唾液酸和糖蛋白结合的凝集素）被内吞并进入LEs时，视频显微镜也可以观察到活细胞内体行为的变化[28]视频清楚地显示，在HDAC8缺失的细胞中，WGA阳性小泡继续在细胞质中移动，而不是像在对照细胞中那样在核周区域积聚(视频S1). 当R18-标记的IAV颗粒与WGA-AF647共内化时，它们在摄取后很快与WGA在内体中共定位。在对照细胞中，含有病毒和WGA的空泡移到核周区，但仍在HDAC8-缺失细胞的外围分布().
可使用酸化HA抗体通过间接免疫荧光显微镜观察IAV酸化的内体室。在短暂过度表达EGFP-Rab7（LEs标记）和LAMP1-mCherry（LE/LYs标记）的细胞中，酸化HA信号主要在位于细胞核周区的Rab7/LAMP1阳性小泡中检测到。然而，在HDAC8-缺失的细胞中，酸化的HA存在于外周，Rab7/LAMP1阳性细胞器对应于LEs().
这些结果表明，LE/LYs的分布受HDAC的调节。HDAC8促进LE/LY向心运动和核周定位，HDAC1反对LE/LY在核周区的积聚。此外，液泡的有效酸化可能与它们在细胞质中的位置有关。
LE/LY运动需要HDAC8
为了更详细地分析内体运动的动力学，我们使用了Sbalzarini及其同事开发的粒子追踪ImageJ插件及其轨迹分割工具箱[29],[30]在内化2000帧后15至30分钟记录含EGF-AF488的小泡的运动(). 根据运动模式对轨迹进行分割和分类。对照细胞中MT-依赖性定向运动的频率为4.5%，HDAC8-缺失细胞中为1.06%。诺卡唑处理的细胞只有0.33%的定向运动。这三例患者发生定向运动时的速度相似，表明运动蛋白具有功能性(). 在对照细胞的定向运动中，10.6%的运动持续1.5秒以上，而在HDAC8-缺失细胞中，该值为3.67%(). 这意味着，要么是缺乏HDAC8的细胞中的马达过早脱落，要么是MT更短或缺乏稳定性。
LE/LY运动需要HDAC8。内吞EGF的颗粒追踪分析。（A） 对照组（All*Neg）、去HDAC8（si HDAC8）A549细胞和用30µm诺卡唑处理45分钟的细胞（All*Neg+nocod）出现依赖于MT的定向运动（DM）及其速度（µm/s）和（B）持续时间（sec）。（A） 在摄取EGF-AF594（1 ng/ml）后15–30分钟内，使用Visitech旋转圆盘共焦显微镜，使用100倍物镜（2000帧，Δt=30.53 msec）采集视频。成像前20 h用编码NES-2×EGFP的质粒转染细胞，以鉴定细胞质。提取EGF轨迹并将其分为MT依赖型DM（红色）和其他运动类型（蓝色），如面板A的插图所示。在All*Neg（n=6个视频）、HDAC8贫化（n＝8个视频）和诺可达唑处理（n＝8个视频）的样品。针对每种情况，共分析了30–50个细胞。
中心体凝聚力和MT组织需要HDAC8
抗微管蛋白抗体的免疫荧光染色显示，与诺卡唑治疗不同，HDAC8缺失并没有消除MT，而是导致MT系统的紊乱。MTs不是从MTOC放射出来的，而是随机定向的，在细胞质中相互交叉(). 在许多细胞中，细胞外围的MT网络密度高于细胞中心(图S2A).
中心体内聚和中心体MT成核/锚固需要HDAC8。（A） 对照组（All*Neg）、HDAC8-（si HDAC8）和去根素（si rootletin）A549细胞中α-微管蛋白（绿色）和γ-微管素（红色）的稳态定位。细胞在冷甲醇中固定，并用间接IFA染色。细胞核用DRAQ5染色。底部插图：箭头表示中心体。顶部插图：中心体MT锚固放大图。（B） （C）MT再生分析。对照组（All*Neg）、HDAC8-（si HDAC8）和去根素（si rootletin）A549细胞在冰上培养30分钟以解聚MT，在37°C下加热90秒以诱导重新聚合，并立即固定在冷甲醇中。使用两个针对编码序列（HDAC8）和5′UTR（HDAC8_5UTR）的寡核苷酸耗尽HDAC8。（B） MTplus-end结合蛋白1（EB1）用抗EB1抗体间接IFA染色，细胞核用DRAQ5染色。箭头表示MT asters。（C） 显示MT aster的细胞数量。数据表示为平均值±SEM。（D）MT锚定蛋白ninein在HDAC8缺失后仍留在中心体。对照组（All*Neg）和去HDAC8（si HDAC8）A549细胞在冷甲醇中固定，并用抗中心体标记物ninein和γ-微管蛋白抗体进行间接IFA染色。Ninin与母中心粒的亲和力较高，由箭头指示。（E） 对照组和HDAC8-缺失细胞中心体的激肽信号强度。通过ImageJ采集并分析共焦图像。
此外，MTOC也发生了巨大变化。用γ-微管蛋白抗体对中心体进行染色显示，MTOC中没有出现两个紧密配对的斑点，而是出现在相隔很远的类似斑点中，偶尔也出现在细胞核的对侧(). 在HDAC8缺失的细胞中，66.6%的细胞出现中心体分裂，而对照细胞中的中心体裂解率为13.6%（n=500）(). HDAC8缺失细胞中两个中心体之间的平均距离为5.43±1.30µm，而对照细胞中的平均距离是1.56±0.25µm（n=250）(). MT锚定在分裂中心体上也有缺陷；他们似乎完全脱节了(). 根据DNA的扩散染色和细胞形状判断，这些细胞处于间期，在此期间中心体不会正常分裂。再加上中心体的分裂，这可能解释了线粒体的总再分配和异常形态。
中心体分裂阻断IAV X31感染，并被HDAC1耗竭所抵消。（A） 中心体分裂本身阻断IAV X31感染。A549细胞去除HDAC8、rootletin、ATP6V1B2并感染10 h。数据表示为平均值±SEM。（B）中心体分裂定量。A549细胞去除HDAC1、8、rootletin、HDAC8/1和rootletin/HDAC1，用抗γ-微管蛋白抗体间接IFA固定和染色。通过ImageJ分析来自共聚焦z-stack图像的最大投影，并且将间隔大于2µm的中心体计算为分裂。数据表示为平均值±SEM。（C）中心体距离的量化。A549细胞缺乏HDAC1、8、rootletin、HDAC8/1和rootletin/HDAC1。如图B所示，使用ImageJ测量中心体距离。数据表示为平均值±SEM。（D）色氨酸A（TSA）可抵消HDAC8缺失引起的中心体分裂。去除HDAC8 60 h的A549细胞与dmso或5µM TSA孵育12 h，固定并分析中心体分裂，如上所述。对照细胞与dmso孵育12 h。数据表示为平均值±SEM。（E）HDAC1抵消HDAC8。用不同比例的siRNAs（HDAC1∶HDAC8=0∶20，10∶10，15∶5，17.5∶2.5，20∶0；总计20 nM），感染10 h。数据表示为平均值±SEM。（F）细胞周期分析。将A549细胞去除HDAC1、8并进行胰蛋白酶化，固定在冷EtOH中，用2.5µm DRAQ5染色，并用FACS分析。用FlowJo定量G1、S或G2/M期细胞的百分比。数据表示为平均值±SEM。
Tubulin乙酰化增加MT的稳定性[31]为了检测HDAC8缺失是否影响微管蛋白的稳定性，我们测定了对照组、HDAC1-、6-和8-缺失A549细胞中α-微管蛋白乙酰化水平(图S3). 微管蛋白脱乙酰酶HDAC6的耗尽[32]，微管蛋白乙酰化增加了60%，而HDAC8缺失使其减少到20%(图S3A、B). HDAC8在整个细胞内广泛分布(图S4).
当MTs在HDAC8缺失的细胞中低温解聚并在37°C下再生时，发现它们在细胞质中的随机位置聚合(). 因此，与83%的对照细胞相比，仅在11–29%的HDAC8缺失细胞中观察到再生90秒后形成MT aster(). MT核化可能受到ninein位移的影响，ninein是一种通常存在于两个中心粒中的蛋白质，与母中心粒具有较高的亲和力[33]Ninin定位于HDAC8-缺失细胞的中心体()与对照细胞相比，效率为92%().
感染晚期穿透病毒需要HDAC8和rootletin
中心体分裂是抑制IAV感染的根本原因吗？为了测试这种可能性，我们使用siRNAs耗尽细胞中的根素，根素是一种存在于中心粒相关纤维中的蛋白质，其耗尽会导致中心体分裂[34]在去根素细胞中，我们观察到75.3%的中心体分裂，而对照细胞为13.6%（n=500）(). 两个中心体之间的平均距离为4.27±0.37µm，而对照细胞为1.56±0.25µm（n=250）(). 与缺乏HDAC8的细胞相比，唯一的主要区别是，在缺乏根素的情况下，对MT组织的影响较小(,S2A公司). LE/LYs表现为中等分散型(图S2B). 再生90秒后MT星号的形成未受影响(). 换句话说，分裂的中心体显然能够与MT连接。
当检测去根素对IAV感染的影响时，我们发现感染率降低到对照组的20%(). 病毒内吞未受影响，但HA酸化降低至正常值的40%（未显示）。因此，通过一种独立的机制引起中心体分裂，有可能诱导与HDAC8缺失引起的感染相似但不相同的感染阻滞。很明显，通过诱导中心体分离，HDAC8或rootletin的缺失导致细胞MT系统发生变化，从而导致内体不完全成熟和IAV进入减少。
HDAC1缺失后观察到的结果似乎支持中心体结构与感染之间的相关性。HDAC1缺失使中心体分裂减少到9.3%，而对照细胞为13.6%（n=500）()将中心体之间的平均距离缩短至1.3±0.09µm（n=200）().
有趣的是，HDAC8缺失引起的中心体分裂可以通过HDAC1的共同缺失（n=200）降低到25.6%，细胞间距离可以降低到2.4±0.1µm(). 在单耗尽和共耗尽条件下，HDAC1和HDAC8的耗尽都足够(图S5). HDAC1与rootletin共完成也将中心体分裂从75.3%减少到44.7%，平均中心体距离仅为2.6µm（n=100）(). pan-HDAC抑制剂trychostin A（TSA）优先阻断HDAC1，但不影响HDAC8[35]在用5µM TSA处理12小时的HDAC8缺失细胞中，只有28%的细胞出现中心体分裂，而dmso处理的细胞只有65%(). 双转染实验进一步证实了HDAC8和HDAC1对中心体距离和感染具有相反的作用，同时沉默了这两个基因。当混合siRNAs时，根据所使用的siRNA的比例，观察到从抑制到激活的线性转换(). 最后，与对照细胞相比，HDAC1缺失使G1期细胞数量从57%增加到72%，而HDAC8缺失使G2/M期细胞数从18%增加到25%(). 因此，细胞周期中的特定阻滞不太可能是HDAC8-缺失细胞中MT紊乱的原因。
我们的结论是，HDAC缺失对IAV感染的影响与中心体的结构有关。当中心体分裂被诱导时，MT组织受到干扰，导致内胚体不能正确运输到核周区域。内切体酸化未被正确激活，病毒颗粒未能将其vRNP释放到胞浆中。相反，当平均中心体距离减小时，就像在缺乏HDAC1的细胞中一样，酸化和感染的效率增加。值得注意的是，感染与MT锚定中心体无关；虽然HDAC8-缺失细胞中分裂的中心体没有锚定，但去根素细胞中的中心体仍锚定在MT上(,S2A公司).
对其他病毒的影响
由于病毒使用不同的内吞策略和不同的途径进入细胞[36]测试HDAC8或HDAC1缺失是否影响其他病毒是很有意义的。我们检测了水泡性口炎病毒（VSV，一种弹状病毒）、Uukuniemi病毒（UUKV，一种布尼亚病毒）和痘苗病毒（VACV，一种痘病毒）的成熟病毒（MVs）。VSV通过氯氰菊酯介导的内吞作用进入细胞，病毒包膜与内膜融合的pH阈值为6.2[37],[38]UUKV使用与氯氰菊酯无关的机制进行感染进入，其膜融合阈值为pH 5.4[39]VACV MV通过大胞饮作用进入细胞[40].
除IAV外，HDAC1的耗尽对任何测试的病毒都没有影响。感染前用5µM TSA处理细胞4小时，结果相似(图S6). HDAC8缺失使IAV和UUKV感染率分别降至30%和52%(). VACV未受影响。VSV感染增加了48%，再次证实网格蛋白介导的摄取没有缺陷[37](). 与TF积累的增加一致，VSV感染的增加可能是由于LE成熟程序的扰动导致EE室的扩大。Rootletin缺乏可将UUKV感染降低至23%(图S7). 因此，HDAC8、rootletin和中心体的功能对于晚期穿透病毒的感染至关重要。
HDAC8是感染晚期穿透性病毒所必需的。A549细胞缺乏HDAC1、8，并感染了VSV（在pH 6.2的EE融合）、UUKV（在pH5.4的LE融合）、IAV（在PH5.1的LEs融合）和VACV MV（在大松果体融合）。通过针对病毒蛋白的间接IFA（针对VSV、UUKV、IAV）或通过EGFP表达（VACV）检测受感染的细胞。使用MATLAB程序算法量化感染细胞的百分比，并将其归一化为对照（All*Neg）细胞。对病毒数量进行了调整，使对照组中20%的细胞受到感染。数据表示为平均值±SEM。
讨论
我们研究中最重要的新见解是，HDAC8和HDAC1调节MT系统的特性和间期细胞中心体的结构，并影响LE和LY的运动、分布和成熟。一个后果是IAV和其他需要酸化至pH值约5.5或更低并从LEs渗透的晚期穿透病毒的感染性进入[41],[42],[43]，受I类HDAC表达的影响。HDAC1或8在调节间期细胞中MT细胞骨架和内体成熟中的作用以前没有描述过。
HDAC8和HDAC3的耗尽导致IAV感染减少。我们对两者进行了更广泛的分析，HDAC8定位于细胞核和细胞质(图S4). 虽然它在分子水平上有很好的特征，但其细胞功能仍然难以捉摸[44],[45],[46],[47]与其他I类HDAC不同，HDAC8不形成高分子量的多分子络合物[15]。我们发现HDAC8耗竭导致IAV进入两步减少。首先，与对照细胞相比，内吞内化减少到一半以下。其次，在内化的病毒中，只有一半被酸化，因此能够进行膜融合和渗透。因此，总感染率为对照组的15-30%。VSV感染和TF的内化没有受到抑制，排除了氯氰菊酯介导的内吞作用和细胞翻译机制的一般缺陷。由于IAV的内吞作用是通过两条平行的途径发生的，一条是网格蛋白介导的，另一条是最近描述的类似大胞饮作用的机制[7]，可能是后一种途径受到影响。I类HDAC与内体成熟之间的联系可能在细胞分化以及肿瘤发生过程中具有重要意义，这通常与HDAC活性升高有关。HDAC也可能影响流感和其他利用内吞作用进入的病毒的向性和发病机制。当HDAC抑制剂用于癌症治疗时，考虑流感病毒敏感性的变化将非常重要。
HDAC8缺失对IAV的第二个影响——pH值低于或等于5.1的暴露降低——发生在内吞途径的后期。EGF降解的减少表明货物没有以正常效率到达溶酶体隔间。在缺乏HDAC8的细胞中，内化病毒被捕获在Rab7/LAMP1阳性的液泡中，这些液泡不是沿着MT移动到MTOC，而是分散在细胞质中。粒子追踪显示，LEs和LYs的运动性较差，与MT的连接也不紧密，并且无法进行持续的定向运动。含有酸化病毒的少数液泡位于外围。
在正常细胞中，有组织的运动和酸化是复杂成熟程序的一部分，该程序为LEs与LYs融合做准备。成熟包括Rab GTPases的转换、磷脂酰肌醇的开关、酸化、腔内囊泡的形成、与动力蛋白和动力蛋白的结合以及MT介导的向核周区的转运[36],[48],[49]这些变化以复杂的方式协调和相互依存，因此当一个函数受到干扰时，整个程序可能会中断。因此，可能是由于LEs没有移动到MTOC，所以没有发生适当的酸化[50]当通过用诺可达唑破坏MT来抑制内体运动时，也产生了类似的情况；病毒酸化和内化病毒的生产性感染也减少了一半。内体的位置由许多因素决定，包括连接细胞骨架的连接蛋白、各种马达、细胞器的大小和形状等。[51]我们的数据表明，内体的性质受其位置的影响，因此，如果内体不能移动到细胞的核周区域，其成熟就没有完成。
HDAC8耗竭对MT系统有显著影响。它导致中心体分裂、微管蛋白乙酰化丢失和MT成核/锚定。与诺康唑处理相比，大多数MT仍然存在，但由于MTOC被破坏，它们被破坏。MTOC的破坏可能是微管蛋白乙酰化丢失的原因。MT从母体中心体的长期移位可能是中心体漂移的原因，这让人想起诺可唑治疗可能诱导的分裂[52]除了分裂和不能支持MT锚定外，中心体在HDAC8缺失后表现正常。γ-微管蛋白和ninein等重要因子也存在。
IAV感染和另一种晚期穿透病毒UUKV感染减少的根本原因很可能是中心体凝聚力的丧失。最好的证据是，通过一种独立的机制，即根素的耗竭，诱导中心体分裂，导致感染显著减少。根叶素耗竭诱导LE/LY中度扩散。与分裂中心体相比，近中心体可能提供更集中的MT网络。研究表明，中心体分开时放射出的MT较少[53].
HDAC1缺失的影响也支持中心体距离是IAV感染的重要因素。HDAC1是一种I类HDAC，几乎完全定位于细胞核，在细胞命运和细胞过程的表观遗传调控中具有重要功能[15]当HDAC1耗尽时，IAV的感染增加了一倍以上。分裂中心体百分比下降。TSA对HDAC1功能的抑制也增加了IAV感染。事实上，我们反复观察到，细胞群中心体之间的距离越短，感染水平越高。LEs、LYs和高尔基复合体紧密地捆绑在MTOC周围，HA的酸化效率是对照水平的两倍。
当HDAC8与HDAC1共耗尽时，中心体分裂受到抑制，这表明HDAC1可能在降低中心体内聚力方面起作用，HDAC8的作用可能是通过增强MT与中心体的结合来促进MT的组织。这些HDAC是否直接作用于中心体、MT或其他因素尚待证明。中心体结合的一个或多个调节因子可能被乙酰化，并用作脱乙酰酶的底物。C-Nap1是一种中心极连接蛋白，是一个有趣的候选蛋白，因为它被乙酰化了[17]，是一个众所周知的中心体内聚调节器[54]我们的结果表明，I类HDAC是MT组织、中心体结构和功能以及IAV入口的重要调节器。
材料和方法
细胞和病毒
A549 ATCC和HeLa ATCC细胞根据ATCC指南进行增殖。纯化流感A X31株（A/Aichi/2/68）（H3N2）购自美国加利福尼亚州的Virapur。如前所述，使用了UUKV S23、VSV（wtVSV）（印第安纳血清型）和VACV WR-GFP[37],[40],[55].
病毒制剂
纯化流感A X31株（A/Aichi/2/68）（H3N2）购自美国加利福尼亚州的Virapur。简单地说，将60个无致病性的鸡蛋接种该病毒，并在33–37°C下孵育2天。采集的尿囊液通过低速离心澄清，并通过高速离心浓缩。通过两轮10–40%蔗糖梯度离心进一步浓缩病毒。收获病毒带，合并并重悬于制剂缓冲液（40%蔗糖，0.02%BSA，20mM HEPES pH 7.4，100mM NaCl，2mM MgCl2)，冷冻并在−80°C下储存，直至使用（MDCK细胞中的TCID50=3.0×108/ml病毒）。
siRNA转染
用siRNAs（QIAGEN）在96 well平底基质板（Thermo Scientific）中反向转染细胞（最终10 nM）。将siRNAs与Lipofectamine RNAiMax（Invitrogen）在30µl OPTI-MEM（Invit罗gen）中混合30分钟。将细胞胰蛋白酶化、计数并直接涂布在70µl生长培养基中的脂质体混合物上。
IAV X31感染检测
96周基质板中的A549细胞感染TCID50=7500/ml病毒在感染培养基（D-MEM，50mM HEPES pH 6.8，0.2%BSA）中，在PBS中4%甲醛（FA）中固定10小时。细胞在透化缓冲液（0.1%皂苷，1%BSA在PBS中）中透化，并用单克隆抗体HB-65（ATCC）（1∶10稀释）间接免疫荧光染色病毒NP二级抗鼠抗体标记Alexa Fluor 488（AF488）。细胞核用Hoechst（1∶10000稀释）染色。通常，每个孔自动采集9（3×3）或16（4×4）个图像（见显微镜）。使用基于MATLAB的感染评分程序（The MathWorks，Inc.）确定每个微孔的细胞数和原始感染指数。用这种方法，表达NP的细胞被计数为感染细胞。转染All*Neg siRNA的对照细胞感染率为15-20%。
IAV X31进入分析
我们实验室开发了用于逐步分离IAV X31菌株进入途径的基于显微镜的分析。这些测定使用间接免疫荧光进行检测，并优化为96孔格式的高通量分析（Banerjee I.、Horvath P.和Helenius a.，正在准备的手稿。用于定量的程序可在www.highcontentanalysis.org). 在这里，我们使用共焦和自动荧光显微镜来获取图像，并使用ImageJ量化结果。
X31病毒与细胞表面结合
A549细胞与TCID50=2.4×10结合6/ml病毒在4°C下1小时，在PBS中洗涤三次，在PBS-4%FA中固定20分钟，在封闭缓冲液中封闭（PBS-1%BSA），用抗X31 Pinda抗体进行间接免疫荧光处理[56]（1∶2000稀释）、卵磷脂-Alexa Fluor 594（AF594）和DRAQ5（Biostatus Limited）染色细胞核。使用40倍物镜通过共焦免疫荧光显微镜获得图像，并使用ImageJ进行量化。首先，为每个实验确定Pinda信号的阈值，以消除背景荧光。计算出超过该阈值的荧光信号所覆盖的面积。其次，用指骨蛋白染色法测定细胞面积。最后，对每个siRNA处理的每个细胞面积的总Pinda信号进行量化，并将其归一化为对照（All*Neg）细胞。
X31病毒内吞
A549细胞与TCID50=2.4×10结合6/ml病毒在4°C下放置1 h，在感染培养基（D-MEM，50 mM HEPES pH 6.8，0.2%BSA）中洗涤两次，并加热至37°C以允许病毒吸收。30分钟后，将细胞固定在4%的FA中20分钟。封闭后，用Pinda抗体（1∶500）在4°C下隔夜封闭细胞外HA抗原，然后再次固定在PBS中的4%FA中20min。然后将细胞渗透（0.1%皂苷，PBS中1%BSA），并与X31 HA1特异性单克隆抗体孵育[57]（1∶100）室温下放置2h。HA1由AF488标记，Pinda由AF594标记的二级抗体，肌动蛋白和卵磷脂-AF647显示。这种方法能够区分细胞外病毒颗粒和内化颗粒。通过共焦显微镜获得图像，每个细胞面积的总HA1信号按照病毒结合试验进行量化和标准化。
为了阻断动力蛋白依赖性内吞作用，将对照（All*Neg）细胞在dmso或120µM dynasol中预处理30分钟，然后在药物存在下结合和摄取病毒30分钟。如上所述对细胞进行固定、染色和分析。
X31 HA酸化
A549细胞与TCID50=2.4×10结合6/ml病毒在4°C下放置1 h，在感染培养基中洗涤两次，并在1 mM环己酰亚胺存在下加热至37°C，以阻止新的蛋白质合成。对于时间过程实验，细胞在PBS中清洗并固定在PBS的4%FA中。对于单时间点分析，细胞在1 h时清洗并固定，此时酸化信号达到峰值。为了检测经历了酸诱导构象变化的HA，细胞被阻断、渗透并与抗A1单克隆抗体孵育[58]（1∶2000）室温下放置2h。用AF488标记的二级抗体观察酸化HA，用DRAQ5染色细胞核。通过共聚焦显微镜或自动显微镜获取图像，并如上所述对每个细胞核的总信号进行量化。5小时（t）内累计A1信号0====================================================================0，吨1====================================================================30吨2====================================================================60吨三====================================================================120吨4====================================================================210吨5====================================================================300 min），根据方程式{（t1）（y1）+（y1+y2）（t2t1）+…+（y4+y5）（t5−t4）}×0.5计算曲线下面积。
X31 vRNP核进口
按照HA酸化试验进行病毒结合和摄取，并在升温后5 h清洗细胞并固定。在内化后2.5小时，重新更换含有1 mM环己酰亚胺的培养基。将细胞固定在PBS中的4%FA中，在室温下用HB-65单克隆抗体（1∶10）封闭、渗透并染色病毒NP。用AF488标记的二级抗体观察NP（传入的vRNP），用DRAQ5染色细胞核。通过共焦显微镜获得图像，计算带有核NP信号的细胞百分比，并将其归一化为对照（All*Neg）细胞。
X31内吞的酸介导旁路
A549细胞与TCID50=1×10结合6/ml病毒在4°C下保存30分钟，并在感染培养基中清洗三次。允许病毒在低pH值介质（pH 5.0）中在水浴中加热至37°C的定制金属板上融合2.5分钟。培养后，将细胞放在冰上，清洗三次，然后在37°C的Stop培养基中培养（D-MEM，50 mM HEPES，pH 7.4，20 mM NH4Cl）阻止内体酸化。在12 h时清洗并固定细胞，使其渗透，并用HB-65染色以检测NP。感染细胞的分数按照感染试验进行量化。
药物洗脱试验
用30µM诺卡唑、50 nM紫杉醇或dmso单独处理生长在96 well基质板中的细胞30分钟，然后结合TCID50=6×105/ml病毒在冰上放置30分钟。清洗细胞以去除未结合病毒，并在药物存在下加热至37°C。在给定的时间点，含有药物的培养基被清洗掉，并替换为Stop培养基（D-MEM，50 mM HEPES，pH 7.4，20 mM NH4Cl）阻止内体酸化。12小时后固定细胞，并按照感染试验进行分析。
HDAC抑制剂处理
将细胞与dmso或5µM trychostatin A（TSA）在正常生长培养基中孵育4 h。在感染培养基中洗涤三次，然后进行感染检测，以去除药物。
X31病毒颗粒的标记
如前所述进行R18标记[59]X31病毒库存稀释至TCID50=1.5×107/ml，置于PBS中，在室温下用20µM R18（Invitrogen）在黑暗中孵育1小时，并持续摇晃。通过0.2µm过滤器过滤混合物以去除聚集染料。
显微镜
使用蔡司LSM 510 Meta系统装置进行共焦荧光显微镜检查。在室温下，将细胞在PBS中的4%FA中固定20分钟，在−20°C甲醇中固定5分钟。对于间接免疫荧光，细胞被封闭在封闭缓冲液中（PBS中的1%BSA），并在渗透缓冲液中渗透（0.1%皂苷，PBS中1%BSA。使用蔡司LSM 510或Visitech Spinning Disk共焦显微镜，使用8孔室载玻片（Nunc）进行实时成像。成像时，使用无酚红D-MEM（Invitrogen）。使用ImageJ或LSM图像浏览器进行图像分析。使用BD Pathway 855生物成像仪（BD Biosciences）或MD Assay Development 2（Molecular Devices），使用10×或20×物镜对96 well Matrix板进行自动图像采集。
LE/LY扩散指数的测定
将接种在96周基质板中的A549细胞在去除宿主细胞因子72小时后固定，并在PBS中的4%FA中固定20分钟。阻断和渗透后，对细胞进行LAMP1、肌动蛋白（指骨样蛋白-AF594）和DNA（Hoechst）染色。使用20倍物镜为所有三个通道自动采集每孔16张图像（4×4）。首先，使用CellProfiler程序对图像进行分割以识别单个细胞并确定其表型属性[60]带有自定义修改。其次，使用监督机器学习自动分类细胞表型，并应用回归模型自动预测表型的散射指数。最后，确定不同siRNAs或药物的作用。对于对照（All*Neg）细胞，LAMP1阳性囊泡的散射指数设置为零，对于用30µM诺卡唑处理1小时的对照细胞，设置为1.0。除了前面描述的细胞类型外，使用高级细胞分类器程序进行多参数非线性分析，区分有丝分裂细胞和分割错误(网址：www.cellclassider.org). 对于监督机器学习，使用了神经网络、支持向量机和逻辑分类器相结合的混合模型。
视频和轨迹分析
将EGF-AF555（1 ng/ml）添加到对照（All*Neg）A549细胞、去HDAC8（siHDAC8）或用30µM诺卡唑处理45分钟的对照细胞（All*Neg+nocod）。使用Visitech旋转圆盘共焦显微镜，使用100×1.4NA Oil DIC Plan-Apochromat物镜，在加入EGF后的15–30分钟内对内吞EGF进行实时成像。为了检测细胞边界和细胞核，细胞在15 h前瞬时转染NES-2×EGFP。对于单个视频，采集了一个z切片的2000帧（Δt=30.53 msec）。使用粒子追踪算法的ImageJ实现从录制的视频中提取细胞内EGF轨迹[30]具有半径====================================================================3像素，截止====================================================================0,百分位数====================================================================0.2,最大位移（_D）====================================================================10像素，以及链接范围====================================================================1.仅保留超过50帧的轨迹进行分析。如前所述，使用MATLAB轨迹分割工具箱在轨迹中识别的定向运动段[29]定向运动的速度是通过将它们的总长度（属于相同定向运动的所有轨迹段的长度之和）除以它们的持续时间来计算的。由于图像中的噪声，这相当于高估了真实的运动速度。所有后处理都是在MATLAB R2010b（The MathWorks，Inc.）中完成的。
定量实时PCR
使用LightCycler 480 SYBR green I Master Mix（Roche）和RotorGeneQ热循环器（QIAGEN）进行SYBR绿色定量实时PCR（qRT-PCR）。对照样品cDNA的连续稀释液也提交至实时PCR，以生成标准曲线，以计算引物的效率。样本分为三份，而由于cDNA合成步骤中缺乏逆转录酶（-RT），不含cDNA的–RT样本分为两份。添加了非模板控制，以确保PCR试剂无污染。阈值周期由转子基因Q系列软件指定。使用Pfaffl方法对结果进行量化[61]靶基因的mRNA数量是相对于Ct吨-对照样品的值，并归一化为参考基因（GAPDH）。
使用了以下引物；GAPDH（前，CTGTTGCTGTAGCCAATTCGT公司; 转速ACCCACTCCCACCTTTTGA公司)，HDAC1（前，国家统计局; 版次，AACAGGCCATCGAATACTGG公司)，HDAC3（前，ACGTGGGCAACTTCCACTAC公司; 版次，GACTCTTGGTGAAGCCTTGC公司)，HDAC8（前，GGTGACGTGTCTGTGG; 版次，AGCTCCAGCTAGATAGACCA公司).
EGF降解
A549细胞在96周的基质板中耗尽HDAC，耗尽48小时后在无血清培养基中饥饿24小时。EGF-AF647（200 ng/ml）在冰上结合30分钟。清洗后，在37°C的含血清培养基中加热细胞，使其内化。在升温后15分钟和4小时，在酸性缓冲液（0.1 M甘氨酸，pH 3）中在冰上清洗细胞2分钟，以去除非内部化EGF，清洗并固定在PBS中的4%FA中，然后进行Hoechst染色。使用BD Pathway 855生物成像仪使用10倍物镜对EGF和细胞核进行成像。使用ImageJ量化背景以上EGF信号的强度，并计算4小时（与15分钟相比）每个核的EGF降解百分比。
转铁蛋白摄取
1×105A549细胞接种在12孔板中，去除HDAC1或8。在耗尽的第三天，细胞在无血清培养基中饥饿4小时，然后在冰上结合转铁蛋白-AF488（5µg/ml）30分钟。将细胞加热至37°C后零度和10分钟，在酸性缓冲液中冰上清洗2分钟。通过FACS分析分析每个细胞的转铁蛋白信号。简言之，用PBS洗涤细胞，每孔用200µl胰蛋白酶分离，并收集在1 ml PBS中。将细胞在4°C下以1500rpm离心5分钟以去除胰蛋白酶，然后重新悬浮并固定在PBS中的200µl 4%FA中20分钟。离心去除FA后，将细胞重新悬浮在300µl FACS缓冲液中，用BD-FACSCalibur流式细胞仪进行分析。
细胞周期分析
24孔板中的A549细胞去除HDAC1，8 72 h。细胞在PBS中洗涤，胰酶化，并在4°C的冷EtOH中固定30 min。在4°C下以1500 rpm离心细胞5 min后，去除上清液，并用FACS缓冲液（PBS、5 mM EDTA、2%FCS、0.02%NaN）对细胞进行染色三)在室温下，含2.5µM DRAQ5 15分钟。通过离心清洗细胞，将其重新悬浮在250µl FACS缓冲液中，以使用BD FACSCanto II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo进行细胞周期分析。
MT再生试验
将生长在24孔板上的A549细胞置于定制切割金属板上，在冰上培养30分钟，以解聚MT。通过在37°C培养基中培养，MT重新聚合90秒。将细胞立即固定在冷甲醇中5分钟。用抗α-微管蛋白或抗EB1（微管加酶结合蛋白1）抗体间接免疫荧光法检测细胞的MT asters。
中心体分裂分析
A549细胞在冷甲醇中固定5min，用间接免疫荧光法和DRAQ5法对其进行γ-微管蛋白染色。共聚焦z轴叠加图像是用40倍物镜采集的。使用ImageJ在最大投影上测量γ-微管蛋白病灶之间的距离。当距离大于2µm时，中心体被视为分裂[52].
强度测量
使用ImageJ从共焦图像测量中心体ninein的信号强度。中心体也通过与γ-微管蛋白结合进行鉴定。
质粒
EGFP-Rab7和LAMP1-EGFP的结构由J.Gruenberg（瑞士日内瓦大学）提供，NES-2×EGFP由U.Greber（瑞士苏黎世大学）提供[62]HDAC8-Flag作者Ed Seto（H.Lee Moffitt癌症中心和研究所，美国坦帕）。通过切除带有AgeI/BsrGI位点的LAMP1-EGFP质粒的EGFP cds并用mCherry替换它，构建了LAMP1-mCherry-质粒。
抗体、化学品和试剂
HB-65从ATCC购买。购买了以下抗体：HDAC1、HDAC2、HDAC3（从BioVision获得）、HDAC8、LAMP-1、C-Nap1、EB1（Santa Cruz）、giantin（Covance）、EEA1（Cell Signaling）、γ-tubulin、Flag M2（Sigma）、乙酰化α-tubulin/α-tubulein、ninein（Abcam）。在dmso（Calbiochem）中制备诺可唑、紫杉醇、达纳司特、曲克司他丁A（从Sigma获得）、巴非霉素A（Calbiochem）的库存，并将其储存在−20°C下。DRAQ5购自Biostatus Limited。从Invitrogen中获得了Hoechst、R18、AF标记的EGF、TF、WGA和二级抗体。
文本中提及的基因和蛋白质的登录号（NCBI Entrez基因ID号）
ATP6V1B2型(526);C-Nap1号机组(11190);欧洲经济区1(8411);吉安丁(2804);HDAC1型(3065);巴格达2（3066）；HDAC3型(8841);HDAC6型(10013);HDAC8型(55869);灯1(3916);尼奈因(51199);拉布7(7879);根叶素（9696）；α微管蛋白(7846);γ-微管蛋白(7283).
支持信息
图S1
HDAC缺失的效率及其对IAV X31感染的影响。（A） 在A549细胞中转染siRNAs（HDAC1_6、HDAC1_ 1、HDAC2_ 3、HDAC3_ 1、HDAC 3_ 2、HDAC_3_4、HDAC8_ 2和HDAC8_4）72小时后HDAC耗竭的效率。蛋白质水平归一化为α-微管蛋白，并使用ImageJ进行量化。（B） I类HDAC的特定损耗。用siRNAs HDAC1_6、HDAC3_4、HDAC8_2去除HDAC1、3和8后，对其mRNA水平进行量化。这3个siRNA被用于进一步的实验。数据表示为平均值±SEM。（C）（D）消耗I类HDAC、vATPase亚单位ATP6V1B2对A549（C）和HeLa ATCC（D）细胞X31感染的影响。数据表示为平均值±SEM。
（畅通节能法）
图S2
HDAC8和根系素缺失后的MT定位和高尔基体定位。（A） 对照组（All*Neg）、去HDAC8-decreated（si HDAC8）、去根素（si rootletin）A549细胞和用30µM诺卡唑处理30分钟的对照组细胞（All*Neg+nocodazole）在冷甲醇中固定5分钟。用IFA对细胞进行α-微管蛋白染色，用DRAQ5对细胞核进行染色。采集并最大限度地投影共焦z轴叠加图像。箭头表示MTOC。（B） 对照组（All*Neg）、去根素（si rootletin）、去HDAC8（si HDAC8）A549细胞在冷甲醇中固定5分钟，并用IFA用抗LAMP1抗体染色。采集并最大限度地投影共焦z轴叠加图像。
（畅通节能法）
图S3
HDAC8-缺失细胞中的管蛋白乙酰化减少。（A） 将A549细胞中的HDAC1、6和8去除72小时。将细胞裂解液进行Western印迹，并检测乙酰化α-微管蛋白和α-微管蛋白。使用ImageJ将乙酰化α-微管蛋白水平归一化为α-微管蛋白。（B） 对照组（All*Neg）和去HDAC8-decreated（si-HDAC8）A549细胞在冷甲醇中固定5分钟，并用抗乙酰化α-微管蛋白和抗α-微管蛋白抗体进行IFA染色。获取并最大限度地投影共聚焦z堆栈图像。箭头表示MTOC。
（畅通节能法）
图S4
HDAC8本地化。用编码HDAC8-Flag的质粒转染A549细胞。20 h后固定细胞，用抗HDAC8（绿色）和抗Flag M2（红色）抗体间接IFA染色。获得并最大限度地投影共焦z堆栈。
（畅通节能法）
图S5
HDAC1，8的共完成是有效的。A549细胞去除HDAC1、8和HDAC1/8，进行Western blotting并检测HDAC1，8和α-微管蛋白。使用ImageJ将HDAC1和HDAC8蛋白水平标准化为α-微管蛋白。
（畅通节能法）
图S6
胰蛋白酶A特异性增加IAV X31感染。（A） 用dmso或5µM TSA处理A549细胞4 h，然后进行X31感染检测。感染期间没有药物。数据表示为平均值±SEM。（B）用dmso或5µM TSA处理A549细胞4小时，然后用VSV、UUKV或X31进行感染检测。数据表示为平均值±SEM。
（畅通节能法）
图S7
UUKV感染需要Rootletin。A549细胞去除根素ATP6V1B2，然后进行UUKV感染检测。数据表示为平均值±SEM。
（畅通节能法）
视频S1
HDAC8促进内含内化WGA的内体向心运动。用含有WGA-AF647（5µg/ml）的成像介质培养生长在96周基质板中的对照（All*Neg）和去HDAC8（si HDAC8）A549细胞。添加WGA（t=0）后，使用MD Assay Development 2显微镜，每隔15分钟至6小时，使用20倍物镜获取延时图像。视频以每秒15帧的速度播放。
（移动电话）
